以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用

摘要

本发明提供了以β‑吲哚基丙氨酸为底物合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的方法及其应用。本发明提供的5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸高产菌株，用于以β‑吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的方法，5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的合成产量高。本发明通过对BH4再生系统的构建，新的BH4再生酶的挖掘，加强了工程菌株BH4的再生能力，尤其是双BH4再生系统的同时作用，显著提升了生物合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的产量。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用。

背景技术

5-羟基β-吲哚基丙氨酸广泛存在于豆科植物的种子中，其中非洲植物加纳的种子中含量最高。从加纳籽中提取和精制5-羟基β-吲哚基丙氨酸的基本工艺路线为：加纳籽粉碎—萃取—过滤离心—物理脱色—真空浓缩—结晶、重结晶—真空干燥。但随着非洲加纳树数量不断减少，传统提取法获得5-羟基β-吲哚基丙氨酸变得越来越困难，作为人体神经代谢途径中抵抗抑郁、缓解情感性精神障碍的天然药物，近年来5-羟基β-吲哚基丙氨酸的市场需求越来越大，依靠天然产物提取己难以满足市场需求，越来越多的企业开始从化学合成与生物发酵等方面研究5-羟基β-吲哚基丙氨酸的生产。

目前所报道的生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的合成方法，大部分是先合成β-吲哚基丙氨酸后再羟化其生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。β-吲哚基丙氨酸的生物合成方法目前已比较成熟。但是β-吲哚基丙氨酸羟化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸需要有BH4为辅因子参与才能进行，而BH4难以储存且价格昂贵，这使得通过额外添加BH4以工业化生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸成为不可能。

而微生物中又没有BH4的合成路径，要想在微生物中合成则必须通过外源基因的加入。本发明通过对工程菌的BH4合成和再生能力的加强，并通过双BH4再生系统的应用，提高了5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供5-羟基β-吲哚基丙氨酸高产菌株、构建以及以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

提供一种以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，包括以下步骤：

1)利用所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因或能够表达合成β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以β-吲哚基丙氨酸为底物，生物发酵合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，所述的能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2产BH4再生酶基因QDPR和BH2产BH4再生酶基因DHFR；

2)从1)的体系中分离得到5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

按上述方案，PCD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，qBH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6-10中任一序列所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11-15中任一序列所示。

优选地，所述BH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，和SEQ IDNO:8中任一序列所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14中任一序列所示。

更优选地，所述BH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

按上述方案，β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

BH4合成途径关键酶基因FOLE、PTPS、SPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-4所示。

按上述方案，所述的步骤1)为将所构建的重组菌经过活化培养后，转接至发酵培养基诱导表达后，以β-吲哚基丙氨酸为底物转化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

具体的，上述方法为：将所构建的重组基因工程菌分别经过LB培养基活化培养后，得到种子液，将种子液转接至发酵培养基，发酵后加入IPTG诱导，并加入β-吲哚基丙氨酸，发酵转化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

进一步地，所述种子液OD600＝5；

所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物；

所述种子液的培养条件为28-40℃，160-230rpm，优选为37℃，225rpm；

所述种子液接入发酵培养基的比例为1％-10％，优选比例为2％；

所述发酵培养基的组成(质量百分比)为：1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％KH

所述进行诱导前的发酵时间为1-5h，优选为2h；

所述IPTG的终浓度为0.1-10mM，优选为1mM；

所述诱导表达的条件为16-37℃，优选为30℃；

所述反应体系β-吲哚基丙氨酸浓度为1-50g/L，优选10g/L；

所述发酵时间为18-72h，优选为24-66h，更优选为36-48h。

本发明还提供BH4再生酶基因，所述的BH4再生酶基因包括BH2产BH4再生酶基因DHFR，核苷酸序列如SEQ ID NO:11-15中任一序列所示。

按上述方案，所述的BH4再生酶基因还进一步包括PCD基因、qBH2产BH4再生酶基因QDPR，PCD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，qBH2产BH4再生酶基QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6-10中任一序列所示。

本发明还提供一种以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的工程菌，包含合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因，所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；上述BH4再生酶基因。

本发明同时提供一种上述基因工程菌的构建方法：β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2，BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR放入同一质粒串连表达；BH4再生酶基因PCD、QDPR、DHFR放入同一质粒串连表达；将上述质粒共同转化至宿主细胞中，得到重组基因工程菌。

进一步地，所述的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，优选为BL21(DE3)。

本发明的有益效果：

本发明通过构建双BH4再生系统工程菌，提供的5-羟基β-吲哚基丙氨酸高产菌株，用于以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，5-羟基β-吲哚基丙氨酸的合成产量高。

进一步通过qBH2产BH4再生酶基因QDPR(二氢喋呤还原酶)的筛选和BH2产BH4再生酶基因DHFR(二氢叶酸还原酶)不同物种来源的同功酶组合筛选，可进一步显著提升了生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：pET28a-H2FPS质粒图谱

图2：pACYCDuet-PQ质粒图谱

图3：pACYCDuet-PQF质粒图谱

图4：双BH4再生系统以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸路线示意图；

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。下述以大肠杆菌出发，通过改造大肠杆菌以实现发酵法高效大规模工业化生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

实施例1单BH4再生系统工程菌的构建和筛选

β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶基因TPH2；BH4合成途径关键酶FOLE，PTPS，SPR的串联表达。

将TPH2、FOLE、PTPS、SPR基因分别合成并插入到载体质粒pET28a(+)的NdeI和XhoI位点之间，获得pET28a-TPH2、pET28a-FOLE、pET28a-PTPS、pET28a-SPR质粒。

以F1和R1为引物，pET28a-TPH2质粒为模板克隆获得含TPH2基因的pET28a质粒载体；以F2和R2为引物，质粒pET28a-FOLE为模板克隆获得FOLE基因；以F3和R3为引物，质粒pET28a-PTPS为模板克隆获得PTPS基因；以F4和R4为引物，质粒pET28a-SPR为模板克隆获得SPR基因。

将以上片段通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pET28a-H2FPS(如图1)

表1引物序列1

BH4再生途径关键酶基因PCD、QDPR的串联表达。

将BH3OH生成qBH2基因PCD和不同来源的5种qBH2产BH4再生酶基QDPR基因，经过密码子优化人工合成得到Q1、Q2、Q3、Q4、Q5(序列依次如SEQ ID NO:6-10所示)，将PCD和Q1-Q5到pACYCDuet质粒的NcoI和AflⅡ位点之间，获得pACYCDuet-PCD、pACYCDuet-Q1、pACYCDuet-Q2、pACYCDuet-Q3、pACYCDuet-Q4、pACYCDuet-Q5质粒。

以pACYCDuet-P-F和pACYCDuet-P-R引物，pACYCDuet-PCD质粒为模板，克隆获得含PCD基因(序列如SEQ ID NO:5所示)的pACYCDuet质粒载体；以Q1-F、Q1-R，Q2-F、Q2-R，Q3-F、Q3-R，Q4-F、Q4-R，Q5-F、Q5-R引物，分别以质粒pACYCDuet-Q1、pACYCDuet-Q2、pACYCDuet-Q3、pACYCDuet-Q4、pACYCDuet-Q5为模板克隆获得Q1-Q5基因片段。

将以上Q1-Q5基因片段分别与含PCD基因的pACYCDuet质粒载体片段通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pACYCDuet-PQ1、pACYCDuet-PQ2、pACYCDuet-PQ3、pACYCDuet-PQ4、pACYCDuet-PQ5。(如图2)

表1引物序列1

单BH4再生酶产5-羟基β-吲哚基丙氨酸菌株的构建和筛选

将质粒pET28a-H2FPS分别与pACYCDuet-PQ1、pACYCDuet-PQ2、pACYCDuet-PQ3、pACYCDuet-PQ4、pACYCDuet-PQ5电转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，得到工程菌KC011、KC012、KC013、KC014、KC015。将工程菌KC011、KC012、KC013、KC014、KC015分别在含有50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素抗生素的种子培养基中培养10h，得到种子液，所述种子液的OD

结果如表所示，其中：工程菌KC011、KC013产5-羟基β-吲哚基丙氨酸的初始速度高于其他菌株，并且工程菌KC013持续产5-羟基β-吲哚基丙氨酸优于KC011，表明：编号Q3的QDPR再生BH4能力最好。

表2：不同QDPR菌株产量比较

实施例2双BH4再生系统工程菌的构建和筛选

进一步将上述BH4再生关键基因QDPR和DHFR组合，形成双BH4再生系统，评价筛选这些不同基因组合的工程菌合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的效果。具体以SEQ ID NO：5所示的PCD基因和SEQ ID NO：8所示的QDPR基因为例构建双BH4再生系统。

基于双BH4再生系统，以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸路线如图4所示。

双BH4再生系统关键基因PCD、QDPR和不同DHFR的串连表达：

选择不同来源的DHFR基因经过密码子优化人工合成得到F1-F5(序列依次如SEQID NO:11-15所示)，将F1-F5基因插入到pACYCDuet质粒的NcoI和AflⅡ位点之间，获得pACYCDuet-F1、pACYCDuet-F2、pACYCDuet-F3、pACYCDuet-F4、pACYCDuet-F5、质粒。

以pACYCDuet-P-F、pACYCDuet-PQ3-R为引物，pACYCDuet-PQ3质粒为模板克隆获得含PCD和Q3基因的pACYCDuet质粒载体；以F1-F、F1-R，F2-F、F2-R，F3-F、F3-R，F4-F、F4-R，F5-F、F5-R，为引物，分别以质粒pACYCDuet-F1、pACYCDuet-F2、pACYCDuet-F3、pACYCDuet-F4、pACYCDuet-F5为模板克隆获得F1-F5基因片段。

将F1-F5基因片段与含PCD和Q3基因的pACYCDuet质粒载体通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pACYCDuet-PQ3F1、pACYCDuet-PQ3F2、pACYCDuet-PQ3F3、pACYCDuet-PQ3F4、pACYCDuet-PQ3F5。(如图3)表3引物序列2

双BH4再生酶产5-羟基β-吲哚基丙氨酸菌株的构建和筛选

将质粒pET28a-H2FPS分别与pACYCDuet-PQ3F1、pACYCDuet-PQ3F2、pACYCDuet-PQ3F3、pACYCDuet-PQ3F4、pACYCDuet-PQ3F5电转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，得到工程菌KC021、KC022、KC023、KC024、KC025。将工程菌KC021、KC022、KC023、KC024、KC025分别在含有50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素抗生素的种子培养基中培养10h，得到种子液，所述种子液的OD

结果如表所示，其中：工程菌KC021、KC022、KC023、KC024产5-羟基β-吲哚基丙氨酸的初始速度高于其他菌株，而工程菌KC023、KC024持续产5-羟基β-吲哚基丙氨酸优于KC021、KC022，且确定编号F4的DHFR与Q3组合再生BH4能力最好，可以保证产物持续高效生产。

表4：不同DHFR菌株产量比较

本发明通过对β-吲哚基丙氨酸羟化基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生基因PCD、QDPR、DHFR的配合、构建获得了以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的工程菌，用于以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

进一步的通过BH4再生途径关键酶基因QDPR的筛选和新的BH4再生途径关键酶基因DHFR的组合筛选，构建的双BH4再生系统显著提升了生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。为高效大规模工业化生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸提供了条件。

序列表

<110> 河北维达康生物科技有限公司

<120> 以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用

<130> 1

<160> 47

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgaaactgg aggatgttcc gtggttcccg cgtaagatta gcgagctgga taagtgcagc 60

caccgtgttc tgatgtatgg tagcgaactg gacgcggatc acccgggttt taaggacaac 120

gtgtaccgtc agcgtcgtaa atatttcgtg gatgttgcga tgggttacaa gtatggccaa 180

ccgatcccgc gtgttgaata caccgaggaa gaaaccaaga cctggggtgt ggtttttcgt 240

gaactgagca aactgtaccc gacccacgcg tgccgtgagt atctgaagat tttctgcctg 300

ctgaccaaat actgcggcta tcgtgaagac aacgtgccgc agctggagga tgttagcatg 360

tttctgaagg agcgtagcgg tttcaccgtg cgtccggttg cgggttacct gagcccgcgt 420

gactttctgg cgggtctggc gtaccgtgtt ttccactgca cccaatatat ccgtcacggc 480

agcgacccgc tgtatacccc ggaaccggat acctgccacg agctgctggg tcacgttccg 540

ctgctggcgg atccgaaatt cgcgcagttt agccaagaaa ttggtctggc gagcctgggt 600

gcgagcgatg aggatgtgca gaagctggcg acctgctact tctttaccat cgaattcggt 660

ctgtgcaaac aggaaggtca actgcgtgcg tatggtgcgg gcctgctgag cagcattggc 720

gaactgaagc acgcgctgag cgacaaggcg tgcgtgaaag cgtttgatcc gaaaaccacc 780

tgcctgcagg aatgcctgat caccaccttc caagaagcgt actttgttag cgagagcttc 840

gaagaggcga aggagaaaat gcgtgacttc gcgaagagca tcacccgtcc gttcagcgtg 900

tactttaacc cgtataccca gagcatcgaa attctgaaag acacccgtag cattgagaac 960

gtggttcaag atctgcgtag cgacctgaac accgtttgcg atgcgctgaa taaaatgaac 1020

caatatctgg gtatctaa 1038

<210> 2

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgccatcac tcagtaaaga agcggccctg gttcatgaag cgttagttgc gcgaggactg 60

gaaacaccgc tgcgcccgcc cgtgcatgaa atggataacg aaacgcgcaa aagccttatt 120

gctggtcata tgaccgaaat catgcagctg ctgaatctcg acctggctga tgacagtttg 180

atggaaacgc cgcatcgcat cgctaaaatg tatgtcgatg aaattttctc cggtctggat 240

tacgccaatt tcccgaaaat caccctcatt gaaaacaaaa tgaaggtcga tgaaatggtc 300

accgtgcgcg atatcactct gaccagcacc tgtgaacacc attttgttac catcgatggc 360

aaagcgacgg tggcctatat cccgaaagat tcggtgatcg gtctgtcaaa aattaaccgc 420

attgtgcagt tctttgccca gcgtccgcag gtgcaggaac gtctgacgca gcaaattctt 480

attgcgctac aaacgctgct gggcaccaat aacgtggctg tctcgatcga cgcggtgcat 540

tactgcgtga aggcgcgtgg catccgcgat gcaaccagtg ccacgacaac gacctctctt 600

ggtggattgt tcaaatccag tcagaatacg cgccacaaat ttctgcgcgc tgtgcgtcat 660

cacaactga 669

<210> 3

<211> 435

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgaatgcgg cggtgggcct gcgtcgtcgt gcgcgtctga gccgtctggt tagctttagc 60

gcgagccatc gtctgcacag cccgagcctg agcgcggagg aaaacctgaa ggttttcggt 120

aaatgcaaca acccgaacgg tcacggccac aactacaagg tggttgtgac catccacggc 180

gagattgacc cggttaccgg catggtgatg aacctgaccg atctgaaaga atatatggag 240

gaagcgatca tgaagccgct ggaccacaaa aacctggacc tggatgttcc gtactttgcg 300

gatgttgtga gcaccaccga gaacgttgcg gtgtatattt gggaaaacct gcagcgtctg 360

ctgccggtgg gcgcgctgta taaggtgaaa gtgtatgaaa ccgacaacaa catcgtggtg 420

tataagggtg aataa 435

<210> 4

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaccatga ttaccccgag cctgggccgt ggccgtctgg gttgcgcggt gtgcgttctg 60

accggtgcga gccgtggttt tggccgtgcg ctggcgccgc agctggcggg tctgctgagc 120

ccgggcagcg tgctgctgct gagcgcgcgt agcgactcca tgctgcgtca gctgaaagag 180

gagctgtgca cccagcaacc gggtctgcaa gtggttctgg cggcggcgga tctgggtacc 240

gagagcggcg tgcagcaact gctgagcgcg gttcgtgagc tgccgcgtcc ggaacgtctg 300

caacgtctgc tgctgatcaa caacgcgggt accctgggtg atgtgagcaa gggcttcctg 360

aacattaacg atctggcgga agttaacaac tactgggcgc tgaacctgac cagcatgttg 420

tgcctgacca ccggtaccct gaacgcgttc agcaacagcc cgggcctgag caaaaccgtg 480

gttaacatca gcagcctgtg cgcgctgcag ccgtttaagg gttggggcct gtactgcgcg 540

ggtaaagcgg cgcgtgacat gctgtatcaa gtgctggcgg ttgaggaacc gagcgtgcgt 600

gttctgagct atgcgccggg tccgctggac accaacatgc agcaactggc gcgtgaaacc 660

agcatggacc cggaactgcg tagccgtctg cagaagctga acagcgaggg tgaactggtt 720

gattgcggca ccagcgcgca aaaactgctg agcctgctgc aacgcgatac ctttcagagc 780

ggtgcgcacg tggactttta cgacatctaa 810

<210> 5

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

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aaggatttca accgtgcgtt cggcttcatg actcgtgttg cactgcaagc agaaaaactg 180

gatcatcacc cggaatggtt caacgtttac aacaaagtac atattaccct gagcacccac 240

gaatgcgcag gtctgtctga acgcgatatc aacctggcgt ccttcatcga acaggttgcg 300

gtttccatga cctga 315

<210> 6

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atggcagcag cagcagcagc aggtgaagct cgtcgtgttc tggtttacgg tggtcgtggt 60

gcactgggca gccgctgcgt tcaggcattc cgtgcgcgta actggtgggt ggcttccgtg 120

gacgttgtcg agaacgaaga ggcgtccgca tccattatcg ttaaaatgac cgattccttc 180

accgaacagg cagatcaggt tactgccgaa gttggcaaac tgctgggtga agaaaaagta 240

gatgcgatcc tgtgtgttgc tggtggctgg gctggtggta acgccaaaag caaatccctg 300

ttcaaaaact gtgatctgat gtggaaacag tctatctgga cctctactat ttctagccat 360

ctggcgacta agcacctgaa agaaggtggt ctgctgaccc tggccggtgc caaagcagct 420

ctggatggta cgccgggtat gattggttac ggcatggcta aaggcgctgt acatcagctg 480

tgccagtccc tggcgggtaa aaactctggc atgccaccgg gtgctgcggc gatcgcggtg 540

ctgccggtga ccctggatac cccgatgaat cgtaaaagca tgccggaagc ggatttctct 600

tcttggacgc cgctggaatt tctggtagaa acgttccacg attggattac cggtaaaaac 660

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ccagcctatt tttga 735

<210> 7

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atggcggcga gcggcgaagc gcgccgcgtg ctggtgtatg gcggccgcgg cgcgctgggc 60

agccgctgcg tgcaggcgtt tcgcgcgcgc aactggtggg tggcgagcat tgatgtggtg 120

gaaaacgaag aagcgagcgc gagcgtgatt gtgaaaatga ccgatagctt taccgaacag 180

gcggatcagg tgaccgcgga agtgggcaaa ctgctgggcg atcagaaagt ggatgcgatt 240

ctgtgcgtgg cgggcggctg ggcgggcggc aacgcgaaaa gcaaaagcct gtttaaaaac 300

tgcgatctga tgtggaaaca gagcatttgg accagcacca ttagcagcca tctggcgacc 360

aaacatctga aagaaggcgg cctgctgacc ctggcgggcg cgaaagcggc gctggatggc 420

accccgggca tgattggcta tggcatggcg aaaggcgcgg tgcatcagct gtgccagagc 480

ctggcgggca aaaacagcgg catgccgagc ggcgcggcgg cgattgcggt gctgccggtg 540

accctggata ccccgatgaa ccgcaaaagc atgccggaag cggattttag cagctggacc 600

ccgctggaat ttctggtgga aacctttcat gattggatta ccggcaacaa acgcccgaac 660

agcggcagcc tgattcaggt ggtgaccacc gatggcaaaa ccgaactgac cccggcgtat 720

ttttaa 726

<210> 8

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

atggatatta tcagcgttgc gctgaaacgt catagcacca aagcctttga tgcaagcaaa 60

aagctgaccc cggaacaggc agaacagatt aaaacgctgc tgcagtatag cccgagcagc 120

accaacagcc agccgtggca ttttattgtc gcaagcaccg aagaaggtaa agcacgtgtt 180

gcaaaaagcg cagcaggtaa ttatgttttt aatgaacgta aaatgctgga tgcaagccat 240

gtggttgtat tttgtgcaaa aaccgcaatg gatgatgtgt ggctgaaact ggttgttgat 300

caggaagatg cagatggccg ttttgccacc ccggaagcca aagcagcaaa tgataaaggt 360

cgtaaatttt ttgcagatat gcatcgtaaa gatttacatg atgatgcaga atggatggca 420

aaacaggtat atctgaatgt tggtaacttt ctgctgggtg ttgcagcact gggtctggat 480

gccgttccga ttgaaggttt tgatgcagca attctggatg cagaatttgg tctgaaagaa 540

aaaggttata cctccctggt tgttgttcct gttggtcatc attcagttga agattttaat 600

gcaaccctgc cgaaatctcg tctgccgcag aatattacac tgacggaagt ttaa 654

<210> 9

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

atggcgaccg cggcgggcga agcgcgccgc gtgctggtgt atggcggccg cggcgcgctg 60

ggcagccagt gcgtgcaggc gtttcgcgcg cgcaactggt gggtggcgag cattgatctg 120

gtggaaaacg aagaagcgag cgcgaacgtg ctggtgaaaa tgaccgatag ctttaccgaa 180

caggcggatc aggtgaccgc ggatattggc cagctgctgg gcgcggaaaa agtggatgcg 240

attctgtgcg tggcgggcgg ctgggcgggc ggcagcgcga aaagcaaaag cctgtttaaa 300

aactgcgatc tgatgtggaa acagagcatg tggaccagca ccattagcag ccatctggcg 360

accaaacatc tgaaagaagg cggcctgctg accctgaccg gcgcgaaagc ggcgctggat 420

ggcaccccgg gcatgattgg ctatggcatg gcgaaaggcg cggtgcatca gctgtgccgc 480

agcctggcgg gcaaagatag cggcatgccg gcgggcagcg cggcgattgc ggtgctgccg 540

gtgaccctgg ataccccgat gaaccgcaaa agcatgccga aagcggattt tagcagctgg 600

accccgctgg aatttctggt ggaataa 627

<210> 10

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

atgagcgcgg gccgcgtggt gatttatggc ggcaaaggcg cgctgggcag cgcgtgcgtg 60

gatcatttta aagcgaacaa ctattgggtg ggcagcattg atctgaccga aaacgaaaaa 120

gcggatgtga gcattgtggt gccgcgcgat gcgagctggg tggaacagga agaaaccgtg 180

gtgagcaaag tgggcgaaag cctggcgggc gaaaaactgg atgcggtgat ttgcgtggcg 240

ggcggctggg cgggcggcaa cgcgaaaaaa gatctggcga aaaacgcgga tctgatgtgg 300

aaacagagcg tgctgaccag cgcgattagc gcggcggtgg cggcgcagca tctgaaagcg 360

ggcggcctgc tggcgctgac cggcgcgaaa ccggcgctgg aaggcacccc gggcatgatt 420

ggctatggca tggcgaaagc ggcggtgcat cagctgaccc gcagcctggg cgcggaaaaa 480

agcggcctgc cggcgggcag cctggcggtg agcattctgc cggtgaccct ggataccccg 540

atgaaccgca aatggatgcc ggatgcggat tttggcacct ggaccccgct gaccgaagtg 600

gcgggcctgt ttctgaaatg gacccaggat caggaacgcc cgaaaaccgg cagcctgctg 660

cagctgatta ccaccaacgg cattacccag ctgattgcgg cggaataa 708

<210> 11

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

atggtgggca gcctgaactg cattgtggcg gtgagccaga acatgggcat tggcaaaaac 60

ggcgatctgc cgtggccgcc gctgcgcaac gaatttcgct attttcagcg catgaccacc 120

accagcagcg tggaaggcaa acagaacctg gtgattatgg gcaaaaaaac ctggtttagc 180

attccggaaa aaaaccgccc gctgaaaggc cgcattaacc tggtgctgag ccgcgaactg 240

aaagaaccgc cgcagggcgc gcattttctg agccgcagcc tggatgatgc gctgaaactg 300

accgaacagc cggaactggc gaacaaagtg gatatggtgt ggattgtggg cggcagcagc 360

gtgtataaag aagcgatgaa ccatccgggc catctgaaac tgtttgtgac ccgcattatg 420

caggattttg aaagcgatac cttttttccg gaaattgatc tggaaaaata taaactgctg 480

ccggaatatc cgggcgtgct gagcgatgtg caggaagaaa aaggcattaa atataaattt 540

gaagtgtatg aaaaaaacga ttaa 564

<210> 12

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

atggtgcgcc cgctgaactg cattgtggcg gtgagccaga acatgggcat tggcaaaaac 60

ggcgatctgc cgtggccgct gctgcgcaac gaatttaaat attttcagcg catgaccacc 120

accagcagcg tggaaggcaa acagaacctg gtgattatgg gccgcaaaac ctggtttagc 180

attccggaaa aaaaccgccc gctgaaagat cgcattaaca ttgtgctgag ccgcgaactg 240

aaagaaccgc cgcagggcgc gcattttctg gcgaaaagcc tggatgatgc gctgaaactg 300

attgaacagc cggaactggc gagcaaagtg gatatggtgt gggtggtggg cggcagcagc 360

gtgtatcagg aagcgatgaa ccagccgggc catctgcgcc tgtttgtgac ccgcattatg 420

caggaatttg aaagcgatac cttttttccg gaaattgatc tggaaaaata taaactgctg 480

ccggaatatc cgggcgtgct gagcgaaatt caggaagaaa aaggcattaa atataaattt 540

gaagtgtatg aaaaaaaaga ttaa 564

<210> 13

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

atgatcagtc tgattgcggc gttagcggta gatcgcgtta tcggcatgga aaacgccatg 60

ccgtggaacc tgcctgccga tctcgcctgg tttaaacgca acaccttaaa taaacccgtg 120

attatgggcc gccatacctg ggaatcaatc ggtcgtccgt tgccaggacg caaaaatatt 180

atcctcagca gtcaaccggg tacggacgat cgcgtaacgt gggtgaagtc ggtggatgaa 240

gccatcgcgg cgtgtggtga cgtaccagaa atcatggtga ttggcggcgg tcgcgtttat 300

gaacagttct tgccaaaagc gcaaaaactg tatctgacgc atatcgacgc agaagtggaa 360

ggcgacaccc atttcccgga ttacgagccg gatgactggg aatcggtatt cagcgaattc 420

cacgatgctg atgcgcagaa ctctcacagc tattgctttg agattctgga gcggcggtaa 480

<210> 14

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

atggtgcgca gcctgaacag cattgtggcg gtgtgccaga acatgggcat tggcaaagat 60

ggcaacctgc cgtggccgcc gctgcgcaac gaatataaat attttcagcg catgaccagc 120

accagccatg tggaaggcaa acagaacgcg gtgattatgg gcaaaaaaac ctggtttagc 180

attccggaaa aaaaccgccc gctgaaagat cgcattaaca ttgtgctgag ccgcgaactg 240

aaagaagcgc cgaaaggcgc gcattatctg agcaaaagcc tggatgatgc gctggcgctg 300

ctggatagcc cggaactgaa aagcaaagtg gatatggtgt ggattgtggg cggcaccgcg 360

gtgtataaag cggcgatgga aaaaccgatt aaccatcgcc tgtttgtgac ccgcattctg 420

catgaatttg aaagcgatac cttttttccg gaaattgatt ataaagattt taaactgctg 480

accgaatatc cgggcgtgcc ggcggatatt caggaagaaa acggcattca gtataaattt 540

gaagtgtatc agaaaagcgt gctggcgcag taa 573

<210> 15

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

atgaccgtga gcattattgt ggcgattgat gaaaacaaag cgattggcaa aaacaaccag 60

ctgctgtggc atctgccgaa cgatctgaaa ttttttaaaa aaaccaccag cggccatacc 120

attattatgg gccgcaaaac ctttgatagc attggcaaag cgctgccgaa ccgccgcaac 180

attgtgatta gccgcaacaa aaacctgaaa attgaaggcg cggaagtgta tagcagcatt 240

gatcaggcgc tgaacacctg caaaaacgaa caggaagtgt ttattattgg cggcgcggaa 300

atttataaac aggcggaacc gattaccgat aaattttata ttaccaaagt gcatcatcag 360

tttgatgcgg ataccttttt taacaacctg aacctgaacg aactgaacga aatttggcgc 420

gaagaaaacc atgcggatga acgccatctg tatgattata cctttctgat tctggaaaaa 480

cgcaaataa 489

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagc 44

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

ctcgagaaga aggagatata catatgccat cactcagtaa agaag 45

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

caggaaacag ctatgaccat gattaccaat agcatgaata tgaatgcggc ggtgggcc 58

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ggatcccagg aaacagctat gaccatgatt accccgagcc tgggc 45

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

atgtatatct ccttcttctc gagttagata cccagatatt ggttc 45

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

attcatgcta ttggtaatca tggtcatagc tgtttcctgt cagttgtgat gacgcacag 59

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

agctgtttcc tgggatcctt attcaccctt atacaccacg atgttg 46

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

tcctttcggg ctttgttaga tgtcgtaaaa gtccacgtgc gcacc 45

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

ttaacctagg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccc 45

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

atgtatatct ccttcttaga tccgcggccg ctcaggtcat ggaaa 45

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

gcggccgcgg atctaagaag gagatataca tatggcagca gcagc 45

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

agcagcctag gttaatcaaa aataggctgg cgtcagttcc gtgcg 45

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> 28

<400> 28

gaaggagata tacatatggc ggcgagcggc gaagcgcgcc gcgtg 45

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

agcagcctag gttaattaaa aatacgccgg ggtcagttcg gttttg 46

<210> 30

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

gaaggagata tacatatgga tattatcagc gttgcgctga aacg 44

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

agcagcctag gttaattaaa cttccgtcag tgtaatattc tgcgg 45

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

gaaggagata tacatatggc gaccgcggcg ggcgaagcgc gc 42

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

agcagcctag gttaattatt ccaccagaaa ttccagcggg gtcc 44

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

gaaggagata tacatatgag cgcgggccgc gtggtgattt atggc 45

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

agcagcctag gttaattatt ccgccgcaat cagctgggta atgcc 45

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

ttaacctagg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccc 45

<210> 37

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

atgtatatct ccttcttact agttcaaaaa taggctggcg tcagttc 47

<210> 38

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

gaaggagata tacatatggt gggcagcctg aactgcattg tggcg 45

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

agcagcctag gttaattaat cgtttttttc atacacttc 39

<210> 40

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

gaaggagata tacatatggt gcgcccgctg aactgcattg tggcg 45

<210> 41

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

agcagcctag gttaattaat cttttttttc atacacttc 39

<210> 42

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

gaaggagata tacatatgat cagtctgatt gcggcgttag cggtag 46

<210> 43

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

agcagcctag gttaattacc gccgctccag aatctcaaag caatag 46

<210> 44

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

gaaggagata tacatatggt gcgcagcctg aacagcattg tggcg 45

<210> 45

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

agcagcctag gttaattact gcgccagcac gcttttctga tacac 45

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

gaaggagata tacatatgac cgtgagcatt attgtggcga ttg 43

<210> 47

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

agcagcctag gttaattatt tgcgtttttc cagaatcaga aagg 44