一种脂肪酶-聚合物偶联物的制备方法及其在结构脂质转酯化上的应用

摘要

本发明公开了一种脂肪酶‑聚合物偶联物的制备方法及其在结构脂质转酯化上的应用。制备聚合引发剂，与脂肪酶表面赖氨酸氨基残基共价连接获取脂肪酶引发剂，聚合物单体在引发剂主链进行ATRP聚合，获得脂肪酶‑聚合物偶联物。以蚕蛹油与油酸为底物，脂肪酶‑聚合物偶联物为催化剂，高效制备富含不饱和脂肪酸的结构脂质。本发明可以解决蚕桑产业资源利用的问题，开发高附加值食品添加产品，有望产生良好的经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于聚合物固定化脂肪酶酶技术领域，具体涉及一种脂肪酶-聚合物偶联物的制备方法及其在结构脂质转酯化上的应用。

背景技术

合理的油脂摄入量和甘油三酯中平衡的脂肪酸组成比例是衡量人们食用油脂是否健康营养的两个主要方面。近年来，人们开始研究一种新的脂类，期望其既具有天然油脂理化特性和生理功能，热量又较低，不会给人的健康带来危害，更能在营养健康及医疗保健上发挥作用——结构脂质应运而生（International Journal of Food Sciences &Nutrition, 2016, 67(3): 288-297.）。不饱和脂肪酸是人体健康所必须的，目前从食物中获取已渐渐不能满足人们的需求。在我国，蚕蛹是一种天然的农副产品，资源丰富，年产量可达到30余万吨，占全球总产量的80%以上（蚕业科学, 2017, 43(4): 9.）。蚕蛹油中不饱和脂肪酸占总脂肪酸比重高达70%，其中α-亚麻酸约占32.79%（Food & Function, 2021,12: 2428-2441.）。因此，蚕蛹油是一种油脂的不饱和脂肪酸脂质来源，可用于合成功能性结构脂质，用于治疗高胆固醇、高脂血症等与脂代谢有关的疾病。

结构脂质主要存在两种制备方法：化学催化法和酶促催化法。化学催化剂缺乏立体选择性，不能有效地合成结构化脂质；而生物催化能够弥补化学方法的差异，其优势主要体现在酶的定向催化。脂肪酶作为底物和改性油脂之间最重要的关联物，其活性、稳定性、立体专一性及可获得性成为决定商业酶法改性的关键因素（化学与生物工程, 2017, 34(12): 4.）。已有研究利用脂肪酶 Lipozyme TL IM催化酯交换樟树籽仁油制备中链结构脂质，能够快速提供能量并降低体内脂肪堆积（中国油脂, 2020(1):22-26.）。然而，游离脂肪酶不稳定、不能回收再利用，限制了它的工业应用。酶的固定化能显著提高脂肪酶的稳定性，并能使酶重复使用，降低了脂肪酶生产使用成本，在工业生产中有很好的应用前景。

近年来，已报道了一系列用于酶固定的材料，如壳聚糖颗粒、金属有机骨架和磁性纳米颗粒。发明CN 107937387 B使用纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，提高了脂肪酶的稳定性与重复利用次数。然而，由于固体支持物的存在，酶的扩散受到限制，且载体价格较为昂贵。目前，以聚合物为载体对脂肪酶进行固定的方法广受关注，发明CN201910049847.1公开一种聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，使用聚合物为载体，降低载体成本，并将聚合物的环境敏感性带给脂肪酶，然而，这种固定化方法依然存在载体对酶与底物的接触阻碍问题，使酶的催化效率受到影响。近年来，一种无载体固定化酶技术受到了更多人的关注。通过交联剂将酶分子与酶分子连接，既能使酶蛋白保持催化活性，又便于收集重复使用（Biochemical Engineering Journal. 2021, 171: 18025.）。与有载体的固定化酶相比，无载体固定化酶有许多优势：省略了载体固定化酶中的昂贵载体，成本大大降低；去除了无催化活性的载体，增加了固定化酶中生物酶蛋白的相对含量；无载体固定化酶普遍颗粒比较小，更容易在体系中均匀分散，其增加了固定化酶的比表面积，也增强了底物和产物在反应体系中的扩散能力，进而提高了酶活（Catalysts, 2019, 9(2): 164.）。目前，利用聚合物偶联法无载体固定化脂肪酶用于蚕蛹油原料制备结构脂的研究尚未开展。

发明内容

针对上述待解决技术问题，本发明提供一种脂肪酶-聚合物偶联物的制备方法及其在结构脂质转酯化上的应用，该方法提高了脂肪酶稳定性、重复利用次数，解决游离脂肪酶在实际应用中稳定性差，易失活，重复利用性能差的问题。并应用于蚕蛹油的功能性结构脂质改造，生产含多不饱和脂肪酸的功能性结构酯，促进了蚕蛹油高附加值产品的开发，推动了蚕桑资源的多元化利用。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种脂肪酶-聚合物偶联物的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤1，将

步骤2，将引发剂与脂肪酶溶于缓冲液中，在1~25℃环境下充分搅拌，使引发剂连接到脂肪酶的残基位点，得到脂肪酶引发剂大分子；

步骤3，将脂肪酶引发剂大分子，聚合物单体，催化剂1及催化剂2按照摩尔比1：（20~500）：（1~1.5）：（1.5~2.5）于水溶液中，氮气去氧条件下反应，超滤或透析去除未反应物，最后冷冻干燥获得脂肪酶-聚合物偶联物固体粉末。

优选的是，步骤1中所述

优选的是，步骤2中所述脂肪酶为Lipase D，Lipozyme TL IM，Lipozyme RM IM 或Novozym 435中的至少一种。

优选的是，步骤2中所述引发剂与脂肪酶的摩尔比为（3~7）：1，缓冲液浓度为0.1mol/L，pH为7.5~10，反应温度为1~25℃。

进一步优选的是，步骤2中所述引发剂与脂肪酶的摩尔比为3：1，缓冲液浓度为0.1mol/L，pH为8，反应温度为4℃。

优选的是，步骤3中所述的聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，N,N-二甲基丙烯酰胺，N-(2-羟乙基)丙烯酰胺，2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸，二甲胺基丙基甲基丙烯酰胺，甲基丙烯酸丁酯，甲基丙烯酸缩水甘油酯，甲基丙烯酸烯丙酯或甲基丙烯酸羟乙酯。

优选的是，步骤3中所述催化剂1为CuBr，CuCl，Ru

上述方法制备的脂肪酶-聚合物偶联物固体粉末在结构脂质转酯化上的应用，具体为：将蚕蛹油和油酸作为反应底物，加入脂肪酶-聚合物偶联物作为催化剂，搅拌震荡反应1~30 h，获得改性蚕蛹油结构脂质。

优选的是，所述蚕蛹油与油酸的摩尔比为1：（1~10）；所述脂肪酶-聚合物偶联物在反应体系中体积占比为1%~10%；搅拌震荡反应的温度为30~90℃。

进一步优选的是，反应底物蚕蛹油与油酸底物比为1：7；搅拌震荡反应的温度为55℃。

上述的方法制备的脂肪酶-聚合物偶联物。

上述改性蚕蛹油结构脂质在制备预防或治疗脂代谢相关的疾病上的应用。

有益效果

与现有技术相比，本发明一种脂肪酶-聚合物偶联物的制备方法及其在结构脂质转酯化上的应用，通过ATRP策略获得脂肪酶-聚合物偶联物，该方法制备得到的固定化脂肪酶，固定效率高，pH稳定性，热稳定性及重复使用次数都大大增加。在蚕蛹油改性反应中，可以高效催化蚕蛹油转酯化制备功能性结构脂质。

附图说明

图1是功能性引发剂的核磁氢谱表征图；

图2为游离脂肪酶与脂肪酶-聚合物偶联物的TOP-MS结果。

具体实施方式

以下将结合附图及实施例对本发明做进一步说明，需要指出的是，以下所述实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。给予本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在此需要说明的是，本发明实施例所用的材料和试剂均为本领域常规市售材料。

实施例1 本实施例说明功能引发剂的制备方法。

将8.9 g

实施例2 脂肪酶-聚合物偶联物TL-NIPAAm的制备

将脂肪酶TL（疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶）溶于pH 8.0、浓度为0.1 mol/L的磷酸缓冲液中，加入功能性引发剂（2）（N-2-溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸N’-氧琥珀酰亚胺酯），在4℃下反应5 h，反应结束后使用分子量8 kDa的透析袋于pH 8.0、浓度10 mmol/L的磷酸缓冲液中透析24 h，所得产物TL MI与游离脂肪酶TOP-MS比较结果如图2所示，图2A为游离脂肪酶的分子量，图2B为脂肪酶引发剂大分子TL MI分子量，可看出TL MI分子量较游离TL脂肪酶增加了704.2，根据引发剂分子量可分析每个脂肪酶TL的亚基可连接3个引发剂分子。

将TL MI溶液与N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）按比例混合反应，同时取适量CuBr和Me

实施例3

本实施例说明脂肪酶-聚合物偶联物的酶活力，pH稳定性，热稳定性及重复利用性能的测定，本实施例采用的偶联物为脂肪酶实施例2中所制备TL-PNIPAAm偶联物。

1.脂肪酶-聚合物偶联物的酶活力测定方法：采用榈酸对硝基苯酚酯（

2.对脂肪酶-聚合物偶联物的pH稳定性进行研究：将脂肪酶-聚合物偶联物和游离脂肪酶用不同pH（1.0-12.0）的缓冲液稀释100倍后在37 ℃水浴锅孵育1 h，取出后置于冰上，并测定其剩余活力，以最高活性为100%，计算不同pH值的溶液处理后酶的相对活力，以此衡量固定前后脂肪酶的pH稳定性，与游离脂肪酶稳定性比较，脂肪酶-聚合物偶联物可在pH 3-9范围内均保持80%酶活力。

3.对脂肪酶-聚合物偶联物的温度稳定性进行研究：将脂肪酶-聚合物偶联物和游离脂肪酶分别置于37、55 ℃下孵育600 min，分别在2、5、10、20、30、60、180、300和600 min时取样并置于冰上，随后测定其活性，以初始酶活性为100%，得到处理不同时间后的脂肪酶的相对酶活，根据其相对酶活的变化来衡量脂肪酶-聚合物偶联物的温度稳定性，与游离脂肪酶稳定性比较，在55℃孵育10 h后，脂肪酶-聚合物偶联物的相对剩余活力较游离脂肪酶提高25.7%。

4.对脂肪酶-聚合物偶联物的重复利用性能进行研究：取脂肪酶-聚合物偶联物与游离脂肪酶，测定酶活力，加入底物

实施例4

将实施例3中制备的脂肪酶-聚合物偶联物作为结构脂质转酯化的催化剂，分别向反应瓶中加入摩尔比为1：7，蚕蛹油和油酸作为反应底物，加入占体系总质量5%的脂肪酶-聚合物偶联物，将反应瓶密封完全后，置于55℃间歇式反应器中水浴加热反应21 h。取400

利用气相色谱对粗制蚕蛹油的脂肪酸组成进行分析（如表1），

表1 蚕蛹油及其结构脂质的脂肪酸组成

结果表明以脂肪酶-聚合物偶联物作为催化剂制备结构脂质，不饱和脂肪酸含量从73.47±1.16%提高至84.95±3.41%，成果合成功能性结构脂质，有望应用于治疗高胆固醇、高脂血症等与脂代谢有关的疾病。