一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法

摘要

本发明涉及植物病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法。包括以下步骤：步骤1.根据番茄黄化曲叶病毒基因组序列设计引物C4‑F和C4‑R，PCR法制备带地高辛标记的番茄黄化曲叶病毒特异性DNA探针；步骤2.感染番茄黄化曲叶病毒3天后的烟草总RNA提取和总RNA在琼脂糖胶上的分离；步骤3.虹吸法转移步骤2中分离的总RNA至带正电的尼龙膜，转膜结束后在紫外交联仪下固定膜上的总RNA；步骤4.预杂交，并使用步骤1中制备的探针进行杂交；步骤5.洗涤杂交膜及杂交信号检测。该方法克服了现有检测技术的缺点，提供了一种灵敏、特异检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，尤其涉及探测一种DNA病毒-一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是一种单链环状DNA病毒，属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)以循环持久的方式传播TYLCV。TYLCV是单基因组，单链环状DNA病毒，基因组大小在2.8kb左右，编码6个开放式阅读框(open reading frames,ORFs)，即6个蛋白，V1和V2由正义链编码，C1-C4由负义链编码。TYLCV侵染寄主后，ssDNA基因组在一系列细胞因子的参与下在细胞核内被转换成dsDNA，dsDNA然后从IR启动子开始双向转录，产生病毒mRNAs，据此可知TYLCV病毒mRNAs在侵染早期就已经产生。TYLCV在番茄上引起严重病害，给全世界的番茄产业构成了巨大的威胁，2011年，被Molecular PlantPathology杂志列为植物十大病毒病害之一。TYLCV因此，如何对TYLCV进行灵敏和特异性的检测，仍然是一个研究热点。

由于缺少高效，特异和灵敏的TYLCV抗体，因此基于血清学和免疫学的TYLCV检测技术难以实施。目前TYLCV最主要的检测方法包括普通PCR，实时定量PCR和使用放射性元素([a-32P]dCTP)标记探针的Southern blotting技术。普通PCR检测虽然成本低，但是灵敏度和特异性都不高；实时定量PCR灵敏度很高，但是成本高，不同样品之间交叉污染的现象普遍存在；使用放射性元素([a-32P]dCTP)标记探针的Southern blotting技术不仅污染环境，而且对人体伤害大。此外，使用Southern blotting技术检测TYLCV基因组DNA，通常需要在其侵染植株至少30～40天后才能检测到，严重影响试验进程。

为此，本发明提出了一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于Northern杂交检测番茄黄化曲叶病毒的方法，包括以下步骤：

S1.根据番茄黄化曲叶病毒基因组序列设计引物C4-F和C4-R；

通过PCR法制备带地高辛标记的番茄黄化曲叶病毒特异性DNA探针；

S2.提取感染番茄黄化曲叶病毒3天后的烟草总RNA；

在琼脂糖胶上的分离总RNA；

S3.采用虹吸法转移S2中分离的总RNA至带正电的尼龙膜；转膜结束后在紫外交联仪下固定膜上的总RNA；

S4.预杂交，并使用步骤S1中制备的特异性DNA探针进行杂交；

S5.洗涤杂交膜；

进行杂交信号检测。

进一步优选的，所述C4-F引物序列为：5’-ATGGGGAACCACATCTCC-3’；

所述C4-R引物序列为：5’-TTAATATATTGAGGGCCTCGG-3’。

进一步优选的，所述S2中，提取感染番茄黄化曲叶病毒3天后的烟草总RNA，包括以下步骤：

用液氮迅速研磨烟草组织成细粉状；

在1.5ml Eppendorf管中加入0.05～0.10g研磨后的粉末，加入1ml Trizol提取缓冲液，室温混匀后加入200μl氯仿，剧烈振荡后于室温静置5min；

于4℃、12000r/min条件下，离心15min；

吸上清液至新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，于4℃沉淀1h；

于4℃、12000r/min条件下，离心15min；

舍弃上清液，进行瞬时离心，用枪头吸尽残留液体，加入700μl 75％预冷乙醇洗涤沉淀，用枪头吸打沉淀；

于4℃、5000r/min条件下，离心5min，弃乙醇后重复一次；

将超净工作台上吹干，加入50μl DEPC处理的去离子水，于-20℃保存备用。

进一步优选的，所述S2中，在琼脂糖胶上的分离总RNA，包括以下步骤：

S21.制备1.0％(w/v)琼脂糖凝胶：

将1.2g琼脂糖和11ml 10×MOPS+99ml DEPC处理去离子水，获得混合液，将该混合液微波炉加热熔解琼脂糖后置于通风厨冷却至50-60℃；加入10ml 37％甲醛以及适量10mg/ml溴化乙锭，混匀后倒胶；

S22.将4倍体积的总RNA与1倍体积的5×RNA loading buffer混匀后，65℃水浴变性10min后，冰浴3-5min，瞬时离心后点样；

S23.点样后，以5-7V/cm的电压在1×MOPS电泳缓冲液中跑胶1.5-2.5h。

进一步优选的，S3包括以下步骤：

将胶置于适量体积的20×SSC中洗涤两次，每次15min；然后采用DEPC处理过的水洗涤10min；

洗涤结束后，将胶置于事先搭好的盐桥正中心，切去胶周围凸出的部分；处理完胶后在胶上覆盖合适区域的尼龙膜，赶走胶与膜之间的气泡，在尼龙膜上覆盖3-5层与胶面积大小相同的3mm滤纸，滤纸上方放置一叠Paper Tower，Paper Tower上面再放一块大小合适的玻璃，最后玻璃上方放置适当重量的重物，转膜装置固定好之后开始转膜；

转膜时间12-20h，转膜缓冲液为20×SSC；

转膜结束后在紫外交联仪下固定膜上的总RNA，固定条件：1.5J/cm

进一步优选的，S4包括以下步骤：

将杂交液在50℃杂交箱中预热，预热后将上述备好的尼龙膜置于其中，预杂交2-6小时，制得预杂交液；

将S1中制得的特异性DNA探针在95℃变性10min后，取5μl加入上述预杂交液中，混匀后在50℃杂交箱中杂交，杂交时间：16-20h。

进一步优选的，S5中，洗涤杂交膜，包括：

高盐洗涤：在含有0.1％SDS的2×SSC溶液中室温洗涤2次，每次5min；

低盐洗涤：在含有0.1％SDS的0.1×SSC溶液中50℃洗涤2次，每次15min；

洗涤液洗涤：1×Washing buffer室温洗涤杂交膜5min；

封闭液封闭：1×Blocking buffer室温封闭杂交膜30min；

抗体孵育：抗体Anti-Digoxigenin-AP和1×Blocking buffer按照1:20,000稀释，室温孵育杂交膜30min；

洗涤液洗涤：1×Washing buffer室温洗涤杂交膜2次，每次15min。

进一步优选的，S5中，进行杂交信号检测，包括：

将杂交膜在1×Detection buffer中孵育2-3min后使用试剂盒CDP-Star ready-to-use进行杂交信号显色。

本发明至少具备以下有益效果：

本发明通过PCR的方法合成地高辛标记的特异性DNA探针，并且该探针可以重复使用多次，实现一种DNA病毒(TYLCV)在人工接种3天后即可探测的灵敏、特异性检测方法；且本发明未使用放射性元素，不污染环境，而且对人体无害。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR方法合成的地高辛标记的TYLCV特异性DNA探针(M：标准分子量；1：地高辛标记C4 PCR产物；2：未标记C4普通PCR产物)；

图2为本发明的RNA印迹技术在TYLCV侵染3天，4天和5天时的检测效果示意图(A：TYLCV农杆菌浸润接种本氏烟示意图；B：Northern blotting技术检测TYLCV示意图)。

图3为本发明的RNA印迹技术在TYLCV侵染不同烟草植株3天时的检测效果示意图(编号1-9是指TYLCV侵染的不同的烟草植株)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.PCR法获得TYLCV特异性DNA探针

(1)设计TYLCV特异性探针引物

检测番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的引物为C4-F和C4-R，PCR扩增产物大小为294bp，地高辛标记后的DNA片段琼脂糖凝胶电泳时移动速度比普通PCR产物移动速率慢。C4-F和C4-R引物序列分别为：

C4-F：5’-ATGGGGAACCACATCTCC-3’；

C4-R：5’-TTAATATATTGAGGGCCTCGG-3’

(2)PCR法制备DNA探针

使用Roche公司PCR DIG Probe Synthesis Kit探针合成试剂盒制备TYLCV特异性DNA探针，本发明制备探针使用步骤(1)中TYLCV特异性引物C4-F和C4-R，使用的DNA模板为本实验室前期保存的TYLCV侵染性克隆质粒。为检测探针大小是否正确进行琼脂糖凝胶(如图1)，按照说明书制备探针，PCR反应体系以及循环条件如下：

2.Trizol(Invitrogen)法提取烟草组织总RNA

(1)用液氮迅速研磨烟草组织成细粉状，在1.5ml Eppendorf管中加入适量(约0.05～0.10g)研磨后的粉末，加入1ml Trizol提取缓冲液，室温混匀后加入200μl氯仿，剧烈振荡，室温静置5min；

(2)然后于4℃、12000r/min的条件下搅拌15min。

(3)吸上清至新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，4℃沉淀1h；

(4)然后于4℃、12000r/min的条件下搅拌15min

(5)弃上清，瞬时离心，用枪头吸尽残留液体，加入700μl 75％预冷乙醇洗涤沉淀，用枪头吸打沉淀，然后4℃，5000r/min离心5min，弃乙醇，重复一次；

(6)超净工作台上吹干，加入50μl DEPC处理的去离子水，-20℃保存备用。

需要注意：本方法中所有的试剂、试管以及枪头都需要用DEPC处理以防止RNase降解RNA。

3.在琼脂糖凝胶上分离总RNA

(1)制备1.0％(w/v)琼脂糖凝胶(含10％甲醛)：1.2g琼脂糖+11ml 10×MOPS+99mlDEPC处理去离子水，将该混合液微波炉加热熔解琼脂糖后置于通风厨冷却至50-60℃时加入10ml 37％甲醛以及适量10mg/ml溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)，混匀后倒胶；

(2)4倍体积的总RNA与1倍体积的5×RNA loading buffer混匀后，65℃水浴变性10min，后冰浴3-5min，瞬时离心后点样；

(3)点样后，以5-7V/cm的电压在1×MOPS电泳缓冲液中跑胶约2h。

4.总RNA转膜

(1)洗涤：跑胶结束后，将胶置于适量体积的20×SSC中洗涤两次，每次15min，然后DEPC处理的水洗涤10min；

(2)转膜装置(虹吸法转膜)：洗涤结束后，将胶置于事先搭好的盐桥(3mm滤纸)正中心，切去胶周围凸出的部分以避免胶和尼龙膜的接触过程中出现气泡，处理完胶后在胶上覆盖合适区域的尼龙膜，赶走胶与膜之间的气泡，在尼龙膜上覆盖3-5层与胶面积大小相同的3mm滤纸，滤纸上方放置一叠Paper Tower(Cascades)，Paper Tower上面再放一块大小合适的玻璃，最后玻璃上方放置适当重量的重物，转膜装置固定好之后开始转膜；

(3)转膜时间12-20h，转膜缓冲液为20×SSC；

(4)转膜结束后在紫外交联仪下固定膜上的总RNA，固定条件：1.5J/cm

5.预杂交和杂交

使用Roche公司DIG Easy Hyb试剂盒，按照说明书上的方法进行操作，具体方法如下：

(1)将Roche公司DIG Easy Hyb试剂盒内的杂交液(约10ml)在50℃杂交箱中预热，预热后将上述备好的尼龙膜置于其中，注意避免气泡，预杂交2-6小时；

(2)将制得的探针在95℃变性10min后，取5μl加入上述预杂交液中，混匀后在50℃杂交箱中杂交，杂交时间：16-20h。

6.洗涤杂交膜及杂交信号检测

使用Roche公司DIG Wash and Block Buffer Set试剂盒，按照说明书方法进行洗涤，具体方法如下：

(1)高盐洗涤：在含有0.1％SDS的2×SSC溶液中室温洗涤2次，每次5min；

(2)低盐洗涤：在含有0.1％SDS的0.1×SSC溶液中50℃洗涤2次，每次15min；

(3)洗涤液洗涤：1×Washing buffer室温洗涤杂交膜5min；

(4)封闭液封闭：1×Blocking buffer室温封闭杂交膜30min；

(5)抗体孵育：抗体Anti-Digoxigenin-AP和1×Blocking buffer按照1:20,000稀释，室温孵育杂交膜30min；

(6)洗涤液洗涤：1×Washing buffer室温洗涤杂交膜2次，每次15min；

(7)检测：将杂交膜在1×Detection buffer中孵育2-3min后使用试剂盒CDP-Starready-to-use(Roche)进行杂交信号显色。

7.试剂配方

(1)10mL 5×RNA loading buffer配方：16μL饱和溴酚蓝，80μL 500mM EDTA，pH8.0，720μL 37％甲醛，2mL 100％甘油，3084μL甲酰胺，4mL 10×MOPS缓冲液，加RNase-free水定容至10mL；

(2)20×SSC配方：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，pH 7.0；

(3)10×MOPS配方：41.9g 3-吗啉丙磺酸，8.2g柠檬酸钠，3.72g EDTA，pH 7.0；

(4)1L 1×MOPS配方：100mL 10×MOPS，20mL 37％甲醛，880mL ddH2O；

(5)高盐洗涤液(2×SSC，0.1％SDS)配方：100mL 20×SSC，10mL 10％SDS；

(6)低盐洗涤液(0.1×SSC，0.1％SDS)配方：50mL 2×SSC，10mL 10％SDS；

(7)脱色液(0.2×SSC，1％SDS)配方：100mL 2×SSC，10g 10％SDS。

参阅如图2和图3，图2为Northern blotting技术在TYLCV侵染3天，4天和5天时的检测效果示意图(A：TYLCV农杆菌浸润接种本氏烟示意图；B：Northern blotting技术检测TYLCV示意图)。图3为Northern blotting技术在TYLCV侵染不同烟草植株3天时的检测效果示意图(编号1-9是指TYLCV侵染的不同的烟草植株)。可知，本发明提供了一种使用Northern blotting技术在番茄黄化曲叶病毒侵染早期特异灵敏的检测到该病毒的方法，本发明通过PCR的方法合成地高辛标记的特异性DNA探针，并且该探针可以重复使用多次，实现一种DNA病毒(TYLCV)在人工接种3天后即可探测的灵敏、特异性检测方法。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。