代谢工程方法、产角鲨烯工程菌、产橙花叔醇工程菌及其构建方法、应用

摘要

本申请适用于微生物技术领域，提供了代谢工程方法、产角鲨烯工程菌、产橙花叔醇工程菌及其构建方法、应用。所述代谢工程方法为过表达长非编码RNA PCGEM1和原癌基因c‑Myc，可有效促进酿酒酵母工程菌三萜化合物角鲨烯和倍半萜化合物橙花叔醇的产量。

说明书

技术领域

本申请属于微生物技术领域，尤其涉及一种代谢工程方法、产角鲨烯工程菌、产橙花叔醇工程菌及其构建方法、应用。

背景技术

随着合成生物学的发展，酿酒酵母已被广泛作为异源表达宿主来生产有价值的天然产物，这些天然产物包括单萜吲哚生物碱、青蒿酸和大麻素等。为了更加充分地利用酵母细胞工厂，越来越多的代谢工程策略被开发出来。对基因启动子和终止子的操控，以及对代谢通路上下游基因的融合、支架蛋白的构建和细胞器区室化的策略在一些重要化合物的生物合成中起到了很大的促进作用，同时，对酵母细胞内源亚细胞结构内质网膜的修饰能够提高角鲨烯及三萜类化合物的产量。

长非编码RNA在肿瘤细胞的发展和浸润过程中起着至关重要的作用。细胞内有一类能够募集组蛋白修饰复合物的转录因子，而长非编码RNA可指引这类转录因子到达染色体的指定位置，间接引起组蛋白结构的修饰，进而发挥调控作用。例如，长非编码RNAPCGEM1是前列腺癌细胞潜在的生物标记物和治疗靶点，它能够结合转录组因子c-Myc，调控糖酵解、三羧酸循环及脂质合成等代谢途径，进而引起细胞代谢流的重排。虽然在癌细胞中对长非编码RNA和原癌基因的研究很多，但在酵母细胞中的研究还比较少，而更进一步，将长非编码RNA和原癌基因开发成为一种代谢工程策略还未见报道。

发明内容

本申请实施例的目的在于提供一种基于长非编码RNA和原癌基因的代谢工程方法。

本申请实施例是这样实现的，一种基于长非编码RNA和原癌基因的代谢工程方法，所述代谢工程方法为过表达PCGEM1基因和c-Myc基因；其中，

所述PCGEM1基因为长非编码RNA编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述c-Myc基因为原癌基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本申请实施例的另一目的在于一种根据所述的基于长非编码RNA和原癌基因的代谢工程方法在构建酿酒酵母工程菌中的应用。

本申请实施例的另一目的在于一种产角鲨烯工程菌，所述产角鲨烯工程菌以酿酒酵母为出发菌株，过表达PCGEM1、c-Myc、tHMGR、UPC2-1和ERG9基因；其中，

PCGEM1和c-Myc基因整合到酵母基因组NDT80位点；

tHMGR和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；

ERG9基因启动子为组成型强启动子TPI1p。

本申请实施例的另一目的在于一种产橙花叔醇工程菌，所述产橙花叔醇工程菌以酿酒酵母为出发菌株，过表达PCGEM1、c-Myc、tHMGR和UPC2-1基因，抑制ERG9基因；其中，

PCGEM1和c-Myc基因整合到酵母基因组NDT80位点；

tHMGR和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；

ERG9基因启动子为葡萄糖抑制型启动子HXT1p。

本申请实施例的另一目的在于一种产角鲨烯工程菌的构建方法，包括：

将PGK1p、PCGEM1和CYC1t连接，构建基因表达模块PGK1p-PCGEM1-CYC1t，命名为模块I；

将TEF1p、c-Myc和ADH1t连接，构建基因表达模块TEF1p-c-Myc-ADH1t，命名为模块II；

将筛选标记HIS表达框、模块I和模块II连接，构建基因表达模块HIS-PGK1p-PCGEM1-CYC1t-TEF1p-c-Myc-ADH1t，命名为模块III；

将GAL1p、tHMGR和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t，命名为模块IV；

将GAL10p、UPC2-1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块V；

将模块V和模块VI连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t-GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块VI；

将筛选标记LEU和启动子TPI1p连接，构建基因表达模块LEU-TPI1p，命名为模块VII；

将模块III转化酵母菌株，整合到基因组的NDT80位点，得到菌株1；

将模块VI插入到载体pCfB2988的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCfB2988-VI；

用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2988-VI，得到DNA整合片段S1；

将DNA整合片段S1整合到菌株1染色体的TY1位点，得到菌株2；

将模块VII转化菌株2，整合到ERG9基因的启动子位置，得到产角鲨烯工程菌。

本申请实施例的另一目的在于一种产橙花叔醇工程菌的构建方法，包括：

将PGK1p、PCGEM1和CYC1t连接，构建基因表达模块PGK1p-PCGEM1-CYC1t，命名为模块I；

将TEF1p、c-Myc和ADH1t连接，构建基因表达模块TEF1p-c-Myc-ADH1t，命名为模块II；

将筛选标记HIS表达框、模块I和模块II连接，构建基因表达模块HIS-PGK1p-PCGEM1-CYC1t-TEF1p-c-Myc-ADH1t，命名为模块III；

将GAL1p、tHMGR和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t，命名为模块IV；

将GAL10p、UPC2-1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块V；

将模块V和模块VI连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t-GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块VI；

将筛选标记MET和启动子HXT1p连接，构建基因表达模块MET-HXT1p，命名为模块VIII；

将模块III转化酵母菌株，整合到基因组的NDT80位点，得到菌株1；

将模块VI插入到载体pCfB2988的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCfB2988-VI；

用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合表达载体pCfB2988-VI，得到DNA整合片段S1；

将DNA整合片段S1整合到菌株1染色体的TY1位点，得到菌株2；

将模块VIII转化菌株2，整合到ERG9基因的启动子位置，得到产橙花叔醇工程菌。

本申请实施例的另一目的在于一种根据所述的基于长非编码RNA和原癌基因的代谢工程方法在高产倍半萜化合物橙花叔醇和三萜化合物角鲨烯，以及其他倍半萜和三萜类化合物生产中的应用。

本申请实施例提供的基于长非编码RNA和原癌基因的代谢工程方法，所述代谢工程方法为过表达长非编码RNA PCGEM1和原癌基因c-Myc，可有效促进酿酒酵母工程菌三萜化合物角鲨烯和倍半萜化合物橙花叔醇的产量。

附图说明

图1为本申请实施例所构建的酿酒酵母工程菌株TT01角鲨烯的GC-MS检测结果；

图2为本申请实施例所构建的酿酒酵母工程菌株TT01角鲨烯的质谱图；

图3为本申请实施例所构建的酿酒酵母工程菌株ST01橙花叔醇的GC-MS检测结果；

图4为本申请实施例所构建的酿酒酵母工程菌株ST01橙花叔醇的质谱图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本申请提供了一种基于长非编码RNA和原癌基因的代谢工程方法，所述代谢工程方法为过表达PCGEM1基因和c-Myc基因。

本申请提供了上述的基于长非编码RNA和原癌基因的代谢工程方法在构建酿酒酵母工程菌中的应用。

具体地，本申请提供了一种产角鲨烯工程菌，为菌株TT01。

所述菌株TT01以酿酒酵母为出发菌株，过表达PCGEM1、c-Myc、tHMGR、UPC2-1和ERG9基因；其中，

PCGEM1和c-Myc基因整合到酵母基因组NDT80位点；

tHMGR和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；

ERG9基因启动子为组成型强启动子TPI1p。

本申请还提供了一种产橙花叔醇工程菌，为菌株ST01。

所述菌株ST01以酿酒酵母为出发菌株，过表达PCGEM1、c-Myc、tHMGR和UPC2-1基因，抑制ERG9基因；其中，

PCGEM1和c-Myc基因整合到酵母基因组NDT80位点；

tHMGR和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；

ERG9基因启动子为葡萄糖抑制型启动子HXT1p。

其中，所述的PCGEM1基因为前列腺癌细胞中的长非编码RNA编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的c-Myc基因为前列腺癌细胞中的原癌基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的tHMGR和UPC2基因可从酿酒酵母BY4741基因组中克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～4所示。

所述UPC2-1基因是基于PCR的定点突变技术将转录因子基因UPC2突变为UPC2-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述TPI1p和HXT1p启动子可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～7所示。

本申请还提供了上述的产角鲨烯工程菌和产橙花叔醇工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用重叠PCR构建以下模块：

(a)将PGK1p、PCGEM1和CYC1t连接，构建基因表达模块PGK1p-PCGEM1-CYC1t，命名为模块I；

(b)将TEF1p、c-Myc和ADH1t连接，构建基因表达模块TEF1p-c-Myc-ADH1t，命名为模块II；

(c)将筛选标记HIS表达框、模块I和II连接，构建基因表达模块HIS-PGK1p-PCGEM1-CYC1t-TEF1p-c-Myc-ADH1t，命名为模块III；

(e)将GAL1p、tHMGR和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t，命名为模块IV；

(f)将GAL10p、UPC2-1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块V；

(g)将模块V和模块VI连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t-GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块VI；

(h)将筛选标记LEU和启动子TPI1p连接，构建基因表达模块LEU-TPI1p，命名为模块VII；

(i)将筛选标记MET和启动子HXT1p连接，构建基因表达模块MET-HXT1p，命名为模块VIII。

(2)构建菌株BY4741-1

将步骤(1)中得到的模块III转化酵母工程菌BY4741，整合到基因组的NDT80位点，得到菌株BY4741-1。

(3)构建菌株BY4741-2

将步骤(1)中得到的模块VI插入到载体pCfB2988的SfaSI酶切位点，得到整合表达载体pCfB2988-VI；然后用限制性核酸内切酶Not Ι酶切整合表达载体pCfB2988-VI，得到DNA整合片段S1；再将DNA整合片段S1整合到菌株BY4741染色体的TY1位点，得到菌株BY4741-2。

(4)构建菌株TT01

将步骤(1)中得到的模块VII转化酵母工程菌BY4741-2，整合到ERG9基因的启动子位置，得到菌株TT01，即为高产三萜的角鲨烯的酵母工程菌株(产角鲨烯工程菌)。

(5)构建菌株ST01

将步骤(1)中得到的模块VIII转化酵母工程菌BY4741-2，整合到ERG9基因的启动子位置，得到菌株ST01，即为高产倍半萜橙花叔醇的酵母工程菌株(产橙花叔醇工程菌)。

步骤(1)中所述PCGEM1基因为前列腺癌细胞中的长非编码RNA编码基因，委托公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(1)中所述c-Myc基因为前列腺癌细胞中的原癌基因，委托公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤(1)中所述的tHMGR和UPC2基因可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～4所示。

步骤(1)中所述UPC2-1基因是基于PCR的定点突变技术将转录因子基因UPC2突变为UPC2-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

步骤(1)中所述启动子TPI1p、HXT1p、PGK1p、TEF1p、GAL1p和GAL10p可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6～11所示。

步骤(1)中所述终止子CYC1t和ADH1t可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示。

步骤(1)中所述的筛选标记HIS、LEU和MET的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～16所示。

步骤(2)～(5)中所述的酵母菌株优选菌株为BY4741。

步骤(2)～(5)中所述的转化为采用酵母转化试剂盒进行转化；优选为用ZymoResearch Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit

将步骤(4)所述的菌株进行发酵，目的产物为角鲨烯(C

将步骤(5)所述的菌株进行发酵，目的产物为角鲨烯(C

本申请还涉及一种提高角鲨烯和橙花叔醇的方法，为将所述的高产目的产物的酵母工程菌经活化后接种到培养基中进行摇瓶发酵培养，得到目的产物；

具体包括如下步骤：

将所述的高产角鲨烯的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，得到角鲨烯。

将所述的高产橙花叔醇的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，得到橙花叔醇。

所述的摇瓶发酵通过如下步骤实现：为将所述的高产角鲨烯和橙花叔醇的酿酒酵母工程菌分别接种到相应氨基酸缺陷型的固体培养基上，36～48h后分别挑取单克隆接种到5mL的YPD培养基中，30℃条件下220rpm培养至OD值2～3，然后将菌液接种到装有50mLYPD液体培养基的250mL摇瓶中，30℃条件220rpm下发酵168h。

下面结合实施例对本申请作进一步详细的描述，但本申请的实施方式不限于此。除非特别说明，本申请采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本申请所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1酵母基因和表达元件的克隆

1、酵母基因组的提取

(1)挑取酿酒酵母BY4741的单克隆于装有5mL YPD培养基的10mL试管中，30℃条件下220rpm培养过夜。

(2)将培养物4℃条件下4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。将菌体置于研钵中，液氮速冻，研磨成粉末，并迅速转移至1.5mL的离心管中。

(3)加入1mL DNA提取裂解液(DNAiso Reagent，9770Q，takara)混匀，室温条件下12,000rpm离心10min。

(4)取上清至1.5mL离心管中，加入上清1/2体积的无水乙醇，混匀，室温条件下12000rpm离心2min。

(5)弃上清，加入75％的乙醇溶液洗涤沉淀。

(6)重复上述步骤一次，

(7)挥干残留乙醇，并加入30～50μL ddH

2、酵母启动子和终止子的克隆

(1)以上述获得的酵母基因组为模板，分别克隆以下启动子和终止子(扩增引物见表1)：

TPI1p(引物TPI1p-F、TPI1p-R)、HXT1p(引物HXT1p-F、HXT1p-R)、PGK1p(引物PGK1p-F、PGK1p-R)、TEF1p(引物TEF1p-F、TEF1p-R)、GAL1p(引物GAL1p-F、GAL1p-R)、PGK10p(引物PGK10p-F、PGK10p-R)、CYC1t(引物CYC1t-F、CYC1t-R)、ADH1t(引物ADH1t-F、ADH1t-R)。

PCR反应体系：2×Phanta Max Master Mix(P515-01，诺唯赞)10μL，正反向引物各0.5μL，ddH

PCR扩增反应条件为：95℃1min；95℃15s，50-60℃15s，72℃30s-1min，32循环；72℃10min。

PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切下目的条带，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP219，天根生化)进行目的片段回收，具体操作过程见说明书。

(2)DNA回收片段连接亚克隆载体

将DNA回收片段连接亚克隆载体pLB(VT205，天根生化科技有限公司)，具体操作见产品说明书。

(3)转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布平板，置于37℃条件下过夜培养。

(3)挑选单菌落做菌落PCR。

PCR反应体系：2X M5 HiPer Taq HiFi PCR mix(MF002，聚合美)5μL，正反向引物(表1)各0.3μL，ddH

PCR扩增条件为：95℃3min；94℃15s，55℃15s，72℃1-3min，30个循环；72℃7min。

PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，挑取阳性克隆菌株测序。

3、UPC2的定点突变

UPC2是甲羟戊酸途径的正向调控因子，将其的第888位的甘氨酸突变为天冬氨酸，能进一步提高其调控作用。利用快速定点突变试剂盒(KM101，天根生化)，以pLB-UPC2质粒为模板，进行UPC2的定点突变(引物序列见表1)，具体操作见产品说明书。

表1本发明中克隆各基因和表达元件所用的引物序列

实施例2、表达模块的构建

1、利用重叠PCR构建基因表达模块I～IV

模块的构建利用重叠PCR的方法，要进行重叠的各片段通过PCR克隆。

(1)第一轮PCR扩增体系：2×Phanta Max Master Mix(P515-01，诺唯赞)10μL，正反向引物各0.5μL(引物序列见表2)，ddH2O 8μl，模板1μL，总反应体系20μL。

PCR扩增反应条件为：95℃1min；95℃15s，50-60℃15s，72℃30s-1min，32循环；72℃10min。

(2)第一轮PCR反应混合物稀释10倍，取1μL作为第二轮PCR的模板进行PCR反应：2×Phanta Max Master Mix(P515-01，诺唯赞)10μL，正反向引物各0.5μL(引物序列见表2)，ddH2O 8μl，模板1μL，总反应体系20μL。

PCR扩增反应条件为：95℃1min；95℃15s，50-60℃15s，72℃30s-1min，32循环；72℃10min。

(3)胶回收并连接亚克隆载体pLB(VT205，天根生化科技有限公司)，具体操作见产品说明书。

按上述步骤共构建以下4个模块：

(a)将PGK1p、PCGEM1和CYC1t连接，构建基因表达模块PGK1p-PCGEM1-CYC1t，命名为模块I；其中，第一轮PCR克隆PGK1p引物为I-PGK1p-F和I-PGK1p-R，克隆PCGEM1引物为I-PCGEM1-F和I-PCGEM1-R，克隆CYC1t引物为I-CYC1t-F和I-CYC1t-R；第二轮PCR引物为I-PGK1p-F和I-CYC1t-R；引物序列见表2。

(b)将将TEF1p、c-Myc和ADH1t连接，构建基因表达模块TEF1p-c-Myc-ADH1t，命名为模块II；其中，第一轮PCR克隆TEF1p引物为II-TEF1p-F和II-TEF1p-R，克隆c-Myc引物为II-c-Myc-F和II-c-Myc-R，克隆ADH1t引物为II-ADH1t-F和II-ADH1t-R；第二轮PCR引物为II-TEF1p-F和II-ADH1t-R；引物序列见表2。

(c)将筛选标记表达框HIS、模块I和II连接，构建基因表达模块HIS-PGK1p-PCGEM1-CYC1t-TEF1p-c-Myc-ADH1t，命名为模块III；其中，第一轮PCR克隆HIS筛选标记的引物为III-HIS-F和III-HIS-R，克隆模块I的引物为IIII-I-F和III-I-R，克隆模块II的引物为III-II-F和III-II-R；第二轮PCR引物为III-HIS-F和III-II-R；引物序列见表2。

(d)将GAL1p、tHMGR和ADH1t连接，构建基因表达模块GAL1p-tHMGR-ADH1t，命名为模块IV；其中，第一轮PCR克隆GAL1p引物为IV-GAL1p-F和IV-GAL1p-R，克隆tHMGR引物为IV-tHMGR-F和IV-tHMGR-R，克隆ADH1t引物为IV-ADH1t-F和IV-ADH1t-R；第二轮PCR引物为IV-GAL1p-F和IV-ADH1t-R；引物序列见表2。

(e)将GAL10p、UPC2-1和CYC1t连接，构建基因表达模块GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块V；其中，第一轮PCR克隆GAL10p引物为V-GAL10p-F和V-GAL10p-R，克隆UPC2-1引物为V-UPC2-1-F和V-UPC2-1-R，克隆CYC1t引物为V-CYC1t-F和V-CYC1t-R；第二轮PCR引物为V-GAL10p-F和V-CYC1t-R；引物序列见表2。

(f)将模块IV和模块V连接，构建基因表达模块

GAL1p-tHMGR-ADH1t-GAL10p-UPC2-1-CYC1t，命名为模块VI。其中，第一轮PCR克隆模块IV的引物为VI-IV-F和VI-IV-R，克隆模块V的引物为VI-V-F和VI-V-R；第二轮的PCR引物为VI-IV-F和VI-V-R；引物序列见表2。

(g)将筛选标记表达框LEU和TPI1p，构建基因表达模块LEU-TPI1p，命名为模块VII；其中，第一轮PCR克隆LEU筛选标记引物为VII-LEU-F和VII-LEU-R，克隆TPI1p引物为VII-TPI1p-F和VII-TPI1p-R；第二轮PCR引物为VII-LEU-F和VII-TPI1p-R；引物序列见表2。

(h)将筛选标记表达框MET和HXT1p，构建基因表达模块MET-HXT1p，命名为模块VIII；其中，第一轮PCR克隆MET筛选标记引物为VIII-MET-F和VIII-MET-R，克隆HXT1p引物为VIII-HXT1p-F和VIII-HXT1p-R；第二轮PCR引物为VIII-MET-F和VIII-HXT1p-R；引物序列见表2。

表2本申请中构建各模块所用的引物序列

实施例3、构建工程酵母菌

1、酿酒酵母菌株BY4741-1的构建

(1)将模块III从pLB-IV(即上述模块IV连接pLB载体获得)上用引物III-HIS-F和III-II-R扩增下来，PCR扩增体系：2×Phanta Max Master Mix(P515-01，诺唯赞)25μL，正反向引物各1.25μL，ddH2O 21.5μl，模板1μL，总反应体系50μL。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并进行回收。

(2)将回收的PCR片段转化酿酒酵母BY4741，将模块III整合到酵母BY4741染色体的NDT80位点，用组氨酸缺陷型培养基(SD-HIS培养基)平板进行筛选，得到酵母工程菌株BY4741-1。

2、酿酒酵母菌株BY4741-2的构建

(1)利用限制性内切酶NotI酶切构建好的整合型表达载体pCfB2988-VI，凝胶电泳检测并回收目的条带，获得DNA整合片段S1。

(2)取50μL上述纯化的DNA片段，转化酿酒酵母BY4741-1，以将模块整合到酵母BY4741-1染色体的TY1位点，并用尿嘧啶和组氨酸缺陷型培养基(SD-URA-HIS培养基)平板进行筛选，经菌落PCR验证，得到阳性工程菌株BY4741-2。

3、酿酒酵母菌株TT01的构建

(1)将模块VII从pLB-VII(即上述模块VII连接pLB载体获得)上用引物VII-LEU-F和VII-TPI1p-R扩增下来，PCR扩增体系：2×Phanta Max Master Mix(P515-01，诺唯赞)25μL，正反向引物各1.25μL，ddH2O 21.5μl，模板1μL，总反应体系50μL。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并进行回收。

(2)将回收的PCR片段转化酿酒酵母BY4741-2，将模块VII替换到酵母BY4741-2菌株的ERG9启动子，用组氨酸、尿嘧啶和亮氨酸缺陷型培养基(SD-HIS-URA-LEU培养基)平板进行筛选，得到酵母工程菌株TT01。

4、酿酒酵母菌株ST01的构建

(1)将模块VIII从pLB-VIII(即上述模块VIII连接pLB载体获得)上用引物VIII-MET-F和VIII-HXT1p-R扩增下来，PCR扩增体系：2×Phanta Max Master Mix(P515-01，诺唯赞)25μL，正反向引物各1.25μL，ddH2O 21.5μl，模板1μL，总反应体系50μL。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并进行回收。

(2)将回收的PCR片段转化酿酒酵母BY4741-2，将模块VIII替换到酵母BY4741-2菌株的ERG9启动子，用组氨酸、尿嘧啶和甲硫氨酸缺陷型培养基(SD-HIS-URA-MET培养基)平板进行筛选，得到酵母工程菌株ST01。

实施例5、工程菌株发酵检测目标化合物

1、工程菌株TT01的发酵及目标化合物检测

(1)将菌株TT01的单菌落接种到5mL的SD-HIS-URA-LEU培养基中，30℃条件220rpm培养OD值至2～3。

(2)将菌液接种到3瓶50mL的SD-HIS-URA-LEU培养基中，每瓶接种5mL，30℃条件下220rpm培养OD值至2～3。

(3)将3瓶菌液分别接种到1L的SD-HIS-URA-LEU培养基中，每瓶接种50mL，30℃条件220rpm发酵120h。

2、菌株TT01发酵产物的提取和检测

(1)取50mL上述发酵液3000rpm离心，分别获得上清和菌体。向菌体中加入10mL的20％KOH碱裂解液，95℃加热15min进行裂解。

(2)将裂解的菌体混合液和上清混合，加入250mL锥形瓶中，并加入等体积的乙酸乙酯，超声萃取20min，静置72h。

(3)取上层有机层于液相小瓶中，用氮吹仪吹干，加入100μL硅烷化试剂MSTFA，80℃条件下温浴30min。

(4)利用安捷伦7890B-5977B气质联用仪检测目标化合物角鲨烯的产量。检测方法：HP-5ms毛细管柱；进样量1μL，不分流；进样口温度250℃，起始温度50℃保持3min，而后以20℃/min的速率升到70℃保持1min，接着15℃/min的速率升到300℃保持3min；ElectronIonization离子源，能量强度70eV；MS溶剂延迟设为12min，开启电压倍增模式，增益因子设为1。

(5)检测结果如图1-2所示，GC-MS检测结果显示，ST01菌株经发酵120h产生的角鲨烯为320mg/L。

3、工程菌株ST01的发酵及目标化合物检测

(1)将菌株ST01的单菌落接种到5mL的SD-HIS-URA-MET培养基中，30℃条件220rpm培养OD值至2～3。

(2)将菌液接种到3瓶50mL的SD-HIS-URA-MET培养基中，每瓶接种5mL，30℃条件下220rpm培养OD值至2～3。

(3)将3瓶菌液分别接种到1L的SD-HIS-URA-MET培养基中，每瓶接种50mL，30℃条件220rpm发酵120h。

4、菌株ST01发酵产物的提取和检测

(1)取上述发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，超声1h，然后静置48h。

(2)取有机层于干净的液相小瓶中，进行GC-MS检测。其中，所用的仪器优选为安捷伦气质联用仪7890B-5977B。检测方法如下：进样体积为1μL，溶剂延时设置为12min，载气为氦气，流速为1mL/min。色谱柱为HP-5MS。色谱条件：50℃，3min；20℃/min速率升温到70℃，1min；15℃/min升温到300℃，3min。

(3)检测结果如图3-4所示，GC-MS检测结果显示，ST01菌株经发酵120h产生的橙花叔醇为150mg/L。

本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：

(1)YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。

(2)SD+相应氨基酸缺陷型培养基：YNB培养基6.7g/L，缺陷氨基酸母液(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体培养基配制时添加20g/L的琼脂粉)。

缺陷氨基酸母液(100X)：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶0.12g，用蒸馏水定容到57mL，根据需要可不加任意一种氨基酸配置成缺陷氨基酸母液(100X)。上述原料均购买自Sigma-Aldrich。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 滨州医学院

<120> 代谢工程方法、产角鲨烯工程菌、产橙花叔醇工程菌及其构建方法、应用

<141> 2022-05-16

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaggcactct ggcacccagt tttggaactg cagttttaaa agtcataaat tgaatgaaaa 60

tgatagcaaa ggtggaggtt tttaaagagc tatttatagg tccctggaca gcatcttttt 120

tcaattaggc agcaaccttt ttgccctatg ccgtaacctg tgtctgcaac ttcctctaat 180

tgggaaatag ttaagcagat tcatagagct gaatgataaa attgtactac gagatgcact 240

gggactcaac gtgaccttat caagtgagca ggcttggtgc atttgacact tcatgatatc 300

agccaaagtg gaactaaaaa cagctcctgg aagaggacta tgacatcatc aggttgggag 360

tctccaggga cagcggaccc tttggaaaag gactagaaag tgtgaaatct attagtcttc 420

gatatgaaat tctctgtctc tgtaaaagca tttcatattt acaagacaca ggcctactcc 480

tagggcagca aaaagtggca acaggcaagc agagggaaaa gagatcatga ggcatttcag 540

agtgcactgt cttttcatat atttctcaat gccgtatgtt tggttttatt ttggccaagc 600

ataacaatct gctcaagaaa aaaaaatctg gagaaaacaa aggtgccttt gccaatgtta 660

tgtttctttt tgacaagccc tgagatttct gaggggaatt cacataaatg ggatcaggtc 720

attcatttac gttgtgtgca aatatgattt aaagatacaa cctttgcaga gagcatgctt 780

tcctaagggt aggcacgtgg aggactaagg gtaaagcatt cttcaagatc agttaatcaa 840

gaaaggtgct ctttgcattc tgaaatgccc ttgttgcaaa tattggttat attgattaaa 900

tttacactta atggaaacaa cctttaactt acagatgaac aaacccacaa aagcaaaaaa 960

tcaaaagccc tacctatgat ttcatatttt ctgtgtaact ggattaaagg attcctgctt 1020

gcttttgggc ataaatgata atggaatatt tccaggtatt gtttaaaatg agggcccatc 1080

tacaaattct tagcaatact ttggataatt ctaaaattca gctggacatt gtctaattgt 1140

tttttatata catctttgct agaatttcaa attttaagta tgtgaattta gttaattagc 1200

tgtgctgatc aattcaaaaa cattactttc ctaaatttta gactatgaag gtcataaatt 1260

caacaaatat atctacacat acaattatag attgtttttc attataatgt cttcatctta 1320

acagaattgt ctttgtgatt gtttttagaa aactgagagt tttaattcat aattacttga 1380

tcaaaaaatt gtgggaacaa tccagcatta attgtatgtg attgttttta tgtacataag 1440

gagtcttaag cttggtgcct tgaagtcttt tgtacttagt cccatgttta aaattactac 1500

tttatatcta aagcatttat gtttttcaat tcaatttaca tgatgctaat tatggcaatt 1560

ataacaaata ttaaagattt cgaaatagaa 1590

<210> 2

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt 60

agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc 120

gacgaggagg agaacttcta ccagcagcag cagcagagcg agctgcagcc cccggcgccc 180

agcgaggata tctggaagaa attcgagctg ctgcccaccc cgcccctgtc ccctagccgc 240

cgctccgggc tctgctcgcc ctcctacgtt gcggtcacac ccttctccct tcggggagac 300

aacgacggcg gtggcgggag cttctccacg gccgaccagc tggagatggt gaccgagctg 360

ctgggaggag acatggtgaa ccagagtttc atctgcgacc cggacgacga gaccttcatc 420

aaaaacatca tcatccagga ctgtatgtgg agcggcttct cggccgccgc caagctcgtc 480

tcagagaagc tggcctccta ccaggctgcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc 540

cgcggccaca gcgtctgctc cacctccagc ttgtacctgc aggatctgag cgccgccgcc 600

tcagagtgca tcgacccctc ggtggtcttc ccctaccctc tcaacgacag cagctcgccc 660

aagtcctgcg cctcgcaaga ctccagcgcc ttctctccgt cctcggattc tctgctctcc 720

tcgacggagt cctccccgca gggcagcccc gagcccctgg tgctccatga ggagacaccg 780

cccaccacca gcagcgactc tgaggaggaa caagaagatg aggaagaaat cgatgttgtt 840

tctgtggaaa agaggcaggc tcctggcaaa aggtcagagt ctggatcacc ttctgctgga 900

ggccacagca aacctcctca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccacacat 960

cagcacaact acgcagcgcc tccctccact cggaaggact atcctgctgc caagagggtc 1020

aagttggaca gtgtcagagt cctgagacag atcagcaaca accgaaaatg caccagcccc 1080

aggtcctcgg acaccgagga gaatgtcaag aggcgaacac acaacgtctt ggagcgccag 1140

aggaggaacg agctaaaacg gagctttttt gccctgcgtg accagatccc ggagttggaa 1200

aacaatgaaa aggcccccaa ggtagttatc cttaaaaaag ccacagcata catcctgtcc 1260

gtccaagcag aggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgttgcggaa acgacgagaa 1320

cagttgaaac acaaacttga acagctacgg aactcttgtg cgtaa 1365

<210> 3

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctgcag accaattggt gaaaactgaa gtcaccaaga agtcttttac tgctcctgta 60

caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat aaaacagtca tttctggatc gaaagtcaaa 120

agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca ggaccttcat catctagtga ggaagatgat 180

tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa atacgtcctt tagaagaatt agaagcatta 240

ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac 300

ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg atactacgag agcggttgcg 360

gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta 420

ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt 480

tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta tcgatggtac atcttatcat 540

ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca 600

atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg atggtatgac aagaggccca 660

gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa 720

gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat caagatttgc acgtctgcaa 780

catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga gatttagaac aactactggt 840

gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta 900

gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac 960

aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct 1020

actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag 1080

ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140

gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200

aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260

tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320

caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380

aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440

tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500

gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560

tccgtcacct gcattaaatc ctaa 1584

<210> 4

<211> 2742

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcgaag tcggtataca gaatcacaag aaagcggtga caaaacccag aagaagagaa 60

aaagtcatcg agctaattga agtggacggc aaaaaggtga gtacgacttc aaccggtaaa 120

cgtaaattcc ataacaaatc aaagaatggg tgcgataact gtaaaagaag aagagttaag 180

tgtgatgaag ggaagccagc ctgtaggaag tgcacaaata tgaagttgga atgtcagtat 240

acaccaatcc atttaaggaa aggtagagga gcaacagtag tgaagtatgt cacgagaaag 300

gcagacggta gcgtggagtc tgattcatcg gtagatttac ctcctacgat caagaaggag 360

cagacaccgt tcaatgatat ccaatcagcg gtaaaagctt caggctcatc caatgattcc 420

tttccatcaa gcgcctctac aactaagagt gagagcgagg aaaagtcatc ggcccctata 480

gaggacaaaa acaatatgac tcctctaagt atgggcctcc agggtaccat caataagaaa 540

gatatgatga ataacttttt ctctcaaaat ggcactattg gttttggttc tcctgaaaga 600

ttgaattcag gtatcgatgg cttactatta ccgccattgc cttctggaaa tatgggtgcg 660

ttccaacttc agcaacagca gcaagtgcag cagcaatctc aaccacagac ccaagcgcag 720

caagcaagtg gaactccaaa cgagagatat ggttcattcg atcttgcggg tagtcctgca 780

ttgcaatcca cgggaatgag cttatcaaat agtctaagcg ggatgttact atgtaacagg 840

attccttccg gccaaaacta cactcaacaa caattacaat atcaattaca ccagcagctg 900

caattgcaac agcatcagca agttcagctg cagcagtatc aacaattacg tcaggaacaa 960

caccaacaag ttcagcaaca acaacaggaa caactccagc aataccaaca acattttttg 1020

caacagcagc aacaagtact gcttcagcaa gagcaacaac ctaacgatga ggaaggtggc 1080

gttcaggaag aaaacagcaa aaaggtaaag gaagggcctt tacaatcaca aacaagcgaa 1140

actactttaa acagcgatgc tgctacatta caagctgatg cattatctca gttaagtaag 1200

atggggctaa gcctaaagtc gttaagtacc tttccaacag ctggtattgg tggtgtttcc 1260

tatgactttc aggaactgtt aggtattaag tttccaataa ataacggcaa ttcaagagct 1320

actaaggcca gcaacgcaga ggaagctttg gccaatatgc aagagcatca tgaacgtgca 1380

gctgcttctg taaaggagaa tgatggtcag ctctctgata cgaagagtcc agcgccatcg 1440

aataacgccc aagggggaag tgctagtatt atggaacctc aggcggctga tgcggtttcg 1500

acaatggcgc ctatatcaat gattgaaaga aacatgaaca gaaacagcaa catttctcca 1560

tcaacgccct ctgcagtgtt gaatgatagg caagagatgc aagattctat aagttctcta 1620

ggaaatctga caaaagcagc cttggagaac aacgaaccaa cgataagttt acaaacatca 1680

cagacagaga atgaagacga tgcatcgcgg caagacatga cctcaaaaat taataacgaa 1740

gctgaccgaa gttctgtttc tgctggtacc agtaacatcg ctaagctttt agatctttct 1800

accaaaggca atctgaacct gatagacatg aaactgtttc atcattattg cacaaaggtc 1860

tggcctacga ttacagcggc caaagtttct gggcctgaaa tatggaggga ctacataccg 1920

gagttagcat ttgactatcc atttttaatg cacgctttgt tggcattcag tgccacccat 1980

ctttcgagga ctgaaactgg actggagcaa tacgtttcat ctcaccgcct agacgctctg 2040

agattattaa gagaagctgt tttagaaata tctgagaata acaccgatgc gctagttgcc 2100

agcgccctga tactaatcat ggactcgtta gcaaatgcta gtggtaacgg cactgtagga 2160

aaccaaagtt tgaatagcat gtcaccaagc gcttggatct ttcatgtcaa aggtgctgca 2220

acaattttaa ccgctgtgtg gcctttgagt gaaagatcta aatttcataa cattatatct 2280

gttgatctta gcgatttagg cgatgtcatt aaccctgatg ttggaacaat tactgaattg 2340

gtatgttttg atgaaagtat tgccgatttg tatcctgtcg gcttagattc gccatatttg 2400

ataacactag cttatttaga taaattgcac cgtgaaaaaa accagggtga ttttattctg 2460

cgggtattta catttccagc attgctagac aagacattcc tggcattact gatgacaggt 2520

gatttaggtg caatgagaat tatgagatca tattataaac tacttcgagg atttgccaca 2580

gaggtcaagg ataaagtctg gtttctcgaa ggagtcacgc aggtgctgcc tcaagatgtt 2640

gacgaataca gtggaggtgg tgatatgcat atgatgctag atttcctcgg tggcggatta 2700

ccatcgatga caacaacaaa tttctctgat ttttcgttat ga 2742

<210> 5

<211> 2742

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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aaagtcatcg agctaattga agtggacggc aaaaaggtga gtacgacttc aaccggtaaa 120

cgtaaattcc ataacaaatc aaagaatggg tgcgataact gtaaaagaag aagagttaag 180

tgtgatgaag ggaagccagc ctgtaggaag tgcacaaata tgaagttgga atgtcagtat 240

acaccaatcc atttaaggaa aggtagagga gcaacagtag tgaagtatgt cacgagaaag 300

gcagacggta gcgtggagtc tgattcatcg gtagatttac ctcctacgat caagaaggag 360

cagacaccgt tcaatgatat ccaatcagcg gtaaaagctt caggctcatc caatgattcc 420

tttccatcaa gcgcctctac aactaagagt gagagcgagg aaaagtcatc ggcccctata 480

gaggacaaaa acaatatgac tcctctaagt atgggcctcc agggtaccat caataagaaa 540

gatatgatga ataacttttt ctctcaaaat ggcactattg gttttggttc tcctgaaaga 600

ttgaattcag gtatcgatgg cttactatta ccgccattgc cttctggaaa tatgggtgcg 660

ttccaacttc agcaacagca gcaagtgcag cagcaatctc aaccacagac ccaagcgcag 720

caagcaagtg gaactccaaa cgagagatat ggttcattcg atcttgcggg tagtcctgca 780

ttgcaatcca cgggaatgag cttatcaaat agtctaagcg ggatgttact atgtaacagg 840

attccttccg gccaaaacta cactcaacaa caattacaat atcaattaca ccagcagctg 900

caattgcaac agcatcagca agttcagctg cagcagtatc aacaattacg tcaggaacaa 960

caccaacaag ttcagcaaca acaacaggaa caactccagc aataccaaca acattttttg 1020

caacagcagc aacaagtact gcttcagcaa gagcaacaac ctaacgatga ggaaggtggc 1080

gttcaggaag aaaacagcaa aaaggtaaag gaagggcctt tacaatcaca aacaagcgaa 1140

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atggggctaa gcctaaagtc gttaagtacc tttccaacag ctggtattgg tggtgtttcc 1260

tatgactttc aggaactgtt aggtattaag tttccaataa ataacggcaa ttcaagagct 1320

actaaggcca gcaacgcaga ggaagctttg gccaatatgc aagagcatca tgaacgtgca 1380

gctgcttctg taaaggagaa tgatggtcag ctctctgata cgaagagtcc agcgccatcg 1440

aataacgccc aagggggaag tgctagtatt atggaacctc aggcggctga tgcggtttcg 1500

acaatggcgc ctatatcaat gattgaaaga aacatgaaca gaaacagcaa catttctcca 1560

tcaacgccct ctgcagtgtt gaatgatagg caagagatgc aagattctat aagttctcta 1620

ggaaatctga caaaagcagc cttggagaac aacgaaccaa cgataagttt acaaacatca 1680

cagacagaga atgaagacga tgcatcgcgg caagacatga cctcaaaaat taataacgaa 1740

gctgaccgaa gttctgtttc tgctggtacc agtaacatcg ctaagctttt agatctttct 1800

accaaaggca atctgaacct gatagacatg aaactgtttc atcattattg cacaaaggtc 1860

tggcctacga ttacagcggc caaagtttct gggcctgaaa tatggaggga ctacataccg 1920

gagttagcat ttgactatcc atttttaatg cacgctttgt tggcattcag tgccacccat 1980

ctttcgagga ctgaaactgg actggagcaa tacgtttcat ctcaccgcct agacgctctg 2040

agattattaa gagaagctgt tttagaaata tctgagaata acaccgatgc gctagttgcc 2100

agcgccctga tactaatcat ggactcgtta gcaaatgcta gtggtaacgg cactgtagga 2160

aaccaaagtt tgaatagcat gtcaccaagc gcttggatct ttcatgtcaa aggtgctgca 2220

acaattttaa ccgctgtgtg gcctttgagt gaaagatcta aatttcataa cattatatct 2280

gttgatctta gcgatttagg cgatgtcatt aaccctgatg ttggaacaat tactgaattg 2340

gtatgttttg atgaaagtat tgccgatttg tatcctgtcg gcttagattc gccatatttg 2400

ataacactag cttatttaga taaattgcac cgtgaaaaaa accagggtga ttttattctg 2460

cgggtattta catttccagc attgctagac aagacattcc tggcattact gatgacaggt 2520

gatttaggtg caatgagaat tatgagatca tattataaac tacttcgagg atttgccaca 2580

gaggtcaagg ataaagtctg gtttctcgaa ggagtcacgc aggtgctgcc tcaagatgtt 2640

gacgaataca gtggaggtgg tggtatgcat atgatgctag atttcctcgg tggcggatta 2700

ccatcgatga caacaacaaa tttctctgat ttttcgttat ga 2742

<210> 6

<211> 926

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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gcggcagatg tatatgacag agtcgccagt ttccaagaga ctttattcag gcacttccat 120

gataggcaag agagaagacc cagagatgtt gttgtcctag ttacacatgg tatttattcc 180

agagtattcc tgatgaaatg gtttagatgg acatacgaag agtttgaatc gtttaccaat 240

gttcctaacg ggagcgtaat ggtgatggaa ctggacgaat ccatcaatag atacgtcctg 300

aggaccgtgc tacccaaatg gactgattgt gagggagacc taactacata gtgtttaaag 360

attacggata tttaacttac ttagaataat gccatttttt tgagttataa taatcctacg 420

ttagtgtgag cgggatttaa actgtgagga cctcaataca ttcagacact tctgacggta 480

tcaccctact tattcccttc gagattatat ctaggaaccc atcaggttgg tggaagatta 540

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catccagttt ttaatcttca gtggcatgtg agattctccg aaattaatta aagcaatcac 660

acaattctct cggataccac ctcggttgaa actgacaggt ggtttgttac gcatgctaat 720

gcaaaggagc ctatatacct ttggctcggc tgctgtaaca gggaatataa agggcagcat 780

aatttaggag tttagtgaac ttgcaacatt tactattttc ccttcttacg taaatatttt 840

tctttttaat tctaaatcaa tctttttcaa ttttttgttt gtattctttt cttgcttaaa 900

tctataacta caaaaaacac atacag 926

<210> 7

<211> 1123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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aatttttgat attccgagtt ctttttttcc attcgcggag gttattccat tcctaaacga 120

gtggccacaa tgaaacttca attcatatcg accgactatt tttctccgaa ccaaaaaaat 180

agcagggcga gattggagct gcggaaaaaa gaggaaaaaa ttttttcgta gttttcttgt 240

gcaaattagg gtgtaaggtt tctagggctt attggttcaa gcagaagaga caacaattgt 300

aggtcctaaa ttcaaggcgg atgtaaggag tattggtttc gaaagttttt ccgaagcggc 360

atggcaggga ctacttgcgc atgcgctcgg attatcttca tttttgcttg caaaaacgta 420

gaatcatggt aaattacatg aagaattctc tttttttttt tttttttttt ttttttacct 480

ctaaagagtg ttgaccaact gaaaaaaccc ttcttcaaga gagttaaact aagactaacc 540

atcataactt ccaaggaatt aatcgatatc ttgcactcct gatttttctt caaagagaca 600

gcgcaaagga ttatgacact gttgcattga gtcaaaagtt tttccgaagt gacccagtgc 660

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caagccagga aactccacca ttatctaatg tagcaaaata tttcttaaca cccgaagttg 960

cgtgtccccc tcacgttttt aatcatttga attagtatat tgaaattata tataaaggca 1020

acaatgtccc cataatcaat tccatctggg gtctcatgtt ctttccccac cttaaaatct 1080

ataaagatat cataatcgtc aactagttga tatacgtaaa atc 1123

<210> 8

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaagtacct tcaaagaatg gggtcttatc ttgttttgca agtaccactg agcaggataa 60

taatagaaat gataatatac tatagtagag ataacgtcga tgacttccca tactgtaatt 120

gcttttagtt gtgtattttt agtgtgcaag tttctgtaaa tcgattaatt tttttttctt 180

tcctcttttt attaacctta atttttattt tagattcctg acttcaactc aagacgcaca 240

gatattataa catctgcata ataggcattt gcaagaatta ctcgtgagta aggaaagagt 300

gaggaactat cgcatacctg catttaaaga tgccgatttg ggcgcgaatc ctttattttg 360

gcttcaccct catactatta tcagggccag aaaaaggaag tgtttccctc cttcttgaat 420

tgatgttacc ctcataaagc acgtggcctc ttatcgagaa agaaattacc gtcgctcgtg 480

atttgtttgc aaaaagaaca aaactgaaaa aacccagaca cgctcgactt cctgtcttcc 540

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 600

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 660

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 720

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 780

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 840

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 900

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 960

ctttttacaa caaatataaa acaa 984

<210> 9

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcacacacca tagcttcaaa atgtttctac tcctttttta ctcttccaga ttttctcgga 60

ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca cccaagcaca gcatactaaa tttcccctct 120

ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg tactaaaggt ttggaaaaga aaaaagagac 180

cgcctcgttt ctttttcttc gtcgaaaaag gcaataaaaa tttttatcac gtttcttttt 240

cttgaaaatt tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt 300

taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt 360

tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt ttaattacaa 420

<210> 10

<211> 455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtacggatt agaagccgcc gagcgggtga cagccctccg aaggaagact ctcctccgtg 60

cgtcctcgtc ttcaccggtc gcgttcctga aacgcagatg tgcctcgcgc cgcactgctc 120

cgaacaataa agattctaca atactagctt ttatggttat gaagaggaaa aattggcagt 180

aacctggccc cacaaacctt caaatgaacg aatcaaatta acaaccatag gatgataatg 240

cgattagttt tttagcctta tttctggggt aattaatcag cgaagcgatg atttttgatc 300

tattaacaga tatataaatg caaaaactgc ataaccactt taactaatac tttcaacatt 360

ttcggtttgt attacttctt attcaaatgt aataaaagta tcaacaaaaa attgttaata 420

tacctctata ctttaacgtc aaggagaaaa aaccc 455

<210> 11

<211> 212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcaatatagc aatgagcagt taagcgtatt actgaaagtt ccaaagagaa ggttttttta 60

ggctaagata atggggctct ttacatttcc acaacatata agtaagatta gatatggata 120

tgtatatgga tatgtatatg gtggtaatgc catgtaatat gattattaaa cttctttgcg 180

tccatccaaa aaaaaagtaa gaatttttga aa 212

<210> 12

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 60

ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 120

gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 180

acgctcgaag 190

<210> 13

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgaatttctt atgatttatg atttttatta ttaaataagt tataaaaaaa ataagtgtat 60

acaaatttta aagtgactct taggttttaa aacgaaaatt cttattcttg agtaactctt 120

tcctgtaggt caggttgctt tctcaggtat agcatgaggt cgctc 165

<210> 14

<211> 1165

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accataaatt cccgttttaa 60

gagcttggtg agcgctagga gtcactgcca ggtatcgttt gaacacggca ttagtcaggg 120

aagtcataac acagtccttt cccgcaattt tctttttcta ttactcttgg cctcctctag 180

tacactctat atttttttat gcctcggtaa tgattttcat tttttttttt cccctagcgg 240

atgactcttt ttttttctta gcgattggca ttatcacata atgaattata cattatataa 300

agtaatgtga tttcttcgaa gaatatacta aaaaatgagc aggcaagata aacgaaggca 360

aagatgacag agcagaaagc cctagtaaag cgtattacaa atgaaaccaa gattcagatt 420

gcgatctctt taaagggtgg tcccctagcg atagagcact cgatcttccc agaaaaagag 480

gcagaagcag tagcagaaca ggccacacaa tcgcaagtga ttaacgtcca cacaggtata 540

gggtttctgg accatatgat acatgctctg gccaagcatt ccggctggtc gctaatcgtt 600

gagtgcattg gtgacttaca catagacgac catcacacca ctgaagactg cgggattgct 660

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tagtgacacc gattatttaa agctgcagca tacgatatat atacatgtgt atatatgtat 1080

acctatgaat gtcagtaagt atgtatacga acagtatgat actgaagatg acaaggtaat 1140

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<210> 15

<211> 2228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcgaggagaa cttctagtat atccacatac ctaatattat tgccttatta aaaatggaat 60

cccaacaatt acatcaaaat ccacattctc ttcaaaatca attgtcctgt acttccttgt 120

tcatgtgtgt tcaaaaacgt tatatttata ggataattat actctatttc tcaacaagta 180

attggttgtt tggccgagcg gtctaaggcg cctgattcaa gaaatatctt gaccgcagtt 240

aactgtggga atactcaggt atcgtaagat gcaagagttc gaatctctta gcaaccatta 300

tttttttcct caacataacg agaacacaca ggggcgctat cgcacagaat caaattcgat 360

gactggaaat tttttgttaa tttcagaggt cgcctgacgc atataccttt ttcaactgaa 420

aaattgggag aaaaaggaaa ggtgagaggc cggaaccggc ttttcatata gaatagagaa 480

gcgttcatga ctaaatgctt gcatcacaat acttgaagtt gacaatatta tttaaggacc 540

tattgttttt tccaataggt ggttagcaat cgtcttactt tctaactttt cttacctttt 600

acatttcagc aatatatata tatatttcaa ggatatacca ttctaatgtc tgcccctatg 660

tctgccccta agaagatcgt cgttttgcca ggtgaccacg ttggtcaaga aatcacagcc 720

gaagccatta aggttcttaa agctatttct gatgttcgtt ccaatgtcaa gttcgatttc 780

gaaaatcatt taattggtgg tgctgctatc gatgctacag gtgtcccact tccagatgag 840

gcgctggaag cctccaagaa ggttgatgcc gttttgttag gtgctgtggc tggtcctaaa 900

tggggtaccg gtagtgttag acctgaacaa ggtttactaa aaatccgtaa agaacttcaa 960

ttgtacgcca acttaagacc atgtaacttt gcatccgact ctcttttaga cttatctcca 1020

atcaagccac aatttgctaa aggtactgac ttcgttgttg tcagagaatt agtgggaggt 1080

atttactttg gtaagagaaa ggaagacgat ggtgatggtg tcgcttggga tagtgaacaa 1140

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gagccaccat tgcctatttg gtccttggat aaagctaatc ttttggcctc ttcaagatta 1260

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caattgattg attctgccgc catgatccta gttaagaacc caacccacct aaatggtatt 1380

ataatcacca gcaacatgtt tggtgatatc atctccgatg aagcctccgt tatcccaggt 1440

tccttgggtt tgttgccatc tgcgtccttg gcctctttgc cagacaagaa caccgcattt 1500

ggtttgtacg aaccatgcca cggttctgct ccagatttgc caaagaataa ggttgaccct 1560

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ggtaaggcca ttgaagatgc agttaaaaag gttttggatg caggtatcag aactggtgat 1680

ttaggtggtt ccaacagtac caccgaagtc ggtgatgctg tcgccgaaga agttaagaaa 1740

atccttgctt aaaaagattc tcttttttta tgatatttgt acataaactt tataaatgaa 1800

attcataata gaaacgacac gaaattacaa aatggaatat gttcataggg tagacgaaac 1860

tatatacgca atctacatac atttatcaag aaggagaaaa aggaggatag taaaggaata 1920

caggtaagca aattgatact aatggctcaa cgtgataagg aaaaagaatt gcactttaac 1980

attaatattg acaaggagga gggcaccaca caaaaagtta ggtgtaacag aaaatcatga 2040

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taaaaaacac tcaatgacct gaccatttga tggagtttaa gtcaatacct tcttgaagca 2160

tttcccataa tggtgaaagt tccctcaaga attttactct gtcagaaacg gccttacgac 2220

gtagtcga 2228

<210> 16

<211> 2842

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accataaatt cccgttttaa gagcttggtg agcgctagga gtcactgcca attatttttt 240

gctttttctc ttgaggtcac atgatcgcaa aatggcaaat ggcacgtgaa gctgtcgata 300

ttggggaact gtggtggttg gcaaatgact aattaagtta gtcaaggcgc catcctcatg 360

aaaactgtgt aacataataa ccgaagtgtc gaaaaggtgg caccttgtcc aattgaacac 420

gctcgatgaa aaaaataaga tatatataag gttaagtaaa gcgtctgtta gaaaggaagt 480

ttttcctttt tcttgctctc ttgtcttttc atctactatt tccttcgtgt aatacagggt 540

cgtcagatac atagatacaa ttctattacc cccatccata caatgccatc tcatttcgat 600

actgttcaac tacacgccgg ccaagagaac cctggtgaca atgctcacag atccagagct 660

gtaccaattt acgccaccac ttcttatgtt ttcgaaaact ctaagcatgg ttcgcaattg 720

tttggtctag aagttccagg ttacgtctat tcccgtttcc aaaacccaac cagtaatgtt 780

ttggaagaaa gaattgctgc tttagaaggt ggtgctgctg ctttggctgt ttcctccggt 840

caagccgctc aaacccttgc catccaaggt ttggcacaca ctggtgacaa catcgtttcc 900

acttcttact tatacggtgg tacttataac cagttcaaaa tctcgttcaa aagatttggt 960

atcgaggcta gatttgttga aggtgacaat ccagaagaat tcgaaaaggt ctttgatgaa 1020

agaaccaagg ctgtttattt ggaaaccatt ggtaatccaa agtacaatgt tccggatttt 1080

gaaaaaattg ttgcaattgc tcacaaacac ggtattccag ttgtcgttga caacacattt 1140

ggtgccggtg gttacttctg tcagccaatt aaatacggtg ctgatattgt aacacattct 1200

gctaccaaat ggattggtgg tcatggtact actatcggtg gtattattgt tgactctggt 1260

aagttcccat ggaaggacta cccagaaaag ttccctcaat tctctcaacc tgccgaagga 1320

tatcacggta ctatctacaa tgaagcctac ggtaacttgg catacatcgt tcatgttaga 1380

actgaactat taagagattt gggtccattg atgaacccat ttgcctcttt cttgctacta 1440

caaggtgttg aaacattatc tttgagagct gaaagacacg gtgaaaatgc attgaagtta 1500

gccaaatggt tagaacaatc cccatacgta tcttgggttt cataccctgg tttagcatct 1560

cattctcatc atgaaaatgc taagaagtat ctatctaacg gtttcggtgg tgtcttatct 1620

ttcggtgtaa aagacttacc aaatgccgac aaggaaactg acccattcaa actttctggt 1680

gctcaagttg ttgacaattt aaagcttgcc tctaacttgg ccaatgttgg tgatgccaag 1740

accttagtca ttgctccata cttcactacc cacaaacaat taaatgacaa agaaaagttg 1800

gcatctggtg ttaccaagga cttaattcgt gtctctgttg gtatcgaatt tattgatgac 1860

attattgcag acttccagca atcttttgaa actgttttcg ctggccaaaa accatgagtg 1920

tgcgtaatga gttgtaaaat tatgtataaa cctactttct ctcacaagta ctatactttt 1980

ataaaacgaa ctttattgaa atgaatatcc tttttttccc ttgttacatg tcgtgactcg 2040

tactttgaac ctaaattgtt ctaacatcaa agaacagtgt taattcgcag tcgagaagaa 2100

aaatatggtg aacaagactc atctacttca tgagactact ttacgcctcc tataaagctg 2160

tcacactgga taaatttatt gtaggaccaa gttacaaaag aggatgatgg aggtttcttt 2220

acaataaaga agcacatgtg tgttaacgtt tttagtattt gcttgttatg taaatcagga 2280

aaacttcgcg ggatttggtt ggatgctact ttccatacaa taaatattat agatctaaaa 2340

agccaaatta caagtaaaga ttagtaaagc tgttggaatt ccatcgttga taaaaatgtt 2400

agttattaaa tataaaagtc agaataggtg aacttggatt taattgttgg catttcgttg 2460

ctgctagagg ccataatatt agatagccag gacatactag ttctcctcgt ggtataggaa 2520

tccataaaat ggaattggtg attctatgtg atatattcac attcttacta cattatcaat 2580

ccttgcactt cagcttcctc taacctcgat gacatcttct cataacttat gtcatcatct 2640

aacgccgtct attataatat attgatagta taagtattag ttgatagaca atagtggatt 2700

tttattccaa cagtgtcttt gttcgtctca gatatagtcg gattgccctt ttaagcaatc 2760

aatagtgttt tatttgcaac aatgtcgtca tagtttaata tgtcctataa gatgttaact 2820

tgctcaacat tcaacaaagt tt 2842