一种用于定向输送干细胞外泌体皮表喷涂给药的温敏性智能水凝胶及其制备方法和应用

摘要

本申请涉及生物医用材料的技术领域，具体公开了一种用于定向输送干细胞外泌体皮表喷涂给药的温敏性智能水凝胶及其制备方法和应用。上述温敏性智能水凝胶包含以下重量份的组分：壳聚糖0.5‑1.5份、泊洛沙姆15‑25份、乳酸水溶液0.5‑1.5份、干细胞上清液73.5‑84.5份。同时，本申请还提供了上述温敏性智能水凝胶的制备方法以及在智能给药系统的应用。利用本申请提供的温敏性智能水凝胶能够有效降低水凝胶的成胶时间，同时能够在较长时间内，保持干细胞上清液的活性。

说明书

技术领域

本申请涉及生物医用材料的技术领域，具体涉及一种用于定向输送干细胞外泌体皮表喷涂给药的温敏性智能水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

水凝胶是一种具有三维网络状结构的交联聚合物，可以吸收大量的水且不会被水所溶解，且能够保持一定的形状。水凝胶结构中的水溶性高分子引入了亲水基团和疏水基团，亲水基团遇水结合，从而将水分子连接在水凝胶网状内部；而疏水基团遇水分散，使得水凝胶发生膨胀。根据水凝胶对外界刺激的响应情况，可分为传统水凝胶和智能水凝胶。其中，智能水凝胶是指自身能够感知如pH、温度、光、电、压力等外界环境微小的变化或者刺激，并能够产生相应的物理结构或者化学性质变化甚至突变的一类高分子凝胶。

目前，温度刺激响应性的温敏性智能水凝胶能够响应温度变化而发生溶胀或者收缩，在智能给药系统的应用较为广泛，具有药物递送方便以及药物释放可控的优异特性。

温敏性智能水凝胶的制备原料常使用有机试剂，因此，该类凝胶易发生生物学毒性和其它炎症反应，使得此类水凝胶的生物相容性降低，导致有机试剂参与的温敏性智能水凝胶的应用受到了限制。天然高分子多糖制备的温敏性智能水凝胶具有生物相容性优异的特点，但是该类水凝胶的胶凝时间较长，使得水凝胶的流动容易产生偏移，导致治疗效果较差，从而严重影响了温敏性智能水凝胶的应用前景。

发明内容

为了降低水凝胶的成胶时间，同时能够在较长时间内保持干细胞上清液的活性，本申请提供一种用于定向输送干细胞外泌体皮表喷涂给药的温敏性智能水凝胶及其制备方法和应用。

第一方面，本申请提供一种温敏性智能水凝胶。

一种温敏性智能水凝胶，包含以下重量份的组分：壳聚糖0.5-1.5份；泊洛沙姆15-25 份；乳酸水溶液0.5-1.5份；干细胞上清液73.5-84.5份。

本申请中，使用壳聚糖、泊洛沙姆、乳酸水溶液以及干细胞上清液作为温敏性智能水凝胶的原料，并将各组分的重量份控制在上述范围内，制备得到的温敏性智能水凝胶，成胶温度均在34-37℃，同时能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶时间，表明本申请的技术方案能够快速的实现温敏性智能水凝胶的凝固，从而在应用过程中，能够有效避免药物的偏移，提高治疗效果。

在一个具体的实施方案中，所述壳聚糖的添加量可以为0.5份、1份、1.5份。

在一些具体的实施方案中，所述壳聚糖的添加量还可以为(0.5-1)份、(1-1.5)份。

经过试验分析可知，当控制温敏性智能水凝胶中壳聚糖的添加量在上述范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将温敏性智能水凝胶中壳聚糖的添加量控制在上述范围内。

本申请中，泊洛沙姆水溶性良好，毒性较低，是一种聚氧乙烯一聚氧丙烯一聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)三嵌段共聚物。利用泊洛沙姆与壳聚糖制备温敏性智能水凝胶，能够有效提高水凝胶的相容性和温度敏感性，具有给药方便的优点，且能够在较长时间内保持干细胞上清液的活性。

在一个具体的实施方案中，所述泊洛沙姆的添加量可以为15份、20份、25份。

在一些具体的实施方案中，所述泊洛沙姆的添加量还可以为(15-20)份、(20-25)份。

经过试验分析可知，当控制温敏性智能水凝胶中泊洛沙姆的添加量在上述范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将温敏性智能水凝胶中泊洛沙姆的添加量控制在上述范围内。

本申请中使用的壳聚糖具有较好的生物相容性、抗菌性和可生物降解性，用壳聚糖制备的水凝胶拥有许多独特的性能。但是，壳聚糖的分子链上分布着许多羟基、氨基及N-乙酰氨基，这些基团之间可形成分子间及分子内氢键，使得壳聚糖在有机溶剂、水以及碱中难以溶解。本申请选择使用乳酸水溶液来调节溶液的pH，使得在稀酸溶液中的壳聚糖分子链上的氨基进行质子化，分子内的氢键作用被破坏，从而促进了壳聚糖在溶液中的溶解，加快温敏性智能水凝胶的制备速度。

经过试验分析可知，相比选择使用透明质酸或者醋酸，本申请选择使用乳酸水溶液用于制备温敏性智能水凝胶，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请选择使用乳酸水溶液用于制备温敏性智能水凝胶。

在一个具体的实施方案中，所述乳酸水溶液的添加量可以为0.5份、1份、1.50份。

在一些具体的实施方案中，所述乳酸水溶液的添加量还可以为(0.5-1)份、(1-1.5) 份。

经过试验分析可知，当控制温敏性智能水凝胶中乳酸水溶液的添加量在上述范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将温敏性智能水凝胶中乳酸水溶液的添加量控制在上述范围。

在一个具体的实施方案中，所述干细胞上清液的添加量可以为73.5份、78份、84.5份。

在一些具体的实施方案中，所述干细胞上清液的添加量还可以为(73.5-78)份、(78- 84.5)份。

经过试验分析可知，当控制温敏性智能水凝胶中干细胞上清液的添加量在上述范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将温敏性智能水凝胶中干细胞上清液的添加量控制在上述范围。

优选地，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或者泊洛沙姆407。

进一步地，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆407。

经过试验分析可知，相比于选择采用泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237或者泊洛沙姆338，本申请选择采用泊洛沙姆407用于制备温敏性智能水凝胶，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请选择采用泊洛沙姆407用于制备温敏性智能水凝胶。

优选地，所述乳酸水溶液中乳酸的含量为10-15wt％。

经过试验分析可知，当控制温敏性智能水凝胶中乳酸水溶液中乳酸的含量为上述范围内，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将乳酸水溶液中乳酸的含量控制在上述范围。

优选地，所述干细胞上清液选自间充质干细胞上清液、脂肪干细胞上清液、胚胎干细胞上清液、神经干细胞上清液、室管膜神经干细胞上清液、造血干细胞上清液、肝造血干细胞上清液、骨髓干细胞上清液、产生胰岛细胞的干细胞上清液。

进一步地，所述干细胞上清液为间充质干细胞上清液。

本申请中，干细胞上清液是具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞。其中，间充质干细胞上清液是干细胞上清液家族的重要成员，属于多能干细胞上清液，在连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

进一步地，所述间充质干细胞上清液为间充质干细胞上清液。

在培养干细胞上清液的过程中，干细胞上清液会分泌500种以上的蛋白质成分，分泌液中富含细胞活性关键的信息传递物质，这种传递物质被称为细胞因子。间充质干细胞上清液的培养上清液，含有数百种细胞因子，对体内受到损伤的组织和细胞的功能恢复起到重要作用。

进一步地，所述间充质干细胞上清液中蛋白质的含量为1-3wt％。

在一个具体的实施方案中，所述间充质干细胞上清液中蛋白质的含量可以为1％、2％、 3wt％。

在一些具体的实施方案中，所述间充质干细胞上清液中蛋白质的含量还可以为1-2wt％、2-3wt％。

经过试验分析可知，当控制间充质干细胞上清液中蛋白质的含量在上述范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将间充质干细胞上清液中蛋白质的含量控制在上述范围。

第二方面，本申请提供了上述温敏性智能水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将所述壳聚糖加入至所述干细胞上清液中，边搅拌边滴加所述乳酸水溶液，得到壳聚糖溶液；

(2)取所述泊洛沙姆加入至所述干细胞上清液中，然后在搅拌条件下使得泊洛沙姆充分溶解，得到所述泊洛沙姆溶液；

(3)将所述泊洛沙姆溶液和所述壳聚糖溶液充分混合，得到所述温敏性智能水凝胶溶液；

(4)将所述温敏性智能水凝胶溶液置于温度为34-37℃的条件下，静置，得到所述温敏性智能水凝胶。

优选地，所述步骤(2)的搅拌条件为：转速为200-400r/min；温度为2-6℃。

优选地，所述步骤(3)的搅拌条件为：转速为200-400r/min；温度为2-6℃；时间为16-28h。

第三方面，本申请提供了上述温敏性智能水凝胶在智能给药系统的应用。

利用本申请提供的温敏性智能水凝胶，对小鼠模型皮肤损伤处进行喷涂给药，小鼠模型皮肤损伤愈合的效果明显提高，且在15天时，小鼠损伤处接近痊愈。因此，本申请制备的温敏性智能水凝胶能够逐渐释放间充质干细胞上清液，并能在较长时间内，保持间充质干细胞上清液的活性。

综上所述，本申请的技术方案具体以下效果：

本申请中，使用壳聚糖0.5-1.5份、泊洛沙姆15-25份、乳酸水溶液0.5-1.5份以及干细胞上清液73.5-84.5份作为温敏性智能水凝胶的原料，制备得到的温敏性智能水凝胶，成胶温度均在34-37℃，同时能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶时间，表明本申请的温敏性智能水凝胶在应用过程中能够快速实现凝固，从而能够有效避免药物的偏移，提高治疗效果。

本申请制备的温敏性智能水凝胶对小鼠模型皮肤损伤处进行喷涂给药，损伤愈合的效果明显提高，表明本申请制备的温敏性智能水凝胶能够逐渐释放间充质干细胞上清液，并能在较长时间内，保持间充质干细胞上清液的活性。

具体实施方式

本申请提供一种温敏性智能水凝胶，包含以下重量份的组分：壳聚糖0.5-1.5份；泊洛沙姆15-25份；乳酸水溶液0.5-1.5份；干细胞上清液73.5-84.5份。

其中，泊洛沙姆选自泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或者泊洛沙姆407。

进一步地，泊洛沙姆为泊洛沙姆407。

进一步地，乳酸水溶液中乳酸的含量为10-15wt％。

具体地，干细胞上清液选自间充质干细胞上清液、脂肪干细胞上清液、胚胎干细胞上清液、神经干细胞上清液、室管膜神经干细胞上清液、造血干细胞上清液、肝造血干细胞上清液、骨髓干细胞上清液、产生胰岛细胞的干细胞上清液。

进一步地，干细胞上清液为间充质干细胞上清液。

具体地，间充质干细胞上清液为间充质干细胞上清液。

进一步地，间充质干细胞上清液中蛋白质的含量为1-3wt％。

同时，本申请提供了上述温敏性智能水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将壳聚糖加入至干细胞上清液中，然后在室温下，置于转速为200-400r/min的磁力搅拌器上，边搅拌边滴加乳酸水溶液，使得壳聚糖充分溶解，得到壳聚糖溶液；

(2)取泊洛沙姆加入至干细胞上清液中，然后在温度为2-6℃的条件下，置于转速为200- 400r/min的磁力搅拌器上，搅拌30-60min后，使得泊洛沙姆充分溶解，得到泊洛沙姆溶液；

(3)将泊洛沙姆溶液和壳聚糖溶液充分混合，然后在温度为2-6℃的条件下，置于转速为 200-400r/min的磁力搅拌器上，搅拌16-28h后，得到温敏性智能水凝胶溶液；

(4)将温敏性智能水凝胶溶液置于温度为34-37℃的条件下，静置，得到温敏性智能水凝胶。

本申请提供了上述温敏性智能水凝胶在智能给药系统的应用。

以下结合制备例1-5、实施例1-21、对比例1-10以及性能测定试验对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

制备例

制备例1-5

制备例1-5分别提供了一种间充质干细胞上清液。

上述各制备例的不同之处在于：间充质干细胞上清液中蛋白质的含量。具体如表1所示。

上述各制备例的制备方法具体包括以下步骤：

(1)间充质干细胞上清液复苏：将冻存的间充质干细胞上清液从液氮中取出，并放入37℃水浴中快速融解；取1mL解冻后的细胞悬液缓慢加入10mL无血清培养基中；800rpm离心 5min，吸掉上清，加入10mL无血清培养基重悬细胞；将细胞均匀铺到培养皿中，置于5％CO

(2)间充质干细胞上清液培养：在超净台中，吸掉原有培养基，加入浓度为0.01moL/L、pH为7.4的PBS缓冲液清洗一次，加入10mL无血清培养基，置于5％CO

(3)间充质干细胞上清液的制备：取步骤(2)中制备的第5代间充质干细胞上清液，用无血清培养基培养，在培养瓶中长满80％时，再培养48h，收集上清液；并于 6000rpm、4℃的条件下离心20min，除去杂质；然后置于0℃冰水混合浴中，在搅拌条件下，缓慢加入6g硫酸铵固体，在30min内加完，之后在4℃层析柜中继续搅拌至完全溶解，在层析柜中静置12h，并于6000rpm、4℃的条件下离心10min，收集蛋白沉淀，加灭菌去离子水溶解定容至100mL，并用0.45μm滤膜过滤溶液，再用灭菌去离子水冲洗几次滤膜，以减少蛋白的损耗，最终蛋白滤液体积约为180mL。

(4)间充质干细胞上清液的纯化：利用葡聚糖G-25凝胶柱(5×60cm)连接AKTA 蛋白纯化仪对步骤(3)蛋白滤液进行纯化，用0.01moL/L、pH为7.4的PBS缓冲液作为洗脱剂，待紫外吸收值明显上升时，开始接收样品，直至不再有紫外吸收时，结束收集；将收集到的样品用0.22μm滤膜过滤，得到间充质干细胞上清液纯化液，并分装到西林瓶中，经 BCA法测定，所得纯化上清中的蛋白浓度为2.5wt％。

(5)间充质干细胞上清液的冻干：利用Christ冻干机将步骤(4)间充质干细胞上清液纯化液进行冻干，具体方法为：将样品快速降温至-40℃进行预冻，4h后，在-10℃退火，退火时间为20min；退火后，再将温度降低至-40℃，4h后，抽真空至0.1mbar；然后升温至 -25℃，16h之后升温至27℃维持6h，即得间充质干细胞上清液的冻干样品。

(6)将所得间充质干细胞上清液的冻干样品用灭菌去离子水溶解，制备得到蛋白质含量分别为1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％的间充质干细胞上清液。

其中，无血清培养基购买自上海埃泽思生物科技有限公司。

表1制备例1-5中间充质干细胞上清液中蛋白质的含量

实施例

实施例1-9

实施例1-9分别提供了一种温敏性智能水凝胶。

上述各实施例的泊洛沙姆为泊洛沙姆407；干细胞上清液为制备例3制备得到的间充质干细胞上清液。

上述各实施例的不同之处在于：温敏性智能水凝胶中各组分的添加量。具体如表2所示。

上述各实施例的制备方法具体包括以下步骤：

(1)原料灭菌：将壳聚糖，泊洛沙姆407置于高压灭菌锅内，于121℃灭菌20min，灭菌后备用；用0.22μm微孔滤膜过滤器将乳酸水溶液过滤除菌，然后置于高压灭菌锅内，于121℃灭菌20min，灭菌后备用。

(2)壳聚糖溶液的配置：将壳聚糖加入至干细胞上清液中，然后在室温下，置于转速为300r/min的磁力搅拌器上，边搅拌边滴加12wt％的乳酸水溶液，使得壳聚糖充分溶解，得到壳聚糖溶液。

(3)泊洛沙姆407溶液的配置：取泊洛沙姆加入至干细胞上清液中，然后在温度为4℃的条件下，置于转速为300r/min的磁力搅拌器上，搅拌30min后，使得泊洛沙姆充分溶解，得到泊洛沙姆溶液。

(4)温敏性智能水凝胶溶液的制备：将泊洛沙姆溶液和壳聚糖溶液充分混合，然后在温度为4℃的条件下，置于转速为300r/min的磁力搅拌器上，搅拌24h后，得到温敏性智能水凝胶溶液；此时，温敏性智能水凝胶溶液的pH为4.0。

(5)将温敏性智能水凝胶溶液置于温度为37℃的条件下，静置，得到温敏性智能水凝胶。

表2实施例1-9中温敏性智能水凝胶中各组分的添加量

实施例10-13

实施例10-13分别提供了一种温敏性智能水凝胶。

上述各实施例与实施例2的不同之处在于：温敏性智能水凝胶中泊洛沙姆的类型。如表3所示。

表3实施例2、10-13中泊洛沙姆的类型

实施例14-17

实施例14-17分别提供了一种温敏性智能水凝胶。

上述各实施例与实施例2的不同之处在于：温敏性智能水凝胶中间充质干细胞上清液的类型。如表4所示。

表4实施例2、14-17中间充质干细胞上清液的类型

实施例18-21

实施例18-21提供了一种温敏性智能水凝胶。

上述各实施例与实施例2的不同之处在于：温敏性智能水凝胶中乳酸水溶液中乳酸的含量。如表5所示。

表5实施例2、18-21中乳酸水溶液中乳酸的含量

对比例

对比例1-8

对比例1-8分别提供了一种温敏性智能水凝胶。

上述各对比例与实施例2的不同之处在于：温敏性智能水凝胶中各组分的添加量。具体如表6所示。

表6对比例1-8中温敏性智能水凝胶中各组分的添加量

对比例9

对比例9分别提供了一种温敏性智能水凝胶。

本对比例与实施例2的不同之处在于：使用含量为12wt％的透明质酸水溶液代替乳酸水溶液。

对比例10

对比例9分别提供了一种温敏性智能水凝胶。

本对比例与实施例2的不同之处在于：使用含量为12wt％的醋酸水溶液代替乳酸水溶液。

性能测定试验

一、温敏性智能水凝胶的成胶时间和成胶温度性能检测

以实施例1-21与对比例1-10提供的温敏性智能水凝胶为检测对象，测定上述温敏性智能水凝胶的成胶时间和成胶温度。

检测方法：(1)成胶时间：取2mL温敏性智能水凝胶溶液置于离心管中，放置于37℃的水浴中，每隔10s，将离心管倒置，观察水凝胶溶液是否流动，当水凝胶溶液不再流动时，记录温敏性智能水凝胶的成胶时间。

(2)成胶温度：取2mL温敏性智能水凝胶溶液置于离心管中，放置于不同温度 (34-38℃)的水浴中恒温1min，然后将离心管倒置，观察水凝胶溶液是否流动，当水凝胶溶液不再流动时，记录温敏性智能水凝胶的成胶温度。

检测结果：如表7所示。

表7实施例1-21与对比例1-10中温敏性智能水凝胶的成胶时间和成胶温度

结合表7，通过对比实施例1-21与对比例1-10的检测结果可知，本申请通过使用壳聚糖 0.5-1.5份、泊洛沙姆15-25份、乳酸水溶液0.5-1.5份、干细胞上清液73.5-84.5份，制备的温敏性智能水凝胶，成胶温度均在34-37℃，同时能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶时间，表明本申请的技术方案能够快速的实现温敏性智能水凝胶的凝固，从而在应用过程中，能够有效避免药物的偏移，提高治疗效果。

通过对比实施例2与对比例9-10的检测结果可知，相比选择使用透明质酸或者醋酸用于制备温敏性智能水凝胶，本申请选择使用乳酸水溶液用于制备温敏性智能水凝胶，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请选择使用乳酸水溶液用于制备温敏性智能水凝胶。

通过对比实施例1-3与对比例1-2的检测结果可知，当控制温敏性智能水凝胶中壳聚糖的添加量在0.5-1.5份的范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将温敏性智能水凝胶中壳聚糖的添加量控制在上述范围。

通过对比实施例2与实施例10-13的检测结果可知，相比于选择采用泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237或者泊洛沙姆338，本申请选择采用泊洛沙姆407用于制备温敏性智能水凝胶，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请选择采用泊洛沙姆407用于制备温敏性智能水凝胶。

通过对比实施例2、实施例4-5与对比例3-4的检测结果可知，当控制温敏性智能水凝胶中泊洛沙姆407的添加量在15-25份的范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将温敏性智能水凝胶中泊洛沙姆407的添加量控制在上述范围。

通过对比实施例2、实施例6-7与对比例5-6的检测结果可知，当控制温敏性智能水凝胶中乳酸水溶液的添加量在0.5-1.5份的范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将温敏性智能水凝胶中乳酸水溶液的添加量控制在上述范围。

通过对比实施例2、实施例8-9与对比例7-8的检测结果可知，当控制温敏性智能水凝胶中间充质干细胞上清液的添加量在73.5-84.5份的范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将温敏性智能水凝胶中间充质干细胞上清液的添加量控制在上述范围。

通过对比实施例2与实施例14-17的检测结果可知，当控制温敏性智能水凝胶中间充质干细胞上清液中蛋白质的含量为1-3wt％的范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将间充质干细胞上清液中蛋白质的含量控制在上述范围。

通过对比实施例2与实施例18-21的检测结果可知，当控制温敏性智能水凝胶中乳酸水溶液中乳酸的含量为10-15wt％的范围内时，能够有效降低温敏性智能水凝胶的成胶温度和成胶时间。因此，本申请将乳酸水溶液中乳酸的含量控制在上述范围。

二、温敏性智能水凝胶对小鼠模型皮肤损伤愈合的性能检测

以实施例2提供的温敏性智能水凝胶、制备例3提供的间充质干细胞上清液为检测对象，对小鼠模型皮肤损伤愈合的性能进行检测。

检测方法：选取重量为60±5g的小鼠，并且制备得到下肢缺血皮肤损伤的小鼠模型，皮肤损伤面积为0.6±0.1cm

检测结果：如表8所示：

表8小鼠模型皮肤损伤愈合的性能检测结果

结合表8，通过对比实施例2、制备例3以及对照组的小鼠模型皮肤损伤愈合性能检测结果可知，当间充质干细胞上清液的类型相同时，直接采用间充质干细胞上清液对小鼠模型皮肤损伤处进行喷涂给药时，愈合的效果较差；而采用本申请制备的温敏性智能水凝胶对小鼠模型皮肤损伤处进行喷涂给药，愈合的效果明显提高，且在15天时，小鼠损伤处接近痊愈。上述结果表明，本申请制备的温敏性智能水凝胶能够逐渐释放间充质干细胞上清液，并能在较长时间内，保持间充质干细胞上清液的活性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。