PD-1细胞膜纳米囊泡联合干细胞膜片在恶性黑色素瘤术后治疗中的应用

摘要

本发明公开了PD‑1细胞膜纳米囊泡联合干细胞膜片在恶性黑色素瘤术后治疗中的应用。所述细胞膜纳米囊泡过表达有免疫检查点对应受体且带有DBCO标记；所述干细胞膜片为叠氮化物修饰的干细胞膜片。通过将叠氮化物修饰的干细胞膜片敷在恶性黑色素瘤伤口处，促进伤口愈合，同时注射表达免疫检查点对应的受体且标记有DBCO的细胞膜纳米囊泡，囊泡经过血液循环到达伤口处时，能够通过点击化学反应跟干细胞膜片结合，实现在伤口处的富集，进而起到靶向作用，实现对黑色素瘤术后精准靶向免疫治疗的目的，从而实现促进伤口愈合和靶向抗黑色素瘤的双重功能。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及PD-1细胞膜纳米囊泡联合干细胞膜片在恶性黑色素瘤术后治疗中的应用。

背景技术

恶性黑色素瘤是一种黑色素细胞恶性转移与增殖引起的的高度恶性肿瘤，具有着高度恶性、高侵袭性、易转移、预后差等特点，近年来发病率逐渐提升。得益于科学技术的发展外科手术技术现在已经取得巨大进展，极大地提升了患者的生存率和生活质量，然而受到手术部位的影响，一些黑色素瘤无法彻底切除，如外阴黑色素瘤，残留的肿瘤细胞仍可能保留在手术边缘或术后循环中，这将增加癌症复发和转移的风险。此外，由于手术创口过深，易引起感染，创伤期长期的炎症反应可以进一步通过加速本地肿瘤细胞生长或扩散从而促进肿瘤复发，而手术带来的疤痕增生则严重影响美观降低患者的生活质量。

考虑到黑色素瘤术后会留下极深的创口，并往往伴随疤痕的产生和感染的发生进而影响患者术后生存质量。许多传统的治疗方法如低强度激光、治疗敷料、负压创面治疗、电刺激、高压氧，在临床应用中均存在着一定的限制。近年来，随着细胞生物学研究的进步，间充质干细胞在皮肤创面愈合中的重要作用逐渐被大家所认识到，同时其免疫相容性更是备受青睐。

尽管已经制造出各种材料以用于间充质干细胞递送和存活，但这些外源性支架材料可能无法保证极好的生物相容性，近年来无支架的培养系统引起了越来越多的关注，干细胞膜片的细胞培养皿是在常规组织培养皿底部通过接枝聚温度响应分子即温敏性聚异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)。在20℃时，接有PIPAAm的培养皿的表面变为亲水性，细胞无法附着在表面上；而在37℃时，该表面变为疏水性，细胞可以轻松附着并在表面上增殖。因此，通过降低培养温度，可以将培养皿表面上的细胞收获为完整的细胞片。因为细胞外基质的存在，干细胞膜片能紧密地附着到不需缝合或细胞损失宿主组织。

天然细胞膜来源的囊泡，如外泌体，大囊泡和细胞膜挤出囊泡，可通过慢病毒转染的方式使细胞膜衍生的纳米囊泡(NV)过表达PD-1受体，该受体通过破坏PD-1/PD-L1免疫抑制轴来增强癌症免疫疗法。已有相关文献报道过表达PD-1的纳米囊泡可以减少血液循环中的肿瘤细胞形成的转移灶。然而过表达PD-1的的纳米囊泡还无法实现对黑色素瘤术后伤口处的精准靶向免疫治疗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供PD-1细胞膜纳米囊泡联合干细胞膜片在恶性黑色素瘤术后治疗中的应用。

本发明的第二个目的在于提供一种恶性黑色素瘤术后治疗药物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明公开了一种用于恶性黑色素瘤术后促进伤口愈合的干细胞膜片。该干细胞膜片通过无支架培养系统获得，并且通过叠氮糖的代谢标记在其表面引入叠氮化合物。另外，本发明还提供了一种用于恶性黑色素瘤术后免疫治疗的细胞膜纳米囊泡，该细胞膜纳米囊泡不仅过表达免疫检查点对应的受体，同时还带有DBCO标记；而由叠氮化物和炔烃经点击化学形成的共价键，具有高效稳定，高特异性等优点，反应不受pH影响，能在常温条件下的水中进行，甚至能在活细胞中进行。因此可通过将叠氮化物修饰的干细胞膜片敷在恶性黑色素瘤伤口处，促进伤口愈合，同时注射表达免疫检查点对应的受体及标记有DBCO的细胞膜纳米囊泡，囊泡经过血液循环到达伤口处时，能够通过点击化学反应跟干细胞膜片结合，实现在伤口处的富集，进而起到靶向作用，实现对黑色素瘤术后精准靶向免疫治疗的目的，从而实现促进伤口愈合和靶向抗黑色素瘤的双重功能。

因此，本发明首先提供细胞膜纳米囊泡联合干细胞膜片在制备恶性黑色素瘤术后治疗药物中的应用，所述细胞膜纳米囊泡过表达有免疫检查点对应受体且带有DBCO标记；所述干细胞膜片为叠氮化物修饰的干细胞膜片。

基于此，本发明提供一种恶性黑色素瘤术后治疗产品，包括过表达免疫检查点对应受体且带有DBCO标记的细胞膜纳米囊泡及叠氮化物修饰的干细胞膜片。

具体地，所述过表达免疫检查点对应受体且带有DBCO标记的细胞膜纳米囊泡的制备方法为将DBCO-NHS与过表达免疫检查点对应受体的细胞系共同孵育，获得DBCO标记的细胞系，再裂解获取细胞膜，挤压过滤，即得。利用蛋白点击试剂DBCO-NHS与细胞膜上的蛋白质氨基结合构建表达DBCO的细胞膜纳米囊泡。

具体地，所述叠氮化物修饰的干细胞膜片的制备方法为将叠氮糖与干细胞共同孵育，获得叠氮化物修饰的干细胞，再通过无支架培养，即得。

优选地，所述免疫检查点为对应受体为SIRPα变体、PD-1、CLTA-4、TIM3、LAG3或VISTA。

进一步优选地，所述免疫检查点对应受体为PD-1。

优选地，所述干细胞膜片为间充质干细胞膜片。

优选地，所述叠氮糖为N3-甘露糖。

优选地，所述细胞系为HEK 293T细胞。

本发明还提供上述任一所述产品在制备恶性黑色素瘤术后治疗药剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了用于恶性黑色素瘤术后促进伤口愈合的干细胞膜片及用于恶性黑色素瘤术后免疫治疗的细胞膜纳米囊泡，所述干细胞膜片为叠氮化物修饰的干细胞膜片，所述细胞膜纳米囊泡为过表达免疫检查点对应受体且带有DBCO标记的细胞膜纳米囊泡。通过将叠氮化物修饰的干细胞膜片敷在恶性黑色素瘤伤口处，促进伤口愈合，同时注射表达免疫检查点对应的受体且标记有DBCO的细胞膜纳米囊泡，囊泡经过血液循环到达伤口处时，能够通过点击化学反应跟干细胞膜片结合，实现在伤口处的富集，进而起到靶向作用，实现对黑色素瘤术后精准靶向免疫治疗的目的，从而实现促进伤口愈合和靶向抗黑色素瘤的双重功能。

附图说明

图1为293T-PD-1-DBCO-NV的制备和表征结果。A：实验组(PD-1-DBCO-NV)和对照组(NC-NV、PD-1-NV)扫描电镜图和通过动态光散射法测量的粒径分布；B：实验组(PD-1-DBCO-NV)和对照组(NC-NV、PD-1-NV)通过动态光散射法测量的Zeta电势；C：表达PD-1-DBCO细胞膜纳米囊泡与高表达PD-L1的B16F10细胞系或过表达PD-L1的293T细胞系共孵育后的定位情况；D：构建的PD-1-DBCO-293T细胞系激光共聚焦图。

图2为PD-1-DBCO-NV与MSC-N3通过点击化学反应产生靶向性。A为间充质干细胞在表面修饰上叠氮后仍具有间充质干细胞的特性；B为利用DBCO-CY3探针检测MSC表面表达的N3的激光共聚焦图；C为PD-1-DBCO-NV与MSC-N3结合的激光共聚焦图；D为L929细胞中纤维化相关蛋白α-SMA、TGF-β1、COL1a的RNA水平柱状统计图。

图3为PD-1-DBCO-NV联合间充质干细胞膜片的治疗方案能够改善全身及原位复发处免疫微环境并且促进术后伤口愈合和减少疤痕形成。A为动物实验流程；B-C为原位复发肿瘤组织中CD8阳性T细胞比例的流式细胞术图和柱状统计图；D-E为重要免疫器官脾脏中CD8阳性T细胞比例的流式细胞术图和柱状统计图；F为肿瘤切除术后皮肤创口照片；G为肿瘤切除创口处皮肤的H&E染色图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

DBCO-NHS ester规格：100mg，货号：1353016-71-3；N3-甘露糖Ac4ManNAz，规格：50mg，货号：361154-30-5，均购自Confluore西安康福诺生物科技有限公司。

实施例1构建PD-1-DBCO细胞膜纳米囊泡

(1)构建稳定表达PD-1的HEK293T细胞系：将PD-1-GFP质粒和包装质粒的混合物转染HEK293T细胞72h，制备慢病毒悬液感染HEK293T细胞，3μg/ml嘌呤霉素筛选72h，建立稳定表达PD-1的HEK293T细胞系。

(2)表达PD-1的HEK293T细胞系的表征：将过表达PD-1的HEK293T细胞系和HEK293T细胞加入到Confocol皿中培养过夜，使用5μg/ml浓度的细胞膜染料WGA350避光染色15min，PBS洗2遍后加入4％多聚甲醛固定15min后。通过Confocol检验可见过表达PD-1的HEK293T细胞系其蓝色染色的细胞膜表面有带绿色荧光的PD-1，而对照HEK293T细胞没有。

(3)对细胞膜的DBCO标记：将DBCO-NHS溶解于DMSO中，配制成浓度为60mM的母液，然后将母液加入到稳定表达PD-1的HEK293T细胞培养基中使其终浓度为50nM，室温孵育30min，即可完成对细胞膜的DBCO标记。

(4)携带DBCO标记的PD-1-HEK293T细胞系的表征：将带有DBCO标记的PD-1-HEK293T细胞系和HEK293T细胞系加入Confocol皿中培养过夜，使用5μg/ml浓度的细胞膜染料WGA350避光染色15min，PBS洗2遍后加入N3-CY3探针，使探针浓度为50nM，孵育15分钟后PBS洗2遍后加入4％多聚甲醛固定15min后，通过Confocol检验。结果如图1D所示，通过激光共聚焦的方法发现PD-1-GFP和用以检测DBCO的N3-CY3探针在膜染料WGA350显示的细胞膜上共定位，表明PD-1-DBCO-293T细胞系构建成功。

(5)获取细胞膜：将所获得的表达PD-1的HEK293T细胞收集后使用HM Buffer裂解10分钟后，使用研磨棒冰上研磨使细胞彻底破裂。随后4000r/min，4℃离心10分钟，弃去下层的细胞核及胞质蛋白，收集上清液13000r/min，4℃离心10分钟，将下层沉淀物(即细胞膜)用PBS重悬并合并。

(6)制作细胞膜纳米囊泡并进行表征。将所获得的细胞膜依次挤压过0.45微米，0.22微米和0.1微米滤膜，将所得滤液用PBS稀释后加入到粒径仪中测量所获得囊泡的粒径和电势。结果如图1A、1B所示，囊泡的粒径多数均在100-200nm，其表面电势均大于-20mV。

(7)确认细胞膜纳米囊泡能够与PD-L1结合：因为T细胞高表达PD-1，PD-1通过与配体PD-L1相互作用而抑制T细胞活性，从而造成免疫抑制性微环境，而黑色素瘤高表达PD-L1被认为是免疫逃逸发生的主要机制，故而将囊泡与高表达PD-L1的B16F10细胞系和过表达PD-L1的293T细胞系共孵育，确认PD-1和PD-L1在细胞膜表面结合。即将适量的PD-L1-OFP-293T细胞和B16F10细胞铺到Confocol皿中过夜，使用5μg/ml浓度的细胞膜染料WGA350避光染色15min，PBS洗2遍后加入100微克(按蛋白量计)的囊泡共孵育1分钟，PBS洗2遍后加入4％多聚甲醛固定15min后，通过Confocol检验。结果如图1C所示，通过激光共聚焦的方法发现构建的PD-1-DBCO细胞膜纳米囊泡可以在细胞表面与PD-L1结合，表明成功制备得到了PD-1-DBCO细胞膜纳米囊泡。

实施例2MSC-N3干细胞膜片的构建

(1)脂肪来源的MSC提取：将C57小鼠脱颈处死后，在生物安全柜内解剖分离腹部脂肪，将所得脂肪用5％penicillin/streptomycin(P/S)的PBS缓冲液冲洗3遍后，剪刀剪碎并加入Ⅰ型胶原酶消化1小时后，1000r/min离心10min，弃上清，将下层沉淀用PBS重悬后过100微米的筛网再次离心，1000r/min离心10min，弃上清，下层沉淀用培养基重悬并加入培养皿培养。

(2)在MSC上进行N3修饰：向MSC培养基中加入N3-甘露糖，使其浓度为50nM，孵育3天后，取适量的细胞加入Confocol皿中培养过夜，使用5μg/ml浓度的细胞膜染料WGA350避光染色15min，PBS洗2遍后加入DBCO-CY3探针，使探针浓度为50nM，孵育15分钟后PBS洗2遍后加入4％多聚甲醛固定15min后，通过Confocol检验。结果如图2A，2B所示，间充质干细胞在表面修饰上叠氮后仍具有间充质干细胞的特性；由小鼠脂肪来源的间充质干细胞，在培养过程中加入N3-甘露糖，利用代谢修饰方法使MSC表面表达N3，接着使用DBCO-CY3探针进行检测，发现10天后间充质干细胞膜表面仍有N3存在。

(3)干细胞膜片的制作：将所获得MSC-N3细胞放入已包被好PIPAAm的培养皿中，使用成纤维细胞的条件培养基在皿中培养7天，显微镜下观察细胞已长满后加入将培养皿放置于室温操作台中(23℃)，用镊子小心将细胞薄片剥下。

(4)PD-1-DBCO细胞膜纳米囊泡与MSC-N3干细胞膜片共孵育：取适量MSC-N3细胞加入Confocol皿中培养过夜，使用5μg/ml浓度的细胞膜染料WGA350避光染色15min，PBS洗两遍后加入100微克(按蛋白量计)PD-1-DBCO-NV共孵育1分钟，PBS洗2遍后加入4％多聚甲醛固定15min后，通过confocol检验。

结果如图2C所示，将PD-1-DBCO-NV与MSC-N3共孵育，对比对照组(MSC+PD-1-NV、MSC+PD-1-DBCO-NV)，实验组MSC-N3能够通过点击化学反应吸引更多的PD-1-DBCO-NV。

(5)CCK8实验：成纤维细胞L929细胞系以每孔2000个的密度接种于96孔板，培养过夜，吸取培养基后分别加入正常培养基(DMEM培养基，含有10％FBS和1％P/S和所收集的条件培养基(培养过MSC的培养基，及培养过MSC-N3的培养基)，分别培养12，24，48，72，96小时后，弃去培养基，每孔加入无血清培养基90μl和cck8试液10μl，培养箱避光孵育2小时后于酶标仪检测450nm处吸光度值。收集MSC与MSC-N3的条件培养基与小鼠成纤维细胞系L929共培养24h，提取RNA进行qPCR检测。结果如图2D所示，MSC的条件培养可以减少纤维化相关蛋白的表达而增加一型胶原的表达，而N3的修饰不影响MSC条件培养基的这一效果。

实施例3对体内肿瘤原位复发模型治疗效果

动物实验流程如图3A所示，将2×10

其中，流式检测CD4+/CD8+比例：收取小鼠肿瘤组织和脾脏组织，充分研磨并通过70μm过滤器过滤，以获得单细胞悬液，与相关流式抗体孵育15分钟后检测CD4+/CD8+比例。结果如下，图3B-C示出了原位复发肿瘤组织中CD8阳性T细胞比例的流式细胞术图和柱状统计图，结果表明，PD-1-DBCO-NV联合MSC-N3干细胞膜片治疗能够提高肿瘤局部微环境CD8阳性T细胞比例，增强局部肿瘤免疫能力。图3D-E示出了重要免疫器官脾脏中CD8阳性T细胞比例的流式细胞术图和柱状统计图，结果表明，D-1-DBCO-NV联合MSC-N3干细胞膜片治疗能够提高全身CD8阳性T细胞比例，激活全身肿瘤免疫。

皮肤组织病理学检查：构建C57小鼠皮下瘤模型并切除约99％肿瘤后进行不同方案的治疗，分别于第0，5，10天对皮肤创口拍照。结果如图3F所示，随着时间推移，PD-1-DBCO-NV联合MSC-N3干细胞膜片治疗能显著促进伤口愈合。同时分别在第0，5，10天将小鼠背部创口处皮肤剪下，石蜡包埋，切片并进行苏木精-伊红染色。结果如图3G所示，随着时间推移，PD-1-DBCO-NV联合MSC-N3干细胞膜片治疗能显著减少瘢痕形成。