新型温敏性水凝胶耦合外泌体治疗盆腔根治性手术后ED

摘要

本发明公开了新型温敏性水凝胶耦合外泌体治疗盆腔根治性手术后ED，该新型水凝胶以水溶性的羟乙基壳聚糖和β‑甘油酸钠为主要原料，利用该新型温敏性水凝胶封装外泌体，提高了外泌体在神经损伤部位的保留时间和稳定性，促进外泌体发挥其神经损伤修复作用。利用新型水凝胶封装外泌体使得整体有着良好的生物相容性，可以在盆腔根治性手术中使用，为安全且无创地预防和治疗术中海绵体神经损伤导致的勃起功能障碍提供了可能。

说明书

技术领域

本发明涉及新型温敏性水凝胶耦合外泌体治疗盆腔根治性手术后ED，属于临床医学领域。

背景技术

目前，男性勃起功能障碍的治疗方案主要包括磷酸二酯酶-5抑制剂、阴茎海绵体内注射、药物尿道栓，以及对患有勃起功能障碍和性腺功能减退的男性进行睾酮替代治疗。然而，由于创伤或手术导致神经损伤的男性通常对这些药物治疗无效。在许多情况下，这些患者必须通过手术植入阴茎假体来恢复勃起功能。阴茎假体植入是一种有创的治疗方法，且术后易并发感染。

近年来，脂肪间充质干细胞来源的外泌体的治疗已经成为治疗神经退行性疾病的有前途的策略之一。然而，由于活体内固有的免疫系统，脂肪间充质干细胞来源的外泌体的治疗仍然面临着许多挑战，如半衰期短，清除速度快。损伤组织的修复过程通常需要一个复杂的多相过程，而损伤组织中未结合的外泌体很难长时间保留。温敏性水凝胶由于其对温度具备独特的智能响应性能，可以通过微创手术以溶液的形式植入到人体缺陷及病变部位，随着温度的变化而发生凝胶化转变，具有组织损伤小、操作简单易行及不破坏修复区血液供给等优点，加之水凝胶一般能吸收大量的水分，类似人体细胞外基质，从而赋予其良好的生物相容性、毒副作用小等优点，因此在药物释放、组织修复、细胞封装等生物医疗应用领域的研究越来越广泛。壳聚糖具有杀菌、抑菌、消炎、止血和促进伤口愈合的能力，因此成为合成温敏性水凝胶的常用成分。但是壳聚糖水溶性不好，需要在酸性条件下溶解，操作繁琐。且引入酸性物质，降低了生物相容性。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供新型温敏性水凝胶耦合外泌体治疗盆腔根治性手术后ED，该新型水凝胶以水溶性的羟乙基壳聚糖和β-甘油酸钠为主要原料，利用该新型温敏性水凝胶封装外泌体，提高了外泌体在神经损伤部位的保留时间和稳定性，促进外泌体发挥其神经损伤修复作用。

一种新型温敏性水凝胶耦合外泌体的制备方法包括如下步骤：

1)配制羟乙基壳聚糖(HECTS)溶液和β-甘油酸钠(β-GP)溶液；

2)将步骤1)制备的羟乙基壳聚糖溶液和β-甘油酸钠溶液在冰浴中混合，获得新型温敏性水凝胶；

3)步骤2)获得的新型温敏性水凝胶和外泌体按照质量比为(8-10)：1的比例混合，即可获得新型温敏性水凝胶耦合外泌体。

进一步的，上述羟乙基壳聚糖(HECTS)溶液中羟乙基壳聚糖质量分数为3-4％。

进一步的，上述β-甘油酸钠(β-GP)溶液中β-甘油酸钠的质量分数为55-60％。

进一步的，上述外泌体指脂肪间充质干细胞来源的外泌体。

如上述方法制备的新型温敏性水凝胶耦合外泌体在制备治疗盆腔根治性手术后ED药物中的应用。

如上述方法制备的新型温敏性水凝胶耦合外泌体在促进神经损伤修复方面的作用。

有益效果：

(1)合成的新型水凝胶首次使用了羟乙基壳聚糖与β-甘油酸钠混合，以水溶性的羟乙基壳聚糖代替壳聚糖，解决了壳聚糖水溶性差所带来的操作繁琐，生物相容性差的缺点，同时新的水凝胶本身也具有一定促进神经损伤修复的作用。

(2)采用新型温敏性水凝胶封装外泌体，提高了外泌体在神经损伤部位的保留时间和稳定性，促进外泌体发挥其神经损伤修复作用。

(3)术中的神经损伤造成的的ED被发现时，往往距离海绵体神经损伤已经过去一段时间了，会导致神经损伤延迟修复，给ED的治疗带来较大的困难。利用新型水凝胶封装外泌体使得整体有着良好的生物相容性，可以在盆腔根治性手术中使用，为安全且无创地预防和治疗术中海绵体神经损伤导致的勃起功能障碍提供了可能。

附图说明

图1新型水凝胶电子显微镜下结构。

图2新型水凝胶FTIR光谱图。

图3新型水凝胶流变特性图。

图4评估药剂对双侧海绵体神经损伤的SD大鼠应用效果的操作步骤图。

图5不同药剂组合对双侧海绵体神经损伤的SD大鼠的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1制备新型水凝胶

一、制备方法

1、制备水凝胶

质量分数为3％的羟乙基壳聚糖(HECTS)溶液和质量分数为60％的β-甘油酸钠(β-GP)溶液，将两种溶液等体积在冰浴下混合，获得新型温敏性水凝胶。

2、检测水凝胶

(1)观察微观结构

将水凝胶在液氮中冷冻20分钟，然后折断以获得横截面。在兆电子离子溅射金属镀膜设备上镀上金后，用扫描电子显微镜在20kV的加速电压下检查表面形态。

(2)傅里叶红外光谱检测

衰减全反射(ATRR)-傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析在Thermo Nicolet FTIR(Nexus-670)上进行，以描述水凝胶的官能团和化学键。傅立叶红外光谱在4000-400cm

(3)流变特性

流变特性是在装有PP25平板压头的旋转流变仪(Anton Paar MCR302，奥地利)上进行的，平台平板配置。HECTS/GP在板之间进行管道输送，并使用矿物油覆盖溶液的边缘表面，以防止测试期间水分蒸发。为了减轻对胶凝系统的损害，在5％的应变下进行了动态振荡模式测量，这属于线性粘弹性系统，确保G'和G"与应变幅度无关，正如应变扫频实验所证明的那样。在动态温度扫描中，频率被设定为10rad/s，温度从10℃增加到45℃，速度为2.5℃/min。在动态时间扫描中，样品板被预热到37℃。然后将水凝胶移到平板上并保持30秒，接着进行时间扫描。

二、实验结果

1、水凝胶微观结构

如图1所示，水凝胶具有明显的多孔结构，能够更加有效地包裹外泌体。

2、红外线

水凝胶的FTIR光谱显示了HECTS和β-GP的所有特征峰，证实了水凝胶的成功制备。通过分析水凝胶的FTIR谱可以看到，叠加的O-H和N-H拉伸振动吸收峰的位置从3434cm

3、流变特性

如图3，水凝胶前体溶液的行为更像是一种溶液，G'相对较小。当凝胶化发生时，G'将突然增加。由于这个原因。凝胶化温度是水凝胶前体溶液从溶液变成水凝胶的地方，通常被定义为G'等于G"的温度。如图所示，新型热敏水凝胶的凝胶化温度为28.36℃，凝胶化时间为4分钟。这说明新型水凝胶有着良好的温敏性和较快的成胶时间。同时，水凝胶还具有可注射性和良好的生物相容性，适于临床应用。

实施例2盆腔根治性手术中应用以改善术中神经损伤导致的勃起功能障碍

一、实验步骤

对SD大鼠进行了双侧海绵体神经钳夹损伤，建立了大鼠神经损伤性勃起功能障碍模型，并将大鼠分为5组：假手术组、双侧海绵体神经损伤对照组、双侧海绵体神经损伤+PBS-Exos治疗组、双侧海绵体神经损伤+水凝胶-Exos治疗组、双侧海绵体神经损伤+单纯水凝胶治疗组。根据分组的不同，每组SD大鼠采取不同的处理和治疗方法。在进行处理后，大鼠继续饲养4周，使用电生理仪进行海绵体内压和颈动脉压检测以反映大鼠的勃起功能。操作过程见图4。

二、实验结果

如图5所示，相比于双侧海绵体神经损伤后的空白对照组以及双侧海绵体神经损伤后PBS-外泌体治疗组，双侧海绵体神经损伤后水凝胶-外泌体治疗组MAX ICP/MAP比值明显升高，这说明水凝胶外泌体可以促进双侧海绵体神经损伤后勃起功能的恢复。单纯水凝胶治疗组MAX ICP/MAP比值相比于双侧海绵体神经损伤对照组也有着一定的提升，这说明新型水凝胶本身也有着促进神经损伤修复、促进勃起功能恢复的作用。