一种高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利中杂质的方法

摘要

本发明提出的是一种高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利中杂质(2S,3aS,7aS)‑八氢‑1H‑吲哚‑2‑羧酸的方法，配制精氨酸培哚普利供试品溶液和待测杂质对照溶液，分别注入液相色谱仪，采用反相高效液相色谱法按等度进行洗脱，得到色谱图并计算杂质含量。本发明可定量检测杂质(2S,3aS,7aS)‑八氢‑1H‑吲哚‑2‑羧酸，从而使本发明可有效控制该杂质，对于精氨酸培哚普利的质量控制有着不可或缺的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利中杂质(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸的方法，属于化学检测分析技术领域。

背景技术

精氨酸培哚普利为第三代血管紧张素转换酶抑制剂，服后6小时降压效果最大，作用持续时间长，培垛普利可扩张大、小动脉，减少血容量，降低系统血管阻力、左室充盈压和肺毛细血管楔压，增加心排血量和每搏输出量，增加心脏指数而不改变心率，提高患者运动耐量，减轻左室心肌肥厚，改善血流动力学。本品耐受性好，不引起高血糖，对血脂亦无不良影响。培哚普利服后对ACE的抑制较其他ACE抑制剂起效慢，对ACE的抑制率达90%以上，服后1小时起效，3～4小时达最大药理效应，维持24小时。

2018年4月28日，复方制剂（FDC）精氨酸培哚普利10mg/氨氯地平5mg（开素达®）正式获国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准上市。精氨酸盐的加入使培哚普利的保存稳定性增加了约50%。在疗效方面，培哚普利与氨氯地平机制互补，具有协同发挥降压疗效的优势，是降压治疗的“黄金搭档”。培哚普利/氨氯地平FDC半衰期长达30小时，长效作用可以覆盖全天血压。培哚普利/氨氯地平这一组合的心血管益处已经被ASCOT、EUROPA-CCB等大型临床研究证实，其在降低全因死亡、心血管死亡、总冠脉事件、卒中、新发糖尿病以及肾损伤风险方面均表现出临床优势。

该原料药的杂质(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸，结构如下：

该杂质作为精氨酸培哚普利合成中间体，在中国药典、欧洲药典、进口原料标准等相关文献标准中均采用薄层色谱法控制，其限度控制0.25%，但由于薄层色谱法作为一种定性检查方法，尚无法达到准确定量检测杂质含量的效果。为保证精氨酸培哚普利制剂研发和生产的质量，需要对原料药的有关物质进行控制。

发明内容

本发明的目的在于解决现有精氨酸培哚普利药品制备和质量检测过程中存在的上述问题，提出一种高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利中杂质(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸的方法。

本发明的技术解决方案：一种高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利中杂质(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸的方法，具体包括如下步骤：

1）供试品溶液的配制：取精氨酸培哚普利，精密称重，放置于量瓶中，加入流动相进行溶解并稀释成每1mL中含有10mg精氨酸培哚普利的溶液，作为供试品溶液。

2）对照溶液的配制：取(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸，精密称重，放置于量瓶中，加入流动相进行溶解并稀释成每1mL中含有0.025mg(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸的溶液，作为对照品溶液。

3）高效液相色谱检测：

液相色谱仪采用反相高效液相色谱法按等度进行洗脱，流动相为离子对水溶液与极性有机溶剂，离子对水溶液为A相，极性有机溶剂为B相，A相与B相的混合体积比例为0～100%；其中A相离子对水溶液采用的离子对试剂中的离子对为挥发性有机酸，包括乙酸、三氟乙酸、甲酸中的一种或多种，其纯度为色谱纯，pH值为1～3； B相采用的极性有机溶剂为甲醇。

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以离子对试剂：甲醇（70：30）作为流动相，流速1.0ml/min，柱温为40℃，用蒸发光散射检测器进行检测。精密量取供试品溶液与对照品溶液各30µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与对照品溶液色谱图中保留时间一致的色谱峰，按下面公式计算杂质含量：

式中：AR

与现有技术相比，本发明可定量检测杂质(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸，从而使本发明可有效控制该杂质，对于精氨酸培哚普利的质量控制有着不可或缺的意义。本发明对(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸的结构特征进行分析，同时通过紫外光谱扫描等辅助实验，总结出相关文献标准中不采用高效液相色谱法主要是因为(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸无强共轭结构，在紫外光谱中的吸收不强，影响到杂质在成品中的检出。因此本发明采用蒸发光散射检测器对本品中的(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸进行检测，可以消除紫外吸收弱带来的限制，进一步严格控制该杂质在本品中的限度。从提高产品质量、提高临床用药安全性、优化工艺流程角度，本发明均有着较为突出的商业化价值，并能在企业标准中形成技术壁垒，提高企业产品的附加值。

附图说明

附图1是本发明实施例中方法摸索流动相比例过程中得到的各数据色谱图。

附图2是本发明实施例中采用方法2得到的色谱图。

附图3是本发明实施例中空白溶剂干扰检测色谱图。

具体实施方式

下面根据实施例进一步说明本发明的技术方案。在本说明书的描述中，各实施例的内容意指结合其描述的具体技术特征包含于本发明的至少一个实施方式中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体技术特征可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。

针对杂质(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸，作为精氨酸培哚普利的起始物料，该化合物无明显紫外吸收，已有的文献标准中均采用薄层色谱法进行检查，用碘蒸气显色，做限量检查。查询文献并结合实验经验，对于没有明显紫外吸收的物质，可采用蒸发光散射检测器进行检测。

本发明创造性地摸索了流动相体系，采用离子对试剂增强杂质的分离效果，调整流动相比例，优化了样品处理方法，最终确立了本发明所述的高效液相色谱体系，并进行了方法学验证。

（1）检测条件的摸索

根据设备提供的如下溶剂条件设置表：

本方法拟选择甲醇水体系，通过比例计算，漂移管温度设定在80-110℃，气体流量设定在2.8-3.2L/min。

（2）流动相的摸索

附图1是摸索流动相比例过程中得到的各数据色谱图。其中，数据1、数据4为初期摸索流动相比例的图谱，因保留时间不合适不再做进一步摸索；数据2、数据3为进一步摸索调整流动相以获得合适的峰型、保留时间，总结出以下2种方法：

方法1：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Superspher®60RP-8endcapped ；4μm；25cm×4mm）；

流动相：0.05%三氟乙酸溶液-甲醇（70：30）；

流速：1.0ml/min；

漂移管温度：100℃；

气体流量：3.0L/min；

柱温：40℃；

计算方式：外标法。

方法2：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Superspher®60RP-8endcapped ；4μm；25cm×4mm）；

流动相：0.1%离子对溶液-甲醇（70：30）；

流速：1.0ml/min；

漂移管温度：105℃；

气体流量：3.1L/min；

柱温：40℃；

计算方式：外标法。

方法1和方法2的检测结果相关数据如下表所示：

由结果可见，相较于方法1，方法2有更好的峰型（理论板数提高近20%）、拖尾因子更接近1.0、更合适的保留时间（保留时间在10-20分钟内，适宜于杂质的检出并与其他有可能的杂质分离），确认方法2的效果更好，结果见附图2。

（3）方法学验证

1）专属性

可接受的标准：空白溶剂应无干扰。

验证结果：溶剂不干扰立体(2S,3aS,7aS)-八氢-1H-吲哚-2-羧酸的测定，如图3所示。

2）进样精密度

可接受的标准：重复进样6次峰面积和保留时间的RSD%不大于2。

验证结果：实验结果表明，供试品、对照及系统适用性溶液连续进样6针，保留时间和峰面积的RSD均小于2.0%，本方法进样精密度良好；定量限浓度溶液连续进样6针，保留时间和峰面积的RSD均小于2.0%，定量限进样精密度度良好。

3）检测限

可接受的标准：信噪比（S/N）为≈3时相应的浓度为检测限，信噪比（S/N）为≈10时相应的浓度为定量限。

验证结果：检测限约为0.5μg/ml（百分占比为0.025%）。本方法灵敏度良好，满足检测需要。

4）线性与范围

可接受的标准：线性回归的相关系数r不低于0.995。

验证结果：本品在0.0010～0.0102mg/ml浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

5）溶液稳定性

可接受的标准：样品放置前后主峰峰面积RSD%不大于2。

验证结果：实验结果表明，供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，在室温条件下放置18小时稳定。

6）重复性

可接受的标准：限度浓度附近的杂质6次测定的单个杂质含量及回收率结果的RSD%不大于2。

验证结果：实验结果表明，对同一批样品平行测定6次，未检出超过定量限的异构体，保留时间和峰面积的RSD较小。本方法重复性良好。

7）耐用性

可接受的标准：改变条件后检测，各个条件下的主峰与异构体分离度符合规定，异构体的检测含量变化不明显。

验证结果：当流速相对值变动±10%、柱温变动±5℃、检测波长变动±5nm、流动相中有机相比例变动±2%时，系统适用性、检测结果均无显著变化。本方法耐用性良好。

验证结果表明本方法的各项指标均符合中国药典2020年版的要求，适宜于检测。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。