检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用

摘要

本发明涉及检测抗Talin‑1‑IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用，属于诊断试剂盒技术领域。本发明提供了检测抗Talin‑1‑IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。抗Talin‑1‑IgG自身抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及诊断试剂盒技术领域，具体涉及检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。

背景技术

微小病变病(MCD)是儿童肾病综合征的主要原因，占成人肾病综合征的10～15％。微小病变病患者肾小球在光学显微镜下看起来基本正常，在电子显微镜下可见的唯一组织病理学异常是弥漫性足细胞足突融合消失。因此，MCD被认为是一种原发性足细胞疾病。皮质类固醇治疗后蛋白尿完全缓解是MCD的标志，一般而言进行性肾功能衰竭很少见。然而，MCD会导致严重的并发症。在成人中观察到的与疾病相关的并发症主要包括静脉血栓形成和需要临时透析的严重急性肾损伤。此外，由于MCD的特点是慢性、复发性病程，因此通常需要延长免疫抑制治疗以维持蛋白尿缓解。然而，长期免疫抑制治疗会增加严重感染的风险，并带来恶性肿瘤的长期风险。

目前，我们对MCD的潜在发病机制仍然知之甚少。其中一个观点认为是由免疫细胞产生的循环通透性因子引发了该病。由于原发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的发病机制与MCD非常相似，因此许多学者认为MCD 和FSGS是同一个疾病在不同阶段的表型。基于MCD与非霍奇金淋巴瘤之间的关联、麻疹感染诱导的缓解以及环磷酰胺治疗后的延长缓解，T细胞最早被怀疑是循环通透性因子的来源。然而，近些年利妥昔单抗和其他特异性 B细胞消除药物的治疗效果对T细胞来源提出了挑战。值得注意的是，皮质类固醇和利妥昔单抗对足细胞的直接作用也被认为具有治疗效果。我们团队在MCD和FSGS肾病综合征患者体内筛选和鉴定到了许多足细胞自身抗体，从而提供了足细胞损伤、自身免疫和蛋白尿对抗B细胞治疗的反应之间的潜在联系，并据此在国际上首次提出了“自身免疫性足细胞病”(Autoimmune podocytopathies)的概念，并逐步得到了国内外同行的认可。最近，哈佛医学院团队Watts等人发现，儿童及成人微小病变肾病综合征患者血清中还存在抗Nephrin自身抗体，这为我们的创新理论提供了有力佐证。

尽管观察到的足细胞损伤是MCD的主要经典特征，但疾病机制可能还涉及肾小球血管内皮细胞。早在2000年FutrakulN等报道特发性肾病综合征(INS)病人常伴有肾脏灌流不足。他们使用人内皮细胞株ECV 304，与 INS病人血清共孵育，进行内皮细胞毒性试验，结果发现，FSGS病人血清造成的内皮细胞损伤最明显。因此，他们推测肾小球血管内皮细胞损伤可能是造成INS病人肾脏灌流不足的原因。Purohit S等人发现在MCD病人循环系统中有内皮细胞损伤标志物syndecan 1升高，但是不清楚是否同时存在肾小球内皮细胞的损伤。Trachtman H等人在FSGS和MCD病人的肾组织中观察到了IgM与补体成分共沉积，且证实IgM是针对GEC和心磷脂表位的抗体。2022年Bauer C等人发现，MCD病人血清中内皮细胞标志物有升高，同时肾组织病理证实肾小球内皮细胞caveolin-1表达明显上升，进一步将病人血清与体外培养的人肾小球内皮细胞共孵育会显著增加肾小球血管内皮细胞损伤的标志物thrombomodulin的表达，由此证明MCD病人存在肾小球血管内皮细胞的损伤。

尽管如此，至今大家并不清楚造成肾小球内皮细胞损伤的致病因子到底是什么。我们的研究团队通过前期的研究在MCD和FSGS肾病综合征患者体内筛选和鉴定到了一系列的肾小球血管内皮细胞自身抗体。动物实验证实这些肾小球血管内皮细胞自身抗体会引起小鼠肾小球血管内皮细胞严重损伤。体外细胞培养实验也表明这些自身抗体会影响血管内皮细胞的形态和功能。临床研究更是表明这些肾小球血管内皮细胞自身抗体与患者的高凝状态以及不良预后有关。此外，我们的研究结果还提示肾小球血管内皮细胞自身抗体引起的肾小球血管内皮细胞损伤可能是MCD中的特征性足细胞损伤的始动因素，是该病的重要病因之一。由此，我们在国际上首次提出了MCD 和FSGS肾病综合征发病的二次打击理论：即，包括自身抗体在内的致病因子首先损伤肾小球血管内皮细胞，之后这些致病因子进一步损伤足细胞，最终引起患者发病。因为从足细胞特殊的解剖位置来看，血液循环系统中的致病因子不可能与之接触，除非肾小球血管内皮细胞的完整性已经受到了损伤。由此可见，我们关于肾小球血管内皮细胞自身抗体的研究成果是一次在肾病综合征发病机制的理论研究方面的突破。但目前仍缺乏高效的对血管内皮损伤进行检测的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。抗Talin-1-IgG自身抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的有效检测。

本发明提供了检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。

优选的是，所述检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂包括Talin-1蛋白或含标签的Talin-1重组蛋白或多肽；所述Talin-1蛋白的NCBI蛋白登录号为 BC042923。

优选的是，所述标签包括His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。

优选的是，当所述标签为His标签时，所述含标签的Talin-1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述血管内皮损伤包括肾小球血管内皮细胞损伤。

本发明还提供了一种检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：上述技术方案所述应用中的检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

优选的是，所述固相载体包括硝酸纤维素膜、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒和/或酶标微孔板。

优选的是，所述标记抗体包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；所述二抗包括抗人IgG抗体。

优选的是，所述酶标记的二抗包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。

本发明提供了检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。本发明首次在部分肾病综合征患者的体内检测到了一种抗Talin-1-IgG自身抗体，且确定了该自身抗体针对的靶抗原为肾小球血管内皮细胞上Talin-1。本发明发现Talin-1蛋白抗体是一种重要的肾小球血管内皮细胞自身抗体，与MCD和FSGS肾病综合征的发生发展密切相关，且能指导临床的诊疗。抗Talin-1-IgG自身抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的检测，具体为研究肾病综合征的分子机制和临床诊疗提供依据。本发明提供的检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂盒既可以定性也可以定量检测肾病综合征患者血清中抗Talin-1-IgG抗体，且本发明试剂盒利用人抗标签肽的IgG抗体作为标准品以及结合生物素-亲和素放大系统、磁微粒化学发光免疫分析大大提高了检测的准确性、灵敏度、特异性及检测速度。具体的，与现有技术相比本发明试剂盒的有益之处如下：

1、本发明试剂盒能够实现血管内皮损伤的高效检测，检测到抗 Talin-1-IgG自身抗体，则判定存在血管内皮损伤。

2、目前国内外关于肾脏疾病患者有关Talin-1、抗Talin-1-IgG抗体仅限于分子机制研究，并没有定量检测其在患者血清中水平。本发明首次鉴定了针对Talin-1的IgG自身抗体，并针对该Talin-1-IgG自身抗体发明了检测试剂盒，填补了国内外空白。利用本发明试剂盒检测298例肾病综合征患者血清中抗Talin-1-IgG抗体，结果显示有150例患者抗Talin-1-IgG抗体阳性，即抗Talin-1-IgG抗体阳性检出率为50.34％。本发明对抗Talin-1-IgG抗体进行检测后续可以为研究肾病综合征的分子机制和临床诊疗提供依据。

3、本发明试剂盒涉及固相膜免疫定性分析人血清中抗Talin-1-IgG抗体，以人抗标签肽的IgG抗体作为标准品，大大提高了检测准确性。固相膜免疫定性检测操作简单，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍；另外NC 膜吸附能力极强接近100％，微量抗原能够完全吸附固定在NC膜上；吸附抗原或抗体或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性；另外本发明固相膜免疫定性检测人血清中抗Talin-1-IgG抗体的试剂盒引入生物素-亲和素放大系统，大大提高了检测灵敏度。

4、本发明涉及的磁微粒化学发光免疫分析定量检测人血清中抗 Talin-1-IgG抗体试剂盒，利用磁微粒为固相载体，其直径仅为1.0μm，这就大大增加了包被表面积，增加了抗原的吸附量，提高了反应速度，也使清洗分离更简便，从而减少污染，降低交叉感染概率。另一方面，采用吖啶酯发光剂直接标记抗人IgG，其化学反应简单、快速、无须催化剂；吖啶酯化学发光为闪光型，其通过起动发光试剂(H

附图说明

图1为本发明提供的肾小球血管内皮细胞上的Talin-1蛋白是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原结果图；其中，A：一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；B：一抗为肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点； C：靶抗原Talin-1蛋白的质谱鉴定；

图2为本发明提供的表达的重组蛋白Talin-1的SDS-PAGE鉴定图；

图3为本发明提供的固相膜免疫试剂盒检测肾病综合征患者血清中抗 Talin-1-IgG抗体结果图；

图4为本发明提供的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测抗Talin-1-IgG 抗体的原理示意图；

图5为本发明提供的抗原蛋白Talin-1包被羧基磁微粒示意图；

图6为本发明提供的各类肾病病人中抗Talin-1-IgG抗体的检测情况图；其中，NS：肾病综合征，HSP：过敏性紫癜，HSPN：紫癜性肾炎，NC：健康儿童；

图7为本发明提供的抗Talin-1-IgG抗体与血管内皮损伤标志物线性相关结果图。

具体实施方式

本发明提供了检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。Talin-1蛋白是一种存在于细胞质中的蛋白，由头部(talinhead)及体部(talinrod)两部分构成，是调控细胞膜上整合素蛋白功能的重要分子。血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统。血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管的最里层附着着血管内皮细胞，血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，从而导致心脏、肺、肝等脏器的损伤，引发各个脏器相关的疾病，包括肾病综合征。因此，在血液循环系统中检测出血管内皮细胞自身抗体，临床上可以用于提示血管内皮细胞损伤的存在。因为不同脏器的血管内皮细胞都是一样的，因此本发明首次发现血管内皮细胞自身抗体——抗Talin-1-IgG自身抗体，本发明应用能够实现包括肾小球血管内皮在内的全身所有血管内皮损伤的检测。

本发明检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂以Talin-1蛋白为靶点，进行 Talin-1自身抗体的检测(即抗Talin-1-IgG自身抗体为检测血管内皮细胞损伤的生物标志物)，所述试剂能够实现血管内皮损伤的高效检测。在本发明中，所述试剂能够与来自组织(肾活检组织)或体液(特别是血液、血浆、血清)中的Talin-1蛋白自身抗体进行免疫反应。在本发明中，所述检测抗 Talin-1-IgG自身抗体的试剂优选包括Talin-1蛋白或含标签的Talin-1重组蛋白或多肽；所述Talin-1蛋白的NCBI蛋白登录号为BC042923。在本发明中，所述标签优选为具有某些生物学或物理功能的标签，特别是N-末端或C-末端；这些标签的存在有利于抗原蛋白纯化，固定，沉淀；所述标签更优选是能够特异性结合配体的序列或结构域，如标签肽，所述标签肽优选选自：His 标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。在本发明中，当所述标签为His 标签时，所述含标签的Talin-1重组蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1 所示： MGNSCRQEDVIATANLSRRAIADMLRACKEAAYHPEVAPDVRLRALHYG RECANGYLELLDHVLLTLQKPSPELKQQLTGHSKRVAGSVTELIQAAEAM KGTEWVDPEDPTVIAENELLGAAAAIEAAAKKLEQLKPRAKPKEADESL NFEEQILEAAKSIAAATSALVKAASAAQRELVAQGKVGAIPANALDDGQW SQGLISAARMVAAATNNLCEAANAAVQGHASQEKLISSAKQVAASTAQLL VACKVKADQDSEAMKRLQAAGNAVKRASDNLVKAAQKAAAFEEQENE TVVVKEKMVGGIAQIIAAQEEMLRKERELEEARKKLAQIRQQQYKFLPSE LRDEHHHHHHH。

在本发明中，所述血管内皮损伤优选包括肾小球血管内皮细胞损伤。更具体的，本发明所述血管内皮损伤优选包括肾病综合征的血管内皮损伤。在本发明中，所述肾病综合征优选包括微小病变病或原发性局灶节段性肾小球硬化。

本发明还提供了一种检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：上述技术方案所述应用中的检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

在本发明中，所述检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂(Talin-1蛋白或含标签的Talin-1重组蛋白)优选固定于固相载体上。本发明所述“固定”是指与Talin-1抗原蛋白不溶于水的固相载体结合，该固相载体或支持物不溶于水，更优选地通过共价键合，静电相互作用，疏水相互作用、或通过二硫键相互作用，最优选通过一个或多个共价键。固定可以是直接固定方式，例如通过过滤，离心或层析，将固定化的分子与不溶性载体一起从水溶液中分离出来。还包括可逆或不可逆的方式固定Talin-1抗原蛋白。例如，抗原蛋白通过可裂解的共价键(如可添加含硫醇的试剂来裂解的二硫键)固定于载体，这种固定是可逆的。另外，如抗原蛋白通过在水性溶液中不会裂解的共价键(通过环氧化物基团与将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的胺基团的反应形成的键)固定于载体，则固定是不可逆的。固定还可以是间接方式：如固定对所述抗原蛋白具有特异性亲和力的抗体，然后形成抗原蛋白-抗体复合物以达到固定的效目的。本发明所述的抗原蛋白Talin-1固定方法优选为直接包被法：(1)抗原蛋白Talin-1通过物理吸附方式或非共价键结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；(2)带有羧基功能团的磁微粒与抗原蛋白 Talin-1的氨基结合，抗原蛋白Talin-1通过化学偶联方式结合在磁微粒上。在本发明中，所述固相载体优选包括硝酸纤维素膜、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒或酶标微孔板。

本发明优选采用基因重组原核表达方法成功表达并纯化出重组蛋白 Talin-1，以此作为试剂盒中抗原蛋白，研发出一套适合于检测肾病综合征患者肾小球血管内皮细胞自身抗体抗Talin-1-IgG抗体的试剂盒，包括一种定性或定量分析检测人血清中抗Talin-1-IgG抗体的检测试剂盒。

在本发明中，所述Talin-1蛋白优选表达于细菌(如大肠杆菌)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中。表达得到Talin-1蛋白后，本发明优选利用Ni柱亲和层析、分子筛层析、离子交换层析、疏水柱纯化等方法对Talin-1蛋白进行纯化。

在本发明中，所述标记抗体优选包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；所述二抗包括抗人IgG抗体。

在本发明中，所述酶标记的二抗优选包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。

在本发明中，所述试剂盒的类型优选包括固相膜免疫试剂盒或磁微粒化学发光免疫分析试剂盒；当所述试剂盒为固相膜免疫试剂盒时，所述试剂盒优选还包括抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色液、洗涤液、酶工作液、标准品、阳性质控品和阴性质控品；当所述试剂盒为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒时，所述试剂盒优选还包括化学发光预激发液A、化学发光激发液B、标准品和清洁溶液。在本发明中，标准品和阳性质控品优选均为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗Talin-1-IgG自身抗体；所述阴性质控品优选为健康体检者血清。

具体的，当所述试剂盒为固相膜免疫试剂盒时，所述试剂盒中，所述检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂，即抗原优选为重组蛋白Talin-1(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；固相载体优选为Satourius CN140硝酸纤维素膜；阳性质控品(标准品)优选为人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)；阴性质控品优选为健康体检者血清；标记抗体优选为生物素标记抗人IgG抗体；酶工作液优选为碱性磷酸酶-链霉亲和素；所述底物显色剂优选为 TMB、过氧化氢、AMPPD、4-MUP或BCIP；所述抗原稀释液优选为含有 163mM NaCl、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4；所述样品稀释缓冲液优选为含有10％BSA的0.01M PBS pH7.4；所述抗体稀释液优选为含有1M D-glucose、2％甘油、0.35％Tween20的0.01M PBS pH7.4；所述洗涤液优选为：含有163mMNaCl、10％甘油、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4。

当所述试剂盒为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒时，所述试剂盒中，抗原优选为重组蛋白Talin-1(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；固相载体优选为羧基磁珠；标记抗体优选为吖啶酯标记抗人IgG抗体；化学发光预激发液A和化学发光激发液B优选为常规市售产品、标准品优选为不同浓度的抗Talin-1-IgG自身抗体；清洁溶液优选为含有0.15mol/LNaCL和0.05％ Tween-20的pH 7.2、25mmol/LTris-HCL溶液。

在本发明中，所述试剂盒的待测样品优选来自全血、血清、血浆、尿液、淋巴液、胸腹水；更优选为哺乳动物(人类)血清。

在本发明中，检测血清中抗Talin-1-IgG抗体试剂盒的原理优选为：利用间接法反应原理，首先将Talin-1抗原吸附于固相载体作为包被抗原，然后加入阳性质控品或标准品或待检血清样本进行孵育，再加入标记抗体(标记二抗)反应后，若待检血清中含有抗Talin-1-IgG抗体，则形成包被抗原 Talin-1-待检血清抗Talin-1-IgG抗体-标记抗人IgG抗体三元复合物，最后利用光显色法、化学发光法、荧光发光法来检测光信号，以达到定性或定量分析人血清中抗Talin-1-IgG抗体的目的。

下面结合具体实施例对本发明所述的检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

血管内皮细胞上的Talin-1蛋白是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原

具体实施如下：

(1)血管内皮细胞总蛋白的提取：培养血管内皮细胞株(EAhy926)，用PBS洗涤2～3次，然后用聚焦超声仪(Covaris S220，Gene)在含有30mm Tris-HCl、8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制剂(#ab65621；Abcam，1： 200稀释)的裂解缓冲液中冰上进行充分裂解，然后将样本置于离心机， 12000g，4℃，离心30min。收集上清，即为收集到的血管内皮细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定收集到的血管内皮细胞总蛋白浓度。

(2)二维电泳：提取血管内皮细胞总蛋白进行二维电泳后转到硝酸纤维素膜上，分别用健康人和肾病综合征病人的血清作为一抗进行孵育，之后加上二抗进行显影，结果见图1中的A和图1中的B。

(3)基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析：将步骤(2)显影后进行阳性点的差异分析，选取二维电泳胶上肾病综合征病人强阳性，而健康人阴性或者弱阳性的蛋白点，从凝胶上取下选中的蛋白点，将干燥后的凝胶用胰蛋白酶(0.1μg/μl)进行消化，然后向反应混合物中加入10μl的25mM 碳酸氢铵，37℃孵育过夜，然后用三氟乙酸(0.1％)从凝胶中提取肽。用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)质谱仪对提取的肽进行分析，得到肽质量图谱，鉴定为Talin-1蛋白，见图1中C。

图1为肾小球血管内皮细胞上的Talin-1蛋白是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原结果图；其中，A：一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；B：一抗为肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点；C：靶抗原Talin-1 蛋白的质谱鉴定

实施例2

重组抗原蛋白Talin-1表达及纯化

利用基因工程的方法以编码Talin-1蛋白的基因为模板，进行PCR扩增，然后构建表达载体进行蛋白表达。本发明表达的抗原蛋白上含有His标签的标签肽。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析进行纯化，最后利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白Talin-1的分子量为45KDa，见图2(表达的重组蛋白Talin-1的 SDS-PAGE鉴定图)，其中，泳道A：细胞裂解物的上清液，在15℃下诱导16小时；泳道B：细胞裂解物的上清液，在37℃下诱导4小时。

实施例3

采用正交试验设计对试剂盒反应条件进行优化

根据抗原Talin-1包被浓度(50μg、80μg、100μg、150μg四个包被浓度)、各反应时间(15min、30min、45min)和温度(25℃、37℃)、酶标二抗最佳稀释度(1:100、1:500、1:1000、1:1500四个稀释度)等4个因素选择正交表，每个因素按2水平重复测定标准阳性血清和标准阴性血清，选择阳性血清的最高光信号值(P)和阴性血清的最低光信号值(N)的比值(P/N)。通过正交设计得到本试剂盒最佳抗原Talin-1包被浓度为80μg/ml、固相膜免疫检测抗Talin-1-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为25℃、最佳抗原抗体反应时间30min及最佳生物素标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1： 500；磁微粒化学发光免疫分析检测抗Talin-1-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为37℃、最佳抗原抗体反应时间15min及最佳吖啶酯标记抗人IgG 抗体最佳工作稀释度为1：500。

实施例4

用于检测抗Talin-1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备

4.1用于检测抗Talin-1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的组成：

抗原：重组蛋白Talin-1

固相载体：Satourius CN140硝酸纤维素膜

阳性质控品(标准品)：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)

阴性质控品：健康体检者血清

标记抗体：生物素标记抗人IgG抗体

抗原稀释液

样品稀释缓冲液

抗体稀释液

洗涤液

酶工作液：碱性磷酸酶-链霉亲和素

底物显色液：BCIP显色液。

4.2用于检测抗Talin-1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的检测步骤如下：

4.2.1包被、封闭：将8μl浓度为80μg/ml的Talin-1抗原直接点于硝酸纤维素膜上置37℃孵育箱中干燥30min，将硝酸纤维素膜置于检测板中，加入200μl 5％BSA于37℃温盒中封闭30min，弃去封闭液后用洗涤液洗2 次；

4.2.2抗原孵育：向检测板内加入10μl用稀释液稀释的抗体标准品或待检血清，同时做阴性对照、阳性对照，25℃孵育30min，每个样品设置3个平行孔；

4.2.3二抗孵育：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加入20μl 1:500生物素标记抗人IgG抗体，25℃孵育30min；

4.2.4显色：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加500μl碱性磷酸酶-链霉亲和素，室温孵育20min，弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1 min，然后加入BCIP显色液，室温反应20min，用流水冲洗检测板，终止酶反应。取出测试硝酸纤维素膜条用吹风机吹干膜条，用比色卡肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性，结果见图3(固相膜免疫试剂盒检测肾病综合征患者血清中抗Talin-1-IgG抗体结果图)，或将膜条置于显影仪上扫描，显影仪自带的分析软件以参考标准品浓度作为纵坐标、仪器读取的灰度值作为横坐标，绘制标准曲线对血清中抗Talin-1-IgG抗体水平进行半定量分析。

实施例5

用于检测抗Talin-1-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒的制备(图4为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测抗Talin-1-IgG抗体的原理示意图)

5.1抗Talin-1-IgG抗体化学发光检测试剂盒，包括以下组成部分：

(1)吖啶酯标记的抗人IgG；

(2)与Talin-1抗原偶联的羧基磁珠；

(3)化学发光预激发液A(H

(4)抗Talin-1-IgG抗体系列标准溶液，标准浓度：0μg/ml、2μg/ml、4 μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、20.0μg/ml，缓冲液为含0.5mol/L的Tris-HCL 5.0％ BSA和0.1～0.5％PC300；

(5)清洁溶液，特别是含有0.15mol/LNaCL和0.05％Tween-20的pH 7.2、25mmol/LTris-HCL溶液。

5.2磁珠偶联抗原的制备(图5，抗原蛋白Talin-1包被羧基磁微粒示意图)

(1)取1mg羧基磁性颗粒于0.5mL离心管中，加入200μL的0.1mol/L MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min，使磁性颗粒从液体，并丢弃上清液。洗涤3次，然后加入200μL的MES(pH 5.0)缓冲液并涡旋；

(2)加入18μl(18μg)Talin-1抗原，涡旋，旋转反应管，室温孵育 30min；

(3)加入10μl 10mg/mL偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育 2h；

(4)去除上清液，加入200μl洗涤缓冲液(TBS+0.05％Tween-20)洗涤3次；

(5)用含1％BSA的缓冲液封闭，重复4次，每次10min。磁性颗粒悬浮液储存在2～8℃。

5.3吖啶酯标记抗体的制备

(1)将100μL的抗人IgG抗体放入透析袋中，将透析袋放入不少于1L 的标记缓冲液进行透析，期间至少更换3次缓冲液，最后一次透析过夜，标记缓冲液为Na

(2)称取1.7mg吖啶酯NSP-DMAE-NHS溶于447μl无水二甲基甲酰胺DMF中，形成6.5mmol/LNSP-DMAE-NHS DMF溶液；

(3)将透析后的抗体溶液置于500μl离心管中，加入100μL的6.5 mmol/LNSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与抗体的摩尔比为7.4:1，加入 200μl标记缓冲液、室温反应45min，加入10μl赖氨酸10μl，继续反应15 min终止标记反应；

(4)通过Sephadex G-50柱(1×25cm)将标记物NSP-DMAE-NHS-Ab 与游离的NSP-DMAE-NHS分离，用含纯化缓冲液pH为6.3和浓度为0.1 mol/L；

(5)分离过程中，用色谱仪检测蛋白质峰，分别测定流出液的化学发光强度和430nm处的吸光度；

(6)收集高光度、高吸光度的洗脱液，加入1％BSA(体积)，冰上保存。

5.4样品制备:将样本按1:10的比例稀释

5.5用于检测抗Talin-1-IgG抗体的化学发光法试剂盒的检测步骤如下：

(1)100μl待测样品、150μl偶联磁粉悬液、150μl吖啶酯标记二抗依次加入反应管中，摇匀混合，37℃保温15min；

(2)隔离洗涤5次；

(3)充分振摇洗涤后的反应容器，使磁性颗粒均匀分散；

(4)加入100μl化学发光预激发液A，随后加入100μl化学发光激发液B，测定其相对发光强度。样品中抗Talin-1-IgG抗体的含量与其发光强度成正比。

实施例6

检测血清抗Talin-1-IgG抗体试剂盒的临床应用

6.1受试者纳入

从2018年6月到2020年6月诊断出各类肾病的患者，包括298例肾病综合征(NS)、100例过敏性紫癜(HP)、100例紫癜性肾炎(HPN)、100 例川崎病(KD)、同时期100例健康儿童(NC)。血清样本取自各类肾病患者和健康对照组。所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行第一次血清样本采集。

6.2各类肾病病人中抗Talin-1-IgG抗体的检测情况

利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出各类肾病的患者血清中抗Talin-1-IgG抗体水平，包括298例肾病综合征、100例过敏性紫癜、100例紫癜性肾炎、100例川崎病及同时期100例健康儿童，结果显示部分肾病综合征病人中抗Talin-1-IgG抗体阳性(有150例患者抗 Talin-1-IgG抗体阳性，即抗Talin-1-IgG抗体阳性检出率为50.34％)，而紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病以及健康儿童中抗Talin-1-IgG抗体为阴性，见图6(各类肾病病人中抗Talin-1-IgG抗体的检测情况图，其中NS：肾病综合征，HP：过敏性紫癜，HPN：紫癜性肾炎，KD：川崎病，NC：健康儿童)。检测血清中抗Talin-1-IgG抗体的存在有助于肾病综合征血管内皮损伤的确定。

6.3肾病综合征患者血清抗Talin-1-IgG抗体与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关

利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出肾病综合征患者血清中抗Talin-1-IgG抗体表达量，并检测患者血清中血管内皮损伤标志物Plvap的表达量，结果显示肾病综合征病人中抗Talin-1-IgG抗体表达量与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关，肾病综合征与血管内皮损伤有关，抗Talin-1-IgG自身抗体的检测能够用于判断血管内皮损伤，即检测到抗Talin-1-IgG自身抗体，则判定有血管内皮损伤，见图7(抗Talin-1-IgG抗体与血管内皮损伤标志物线性相关结果图)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Asn Ser Cys Arg Gln Glu Asp Val Ile Ala Thr Ala Asn Leu

1 5 10 15

Ser Arg Arg Ala Ile Ala Asp Met Leu Arg Ala Cys Lys Glu Ala Ala

20 25 30

Tyr His Pro Glu Val Ala Pro Asp Val Arg Leu Arg Ala Leu His Tyr

35 40 45

Gly Arg Glu Cys Ala Asn Gly Tyr Leu Glu Leu Leu Asp His Val Leu

50 55 60

Leu Thr Leu Gln Lys Pro Ser Pro Glu Leu Lys Gln Gln Leu Thr Gly

65 70 75 80

His Ser Lys Arg Val Ala Gly Ser Val Thr Glu Leu Ile Gln Ala Ala

85 90 95

Glu Ala Met Lys Gly Thr Glu Trp Val Asp Pro Glu Asp Pro Thr Val

100 105 110

Ile Ala Glu Asn Glu Leu Leu Gly Ala Ala Ala Ala Ile Glu Ala Ala

115 120 125

Ala Lys Lys Leu Glu Gln Leu Lys Pro Arg Ala Lys Pro Lys Glu Ala

130 135 140

Asp Glu Ser Leu Asn Phe Glu Glu Gln Ile Leu Glu Ala Ala Lys Ser

145 150 155 160

Ile Ala Ala Ala Thr Ser Ala Leu Val Lys Ala Ala Ser Ala Ala Gln

165 170 175

Arg Glu Leu Val Ala Gln Gly Lys Val Gly Ala Ile Pro Ala Asn Ala

180 185 190

Leu Asp Asp Gly Gln Trp Ser Gln Gly Leu Ile Ser Ala Ala Arg Met

195 200 205

Val Ala Ala Ala Thr Asn Asn Leu Cys Glu Ala Ala Asn Ala Ala Val

210 215 220

Gln Gly His Ala Ser Gln Glu Lys Leu Ile Ser Ser Ala Lys Gln Val

225 230 235 240

Ala Ala Ser Thr Ala Gln Leu Leu Val Ala Cys Lys Val Lys Ala Asp

245 250 255

Gln Asp Ser Glu Ala Met Lys Arg Leu Gln Ala Ala Gly Asn Ala Val

260 265 270

Lys Arg Ala Ser Asp Asn Leu Val Lys Ala Ala Gln Lys Ala Ala Ala

275 280 285

Phe Glu Glu Gln Glu Asn Glu Thr Val Val Val Lys Glu Lys Met Val

290 295 300

Gly Gly Ile Ala Gln Ile Ile Ala Ala Gln Glu Glu Met Leu Arg Lys

305 310 315 320

Glu Arg Glu Leu Glu Glu Ala Arg Lys Lys Leu Ala Gln Ile Arg Gln

325 330 335

Gln Gln Tyr Lys Phe Leu Pro Ser Glu Leu Arg Asp Glu His His His

340 345 350

His His His His

355