一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的方法及试剂盒，该方法包括如下步骤：S1、石蜡包埋组织切片制备；S2、向石蜡包埋组织切片添加细胞裂解液、蛋白酶K溶液、液体石蜡；S3、根据核酸提取程序，向S2的体系中添加超顺纳米磁珠、清洗液及洗脱液；S4、核酸提取；S5、提取完成。一般情况下，液体石蜡不作为石蜡包埋组织核酸提取试剂的组分。本发明使用液体石蜡作为萃取剂使用，可将融化后固体石蜡萃取到液体石蜡中并混合，从而降低石蜡融点，使其在冷却时保持石蜡处于液体状态，利于后续核酸提取自动化操作。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的方法及试剂盒。

背景技术

福尔马林固定石蜡包埋组织作为一种最为方便的临床材料来源，常被用于肿瘤病例的研究和诊断。以石蜡组织切片为材料进行分子水平的基因检测和筛查己成为临床诊断及相关研究的常规手段。从石蜡包埋组织中提取核酸是临床病例日常工作，目前常用的石蜡样本核酸提取试剂盒采用的是二甲苯或其他脱蜡液脱蜡，蛋白酶消化蛋白释放核酸，然后利用核酸纯化柱过柱法或利用纳米磁珠法纯化得到核酸。

但目前检验实验室所用方法，无论是利用核酸纯化柱过柱法或是利用纳米磁珠法纯化，因为脱蜡操作步骤以及脱蜡液的清洗难以舍弃，均无法在自动化设备有效地进行全流程操作。究其原因主要为包埋用石蜡在冷却状态下易于凝固及脱蜡液需要反复清洗造成。因无法达到真正高效自动化，造成石蜡包埋组织核酸提取过程费时、费力且容易造成操作重复性偏差的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的方法，解决现有石蜡包埋组织切片DNA提取技术中存在的难以自动化、操作时间长、人员要求高等缺点。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的方法，该方法包括如下步骤：

S1、石蜡包埋组织切片制备：将石蜡包埋组织放在石蜡切片机上进行切片，获取片厚为3～15μM组织切片；将切片组织漂浮于摊片机内的45℃±5℃温水上，将组织展平，并用载玻片将待提取的组织捞起，放入烘箱中烘烤，待水分烘干后取出，得到待测石蜡包埋组织切片；

S2、向石蜡包埋组织切片添加细胞裂解液、蛋白酶K溶液、液体石蜡；

S3、根据核酸提取程序，向S2的体系中添加超顺纳米磁珠、清洗液及洗脱液；

S4、放置自动化核酸提取仪(磁珠法)中，设定核酸提取程序，开始核酸提取自动操作；

S5、提取完成，使用含提取产物的洗脱液进行下一步操作，或转移至无酶保存管中保存。

一般情况下，液体石蜡不作为石蜡包埋组织核酸提取试剂的组分。本发明使用液体石蜡作为萃取剂使用，可将融化后固体石蜡萃取到液体石蜡中并混合，从而降低石蜡融点，使其在冷却时保持石蜡处于液体状态，利于后续核酸提取自动化操作。

作为优选，S2步骤所述细胞裂解液含有浓度为2-5M的盐酸胍或异硫氰酸胍，细胞裂解液的pH值为6.0-7.5。

作为优选，S2步骤所述液体石蜡的体积用量为600μL至900μL/600μL细胞裂解液。

作为优选，步骤S4所述核酸提取程序为：

作为优选，S3超顺纳米磁珠是硅羟基超顺纳米磁珠，粒径大小为100-300nm。

作为优选，S3所述的清洗液由清洗液1和清洗液2组成，其中，清洗液1由16μL0.5MTris、4.7mgNaCl、300μL无水乙醇、180μL纯化水组成，清洗液2由500μL75％(体积)乙醇组成。

作为优选，S3所述的洗脱液为TE缓冲液。

一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的试剂盒，该试剂盒包括：600μL含有浓度为2-5M的盐酸胍或异硫氰酸胍、pH值为6.0-7.5的细胞裂解液，20μL20mg/mL蛋白酶K溶液，

600μL至900μL液体石蜡；

由16μL0.5M Tris、4.7mgNaCl、300μL无水乙醇、180μL纯化水组成的清洗液1，由500μL75％(体积)乙醇组成的清洗液2。

作为优选，细胞裂解液由300μL4-5M盐酸胍或异硫氰酸胍和300μL异丙醇混匀配制而成。

相对于现有石蜡包埋组织核酸提取技术，本发明的有益效果在于：

1、无需脱蜡和脱蜡液的清洗操作；

2、核酸提取纯化过程易于自动化操作，降低了对操作人员的要求，提高了提取效率及提取重复性；

附图说明

图1为本发明石蜡包埋组织切片DNA全自动提取流程示意图；

图2为肺癌石蜡包埋组织切片全自动提取的DNA(本发明)进行荧光PCR检测扩增曲线图；

图3为肺癌石蜡包埋组织切片DNA常规方法(外购商品试剂)提取的DNA进行荧光PCR检测扩增曲线图；

图4为大肠癌石蜡包埋组织切片全自动提取的DNA(本发明)进行荧光PCR检测扩增曲线图；

图5为大肠癌石蜡包埋组织切片DNA常规方法(外购商品试剂)提取的DNA进行荧光PCR检测扩增曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

外购商品试剂：

硅羟基修饰超顺纳米磁珠，粒径大小为150nm，购自苏州为度生物技术有限公司；

石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒(离心柱型)，北京百泰克生物技术有限公司。

实施例1

一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的方法，该方法的工艺流程图如图1所示，具体步骤是：

1、核酸提取纯化试剂制备

(1)细胞裂解液的制备

每人份细胞裂解液由300μL4-5M异硫氰酸胍缓冲液和300μL异丙醇混匀配制而成，pH值为7.3±0.2。

(2)清洗液1的制备

每人份清洗液1由16μL0.5M Tris、4.7mgNaCl、300μL无水乙醇、180μL纯化水组成。

(3)清洗液2的制备

每人份清洗液2由500μL75％乙醇组成。

(4)洗脱液的制备

每人份洗脱液由100μL TE缓冲液组成。

(5)各组分试剂分装至96孔板

2、核酸提取

取5例肺癌石蜡包埋组织和5例大肠癌石蜡包埋组织，进行如下三组处理：

(1)将石蜡包埋组织放在石蜡切片机上进行切片，获取片厚为5μM组织切片；将切片组织漂浮于摊片机内的温水上，将组织展平，并用载玻片将待提取的组织捞起，放入烘箱中烘烤，待水分烘干后取出。

每例样本制备4张切片。

(2)处理组-自动提取组(本发明方法)

将两片石蜡切片转移入裂解液孔中，加入蛋白酶K溶液20μL(20mg/mL)；

加入液体石蜡600μL至裂解液孔中。

在适配的自动核酸提取纯化仪(杭州奥盛Pure-32A)中放入预封板，装上磁针套启动设备，进入实验配置界面后，设置提取程序(见表1)。

表1本次提取程序设置

启动程序，开始核酸提取操作。提取完成后核酸转移入无酶离心管中；

利用紫外分光光度计测定每个提取产物的核酸浓度和纯度。

(3)对照组-半自动提取组(商品化试剂)

向装有FFPE组织的离心管内加入1ml二甲苯，漩涡振荡混匀，50℃温育3min融解石蜡；

室温下将样品以10,000g离心2min，小心吸弃二甲苯；

加入1ml无水乙醇，漩涡振荡10秒。室温10,000g离心2min。小心吸弃乙醇。注意不要吸取出FFPE组织碎片；

再次加入1ml无水乙醇，漩涡振荡10秒；室温10,000g离心2min。小心吸弃乙醇；短暂高速离心，尽量吸弃残余乙醇；

将离心管盖打开，于室温或37℃放置10～15min，晾干残余乙醇。

加入200μL消化液、20μL蛋白酶K，漩涡振荡10秒，重悬已脱蜡的FFPE组织切片；

置于56℃水浴中温育1～3小时，期间不时振荡，当组织切片完全裂解消失后，即可进行下述操作；并不会影响DNA提取。

转入90℃水浴中静置温育1小时；

短暂离心收集管内液体，平衡至室温。将溶液转移至预封板(8T/盒)第2列和第8列裂解液位置，进行提取操作。

在适配的自动核酸提取纯化仪(LunAmple X48)中放入预封板，装上磁针套启动设备，进入实验配置界面后，设置提取程序：

步骤1：命名步骤(转移磁珠)；工作位置1，工作体积900ul，运动模式2(次数1，时间10s)；

步骤2：命名步骤(裂解LB)；工作位置2，工作体积700ul，运动模式3(磁珠混匀：次数2，时间600s，速度中速；磁珠吸附：次数1，时间10s)，此步温度设置为65℃；

步骤3：命名步骤(Wash1)；工作位置1，工作体积900ul，运动模式3(磁珠混匀：次数1，时间180s，速度快速；磁珠吸附：次数1，时间5s)；

步骤4：命名步骤(Wash2)；工作位置3，工作体积900ul，运动模式3(磁珠混匀：次数1，时间180s，速度快速；磁珠吸附：次数1，时间5s)；

步骤5：命名步骤(Wash3)；工作位置4，工作体积500ul，运动模式3(磁珠混匀：次数1，时间180s，速度快速；磁珠吸附：次数1，时间5s)；

步骤6：命名步骤(Wash4)；工作位置5，工作体积500ul，运动模式3(磁珠混匀：次数1，时间180s，速度快速；磁珠吸附：次数1，时间5s)；

步骤7：命名步骤(洗脱EB)；工作位置6，工作体积50ul-100ul，运动模式3(动作延迟180s，磁珠混匀：次数1，时间600s，速度快速；磁珠吸附：次数2，时间10s)，此步温度设置为65℃；

步骤8：命名步骤(结束)；工作位置3，工作体积600uL，运动模式4。

启动程序，开始核酸提取操作。提取完成后核酸转移入无酶离心管中；

利用紫外分光光度计测定每个提取产物的核酸浓度和纯度。

3、配制人EGFR基因检测试剂(荧光PCR法)

(1)按照表2配制PCR反应液：

表2 PCR反应液

(2)分装PCR反应液

将PCR反应液，按照20μL/反应，分装至PCR管中。

(3)核酸添加

按照5μL/样本，将提取得到的核酸加入到PCR管中，盖上盖子后震荡混匀，瞬时离心待上机。

4、上机检测

将PCR管放入荧光PCR仪中，进行荧光PCR扩增，检测程序：50℃持续2min；95℃持续1min；(95℃持续10s；60℃持续31s并采集荧光)40个循环。设备检测程序运行完成后，观察扩增曲线图，读取Ct值；

5、检测结果

各处理组检测结果(荧光曲线Ct值)如表3和表4及图2-图5所示。图2为肺癌石蜡包埋组织切片全自动提取的DNA(本发明)进行荧光PCR检测扩增曲线图；图3为肺癌石蜡包埋组织切片DNA常规方法(石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒(离心柱型)，北京百泰克)提取的DNA进行荧光PCR检测扩增曲线图；图4为大肠癌石蜡包埋组织切片全自动提取的DNA(本发明)进行荧光PCR检测扩增曲线图；图5为大肠癌石蜡包埋组织切片DNA常规方法(石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒(离心柱型)，北京百泰克)提取的DNA进行荧光PCR检测扩增曲线图。

表3提取产物浓度和纯度测定

表4荧光PCR检测结果Ct值

对表3进行分析，可见石蜡包埋组织切片DNA全自动提取方法(本发明)，与常规提取方法(脱蜡后提取)相比，所提取的核酸在纯度上无显著差异，但在浓度上本发明的方法略优于常规提取方法(脱蜡后提取)。对表4和图2-5所显示的荧光PCR检测结果看，也得到一样的结论。

实施例2试剂盒

一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的试剂盒，该试剂盒组成为：

600μL pH值为7.0的细胞裂解液，

20μL20mg/mL蛋白酶K溶液，

600μL液体石蜡；

由16μL0.5M Tris、4.7mgNaCl、300μL无水乙醇、180μL纯化水组成的清洗液1，由500μL75％(体积)乙醇组成的清洗液2。

细胞裂解液由300μL 5M异硫氰酸胍和300μL异丙醇混匀配制而成。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

以上对本发明所提供的一种石蜡包埋组织切片DNA全自动提取的方法及试剂盒进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。