用于悬浮培养骨髓细胞的培养基、制备方法、应用和诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞的方法

摘要

本发明提供了一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基、制备方法、应用和诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞的方法，涉及细胞培养技术领域，本发明提供的用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，通过各特定组分的相互配合，能够实现骨髓源细胞的全悬浮培养，获得高质量的全悬浮细胞，同时高效促进骨髓源细胞增殖分化为巨噬细胞。并且，该培养基成分明确，成本可控，通过将不同功能的组分独立包装，还具有使用方便的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基、制备方法、应用和诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞的方法。

背景技术

巨噬细胞是机体的重要防御细胞，在吞噬、清除异物和调节血细胞生成及参与免疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用，同时对病毒分离、种毒扩繁、疫苗研发也有重要价值。研究发现，巨噬细胞对猪繁殖呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪圆环病毒(PCV)等多种病毒极易感，现已有报道将其应用于病毒分离、体外培养及相关疫苗生产。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是能够引起猪发病的一种高度接触性传染病，是影响全球养猪业最为严重的一种急性传染病，造成严重的经济损失。在PRRSV分离过程中，PAM细胞是PRRSV感染的主要靶细胞，由于PRRSV对该病毒具有较高的敏感性，大多数毒株均可适应，常被用作PRRSV的原代细胞分离和培养。原代肺泡巨噬细胞(PAM)和骨髓细胞是目前用来分离和培养该病毒的主要宿主，在肺泡巨噬细胞制备过程中发现，即使是SPF猪，由于呼吸系统处于开放状态，其猪肺脏存在未知微生物污染情况也较为严重，很难制备出合格的PAM细胞。相对而言，骨髓处于生理封闭状态，外界病原体污染轻微，是目前PRRSV病毒分离、ASFV疫苗培养较为理想的选择。但未分化的骨髓细胞培养病毒病毒滴度较低，而诱导分化后的髓系来源的单核-巨噬细胞，有利于提高病毒滴度。

目前有很多从组织和器官中进行分离、培养获得巨噬细胞的方式，但都极为不易。例如现有技术中利用新鲜制备的骨髓细胞静止诱导培养，诱导后的骨髓系细胞呈部分贴壁、部分漂浮生长，在培养过程中其操作繁琐、耗时耗力、效率低下、且生产成本较高。如何提高生产效率及产品质量、降低生产成本，提供高速、有效的骨髓细胞诱导分化，获得高度定向分化和增殖的巨噬细胞的方法至关重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的目的之二在于提供上述用于悬浮培养骨髓细胞的培养基的制备方法。

本发明的目的之三在于提供上述用于悬浮培养骨髓细胞的培养基在全悬浮培养骨髓源细胞和/或诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞的方法。

本发明提供了一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，包括独立包装的细胞培养液和M-CSF；

所述细胞培养液包含基础培养基、胎牛血清、剪切力保护剂、抗细胞结团剂和任选的L929细胞上清。

进一步的，所述剪切力保护剂为Pluronic F-68；

优选地，所述抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖；

优选地，所述基础培养基为DME/F-12或IMDM中的至少一种。

进一步的，所述细胞培养液还包含GM-CSF、抗生素、基础营养物质和缓冲物质中的一种或多种；

优选地，所述抗生素为青霉素和/或链霉素；

优选地，所述基础营养物质为L-谷氨酰胺；

优选地，所述缓冲物质为HEPES缓冲液。

进一步的，所述细胞培养液中含有胎牛血清10％～20％v/v、剪切力保护剂0.5～3g/L、抗细胞结团剂20～40mg/L，以及任选的GM-CSF5～50ng/mL、青霉素50～150U/ml、链霉素50～150μg/ml、L-谷氨酰胺2～2.50mM、10～20mM HEPES缓冲液和L929细胞上清10％～30％v/v；

优选地，所述细胞培养液中含有胎牛血清10％v/v、剪切力保护剂1g/L、抗细胞结团剂30mg/L，以及任选的GM-CSF 20ng/mL、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、L-谷氨酰胺2.50mM、15mM HEPES缓冲液和L929细胞上清20％v/v。

本发明还提供了上述的用于悬浮培养骨髓细胞的培养基的制备方法，向基础培养基中加入胎牛血清、剪切力保护剂和抗细胞结团剂，混合均匀后得到所述细胞培养液。

进一步的，向基础培养基中加入配方量的胎牛血清、剪切力保护剂、抗细胞结团剂、GM-CSF、抗生素、基础营养物质、缓冲物质和任选的L929细胞上清，混合均匀后得到所述细胞培养液。

本发明还提供了上述的用于悬浮培养骨髓细胞的培养基在全悬浮培养骨髓源细胞和/或诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞中的应用。

此外，本发明还提供了一种诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞的方法，所述方法包括采用上述的细胞培养液悬浮培养骨髓源细胞，然后添加M-CSF继续培养，诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞。

进一步的，在培养第3～5天将细胞培养液半换液，半换液后添加M-CSF；

可选地，在培养第3天和第5天分别半换液并添加M-CSF；

可选地，在培养第4天半换液并添加M-CSF；

优选地，所述M-CSF的添加量为5～50ng/mL，优选为20ng/mL；

优选地，所述骨髓源细胞的初始细胞密度为1.0～2.0×10

进一步的，采用生物反应器进行细胞培养；

优选地，所述生物反应器的参数包括转速30～50r/min、温度37℃、溶氧值40％～60％、pH值7.0～7.2、通气量50～300mL/min中的至少一种。

进一步地，所述培养方法包括如下步骤：

(a)取猪股骨、胫骨进行新鲜制备骨髓源细胞，利用细胞培养液重悬细胞，细胞密度按照1.0～2.0×10

(b)将细胞置于二氧化碳培养箱中培养7天，培养参数包括：温度37℃，5％CO

(c)在培养第四天，进行细胞半换液，之后添加5～50ng/mL M-CSF，继续培养。

与现有技术相比，本发明至少具备如下有益效果：

本发明提供的用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，通过各特定组分的相互配合，能够实现骨髓源细胞的全悬浮培养，获得高质量的全悬浮细胞，同时高效促进骨髓源细胞增殖分化为巨噬细胞。并且，该培养基成分明确，成本可控，通过将不同功能的组分独立包装，还具有使用方便的优点。

本发明提供的上述培养基的制备方法，工艺简单操作方便，有利于大规模生产。

本发明提供的诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞的方法，应用了本发明的用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，该方法能够有效诱导骨髓源细胞的定向分化和/或增殖，增殖量可高达3倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为本发明实验例1提供的实施例10的猪骨髓源细胞诱导7d后的细胞图片；

图1B为本发明实验例1提供的实施例6的猪骨髓源细胞诱导7d后的细胞图片；

图2为本发明实验例2提供的骨髓细胞诱导成单核-巨噬细胞的细胞图片(a)及荧光图片(b)；

图3为本发明实验例3提供的PAM病毒含量测定细胞图片(a有病变，b无病变)；

图4为本发明实验例3提供的PAM免疫荧光检测荧光细胞图片(a有病变，b无病变)。

具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，包括独立包装的细胞培养液和M-CSF；

所述细胞培养液包括基础培养基、胎牛血清、剪切力保护剂、抗细胞结团剂和任选的L929细胞上清。

将用于悬浮培养骨髓细胞的培养基中的细胞培养液和M-CSF分别进行独立包装，可根据实际培养情况灵活选择M-CSF的添加时机，有效提升骨髓细胞的全悬浮培养效率，且使用方便。

需要说明的是，本发明的细胞培养液中可以含有L929细胞上清，也可以不含有L929细胞上清，无论是否含有L929细胞上清均能够实现对骨髓细胞的分化。当培养目标偏向于细胞增殖时，选择混合有L929细胞上清的细胞培养液效果更佳。

其中，L929细胞为小鼠成纤维细胞株，培养L929上清液中含有较高浓度的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，能够诱导体外未分化的骨髓细胞向巨噬细胞分化，同时促进巨噬细胞增殖。

其中的细胞培养液通过各特定组分的相互配合，能够实现骨髓源细胞的全悬浮培养，获得高质量的全悬浮细胞。并且，该培养基成分明确，成本可控。

可选地，所述剪切力保护剂包括Pluronic F-68；

可选地，所述抗细胞结团剂包括硫酸葡聚糖；

可选地，所述基础培养基包括DME/F-12或IMDM中的至少一种。

在一些优选的实施方式中，所述细胞培养液还包括GM-CSF、抗生素、基础营养物质和缓冲物质中的一种或多种。

需要说明的是，所述细胞培养液中可以单独额外添加GM-CSF，或者额外添加抗生素，或者额外添加基础营养物质，或者额外添加缓冲物质，也可以添加上述三种物质中的任选两种，或者将上述三种物质全部加入细胞培养液中。当选择将上述三种物质全部加入细胞培养液中的实施方式时，效果最优。

其中，所述抗生素包括青霉素和/或链霉素；所述基础营养物质包括谷L-谷氨酰胺；所述缓冲物质包括HEPES缓冲液。

将特定组分赋予特定用量能够使其配合效果最大化，因此优选所述细胞培养液中含有胎牛血清10％～20％v/v、剪切力保护剂0.5～3g/L、抗细胞结团剂20～40mg/L，以及任选的GM-CSF 5～50ng/mL、青霉素50～150U/ml、链霉素50～150μg/ml、L-谷氨酰胺2～2.50mM、10～20mM HEPES缓冲液和L929细胞上清10％～30％v/v。

其中，所述胎牛血清的含量例如可以为，但不限于10％v/v、12％v/v、15％v/v、18％v/v或20％v/v，优选为10％v/v；所述剪切力保护剂的含量例如可以为，但不限于0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L，优选为1g/L；所述抗细胞结团剂的含量例如可以为，但不限于20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L或40mg/L，优选为30mg/L。以及，当细胞培养液中含有GM-CSF、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺或HEPES缓冲液中的任一种时，所述GM-CSF的添加量例如可以为，但不限于5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL或50ng/mL，优选为20ng/mL；所述青霉素的含量例如可以为，但不限于50U/ml、80U/ml、100U/ml、120U/ml或150U/ml，优选为100U/ml；所述链霉素的含量例如可以为，但不限于50μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml或150μg/ml，优选为100μg/ml；所述L-谷氨酰胺的含量例如可以为，但不限于1.50mM、2mM、2.50mM、3.0mM、3.5mM，优选为2.50mM；所述HEPES缓冲液的含量例如可以为，但不限于10mM、12mM、15mM、18mM或20mM，优选为15mM；所述L929细胞上清的含量例如可以为，但不限于10％v/v、15％v/v、20％v/v、25％v/v或30％v/v，优选为20％v/v。

根据本发明的第二个方面，本发明还提供了上述用于悬浮培养骨髓细胞的培养基的制备方法，包括依基础培养基中加入胎牛血清、剪切力保护剂和抗细胞结团剂，混合均匀后得到所述细胞培养液。

本发明提供的上述培养基的制备方法，工艺简单操作方便，有利于大规模生产。

在一些优选的实施方式中，向基础培养基中加入配方量的胎牛血清、剪切力保护剂、抗细胞结团剂、GM-CSF、抗生素、基础营养物质、缓冲物质和任选的L929细胞上清，混合均匀后得到所述细胞培养液。

具体地，可以包括如下步骤：

a、骨髓细胞培养选择DME/F-12作为基础培养基，同时加入2.5mM L-谷氨酰胺和15mM HEPES缓冲液。

b、在无菌条件下，向步骤(a)加入100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素；

c、在无菌条件下，向步骤(b)加入总体的15％胎牛血清(FBS)，混合均匀；

d、在无菌条件下，向步骤(c)加入剪切力保护剂为Pluronic F-68(1g/L),混合均匀；

e、在无菌条件下，向步骤(d)加入抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖(30mg/L)，混合均匀，得到所述细胞培养液。

本发明的第三个方面，基于本发明提供的用于悬浮培养骨髓细胞的培养基的有益效果，本发明还提供了该用于悬浮培养骨髓细胞的培养基在全悬浮培养骨髓源细胞和/或诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞中的应用。

需要说明的是，“和/或”指的是可以单独应用所述培养基中的细胞培养液用于全悬浮培养骨髓源细胞，或者单独应用所述培养基中的M-CSF用于诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞，或者联合使用所述培养基中的细胞培养液和M-CSF，实现在全悬浮培养骨髓源细胞时，诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞。

根据本发明的第四个方面，还提供了一种诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞的方法，包括采用上述的细胞培养液悬浮培养骨髓源细胞，然后添加M-CSF继续培养，诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞。

本发明提供的诱导骨髓源细胞分化为巨噬细胞的方法，应用了本发明的用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，该方法能够有效诱导骨髓源细胞的定向分化和增殖，增殖量可高达3倍。

在一些优选的实施方式中，在培养第3～5天将细胞培养液半换液，半换液后添加M-CSF；

可选地，在培养第3天和第5天分别半换液并添加M-CSF，也可以选择在培养第4天半换液并添加M-CSF。二者效果相当，为了节约时间和操作成本，优选在培养第4天添加。

其中，M-CSF的添加量为5～50ng/mL，例如可以为，但不限于5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL或50ng/mL。

为更好地促进悬浮培养时骨髓源细胞的增殖，优选设置骨髓源细胞的初始细胞密度为1.0～2.0×10

为更好地促进悬浮培养时骨髓源细胞的分化，优选在细胞培养液中添加5～50ng/mL GM-CSF后悬浮培养骨髓源细胞，添加量例如可以为，但不限于5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL或50ng/mL。

使生物反应器级联放大是当前生物制品生产的主流模式，因此为提高培养效率，在一些优选的实施方式中采用生物反应器进行细胞培养。

其中，所述生物反应器的参数包括转速30～50r/min，例如可以为，但不限于30r/min、35r/min、40r/min、45r/min或50r/min；温度37℃；溶氧值40％～60％，例如可以为，但不限于40％、45％、50％、55％或60％；pH值7.0～7.2，例如可以为，但不限于7.0、7.1或7.2；通气量50～300mL/min，例如可以为，但不限于50mL/min、100mL/min、150mL/min、200mL/min、250mL/min或300mL/min。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1

本实施例提供了一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，包括独立包装的细胞培养液和M-CSF；

所述细胞培养液包括DME/F-12、GM-CSF 20ng/mL、胎牛血清10％v/v、Pluronic F-68 1g/L、硫酸葡聚糖30mg/L、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、2.50mM L-谷氨酰胺、15mMHEPES缓冲液和L929细胞上清20％v/v。

实施例2

本实施例提供了一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，与实施例1的不同之处在于，所述细胞培养液包括DME/F-12、GM-CSF 50ng/mL、胎牛血清15％v/v、Pluronic F-683g/L、硫酸葡聚糖20mg/L、青霉素150U/ml、链霉素50μg/ml、2mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES缓冲液和L929细胞上清30％v/v。

实施例3

本实施例提供了一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，与实施例1的不同之处在于，所述细胞培养液包括DME/F-12、GM-CSF 5ng/mL、胎牛血清20％v/v、Pluronic F-680.5g/L、硫酸葡聚糖40mg/L、青霉素50U/ml、链霉素150μg/ml、2.50mM L-谷氨酰胺、10mMHEPES缓冲液和L929细胞上清10％v/v。

实施例4

本实施例提供了一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，与实施例1的不同之处在于，不含有青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺和HEPES缓冲液。

实施例5

本实施例提供了一种用于悬浮培养骨髓细胞的培养基，与实施例1的不同之处在于，不含有L929细胞上清。

实施例6-10

本实施例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，包括如下步骤：

A、取猪股骨、胫骨进行新鲜制备骨髓源细胞，分别利用实施例1-5提供的细胞培养液重悬细胞，细胞密度按照1.0～2.0×10

B、将细胞置于二氧化碳培养箱中培养7d，培养参数：温度37℃，5％CO2，>60％RH，100～120rpm@50mm orbital throw shaker；

C、在培养第四天进行细胞半换液，之后添加20ng/mL M-CSF；

D、继续培养，得到巨噬细胞。

实施例11

本实施例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于：M-CSF的添加量为5ng/mL。

实施例12

本实施例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于：M-CSF的添加量为50ng/mL。

实施例13

本实施例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于：不添加GM-CSF。

实施例14

本实施例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于：步骤C中不进行半换液。

实施例15

本实施例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于：在培养第3天和第5天分别进行细胞半换液，换液后添加20ng/mL M-CSF。

实施例16

本实施例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于：在培养第1天即添加20ng/mL M-CSF，第4天不再重复添加。

对比例1

本对比例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于细胞培养液中不含有胎牛血清。

对比例2

本对比例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于细胞培养液中不含有Pluronic F-68。

对比例3

本对比例提供了一种骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，与实施例6的区别在于细胞培养液中不含有硫酸葡聚糖。

实验例1

为了验证本发明提供的用于悬浮培养骨髓细胞的培养基及骨髓源细胞诱导成为巨噬细胞的摇瓶悬浮培养方法，将应用上述实施例6-16及对比例1-3提供的培养方法步骤D培养7天后，进行骨髓细胞增殖和分化的检测，结果如下表1所示：

其中，实施例10的猪骨髓源细胞培养7d，细胞形态变大变圆，漂浮细胞呈现树突状形态，刺激分化作用显著。诱导7d后细胞计数，诱导后的BM细胞并未出现细胞增殖现象，见图1A。

实施例6的猪骨髓源细胞诱导7d后细胞计数，诱导后的BM细胞出现3倍的细胞增殖现象，见图1B。

实验例2诱导分化的骨髓细胞免疫荧光检测

1、取出实施例6诱导得到的BM细胞及未诱导的BM细胞铺至96孔上，2000rpm 5min离心，弃液；

2、用4％多聚甲醛，室温固定10min，晾干，PBST洗；

3、用3％的Triton穿透细胞，室温10min，PBST洗；

4、用1％PBA封闭，37℃20min，PBST清洗；

5、加入一抗鼠源MAC387，37℃孵育2h，PBST清洗；

6、避光加二抗(抗鼠)，37℃下孵育1h，PBST清洗。

7、在荧光倒置显微镜观察，结果见图2。

从图中可以看出95％以上细胞产生特异性荧光，说明骨髓细胞诱导后产生大量的巨噬细胞。

实验例3猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒NADC30毒株在摇瓶悬浮细胞系上的传代驯化及病毒含量测定

贴壁细胞制备的NADC30种毒在实施例6-16及对比例1-3培养得到的悬浮细胞上连续驯化3代，接毒剂量为0.01、0.02、0.05MOI、分别在接毒12h、24h、36、48、60、72、84、96小时取样，其中培养参数：温度37℃，5％CO2，>60％RH，100～120rpm@50mm orbital throwshaker，培养72小时病毒含量如下表2所示：

由以上数据说明，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒对本方法培养得到的巨噬细胞系敏感性好，应用本发明提供的培养工艺得到的悬浮细胞系均可作为后续工艺放大生产用候选细胞株，完成了猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒在悬浮细胞系上的适应性传代驯化。

利用肺泡巨噬细胞(PAM)对接毒后的样品进行病毒含量测定，具体操作如下：

①利用RPMI-1640+4％FBS培养液按照1.0～1.5×10

②24h，对病毒样品利用细胞培养液进行作10倍连续递增系列稀释(稀释度从10

③同时设立病毒对照和正常细胞对照。将96孔细胞培养板置37℃恒温培养箱中培养5日，观察细胞病变，用Reed–Muench法计算病毒半数组织细胞感染量(TCID50)。

④结果显示，病毒对照组全部出现以细胞破碎、脱落为特征的细胞病变，细胞对照组正常无细胞病变出现，结果图3。

对已测过病毒含量的孔板进行免疫荧光检测，步骤如下：

①用80％预冷丙酮固定10分钟后，PBST清洗3次；

②加入猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗(1:1000)，37℃下孵育1小时，PBST清洗3次。

③加抗鼠FITC二抗(1:200)，37℃下孵育1小时，PBST清洗3次。最后每孔加入50μlPBST。

④用倒置荧光显微镜观察，病毒与阳性血清发生特异性抗原抗体反应，加入荧光二抗后，视野下出现明显的特异性荧光，空白对照孔无荧光，结果图4。

表3不同收毒时间的病毒含量测定结果(单位：log10TCID

从上述结果中可以看出PRRSV病毒能够利用诱导后得到的巨噬细胞进行病毒扩繁。

病毒的接种剂量将会影响到最终的病毒含量，随病毒接种剂量由0.01MOI增加到0.05MOI，最终的病毒含量从10

不同病毒收毒时间将会直接影响到最终病毒含量，随培养时间的增加，呈现先增后减的趋势，本发明病毒最佳收毒时间为72h。

实验例4生物反应器工艺开发——2.5L、5L激流式生物反应器实验设计及实验方法

1、2.5L、5L反应袋细胞悬浮培养

取猪股骨、胫骨进行新鲜制备骨髓源细胞，以1.0×10

2、NADC30病毒接种、培养及收获

将反应袋中的细胞密度调整至1.0×10

3、反应袋接毒培养结果

5L、50L反应袋的细胞在接毒后72小时的病毒含量可以达到10

表4 5L反应器培养种毒病毒含量测定结果(单位：log10TCID

从上述结果中可以看出病毒扩大培养工艺2.5L反应器培养与5L反应器培养得到的病毒含量均在10

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。