一种将菌毛黏附蛋白fimH应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法

摘要

本发明公开了一种将菌毛黏附蛋白fimH应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法，所述大肠杆菌基因工程菌是向大肠杆菌BL21中导入含esaI/R系统的pUC19‑PJ23119‑MCS质粒，并将其与黏附基因fimH相结合。本发明首次将大肠杆菌成膜相关的黏附基因fimH与群体感应系统esaI/R结合，通过群体感应信号分子之间的信号传递控制生物膜的形成、分解与扩散，建立特异性的调控方式，精确调控发酵过程中生物膜的形成过程，加强生物膜在发酵前中期的形成、削弱其后期的分解与扩散，提高生物膜固定化效率和催化效率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种将菌毛黏附蛋白fimH应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法。

背景技术

生物膜(biofilm)是自然界中微生物群落的一种形态。微生物聚集在一起，并分泌有机物，如多糖类物质覆盖其表面，形成一层膜状物质。微生物通过形成这种群落结构能够更好的适应外界环境，抵抗不利于生存的因素。在医学领域，由于致病菌常形成生物膜使得菌体耐药性提高，对于生物膜的研究已持续了较长的时间。而在工业发酵应用领域，生物膜形成的机理研究相对较少。特别是针对固定化细胞发酵特征的分子研究。

粘附蛋白是广泛存在于革兰氏菌中的一类黏附蛋白。在革兰氏阴性细菌中，由黏附蛋白组成的细胞运动器官，我们称其为菌毛。这些菌毛的作用主要是负责细菌细胞之间、细菌与非生物表面的黏附，并且与生物膜的形成和DNA的转移等相关联。大肠杆菌中有众多类型的菌毛，在大肠杆菌形成生物膜的过程中，已有大量研究表明大肠杆菌的I型菌毛促进生物膜形成，在生物膜形成阶段的可逆与非可逆阶段发挥重要的作用，它的存在能增强大肠杆菌细胞之间、细胞与非生物表面的黏附特性。I型菌毛的主要关键基因由fim家族调控，包括fimA、fimH等9个基因，fimH基因是I型菌毛的黏附素，负责与非生物表面的黏附，I型菌毛对于大肠杆菌生物膜的形成也有重要的作用，fimA基因和fimH基因是大肠杆菌生物膜形成的关键基因。

群体感应(quorum sensing，QS)是一种细菌细胞与细胞间的通讯系统，微生物间通过分泌扩散性小分子信号感知细菌群体的密度的变化，从而引起一组特定基因在转录水平协调表达。这种交流可使细菌表达不同的生理行为，包括调控生物发光、生物膜的形成、产生毒素、孢子的形成等。

随着对群体感应作用机制的研究深入，这一生物学特性可用于开发一种细胞密度依赖的自诱导动态调控工具。在大肠杆菌中，缺乏与LuxI具有相似功能负责合成AHLs的基因，它本身不能产生AHL信号分子，但是它们能编码LuxR同源蛋白，因此可以感应并对其他细菌产生的AHLs进行应答。

目前研究最多、应用最广的AHL介导的群体感应系统主要是来自于费氏弧菌的luxI/luxR系统和来自于玉米细菌性枯萎病菌中的esaI/esaR系统。在革兰阴性细菌的中，由luxI/luxR双组分构成的QS系统研究最广泛。而esaI/esaR系统与luxI/luxR系统同源，起源于玉米病原菌Pantoea stewartii亚种。与大多数LuxR同源物不同，esaR可以同时作为转录激活因子和抑制因子，并不依赖于是否和AHL信号分子结合。另外，PesaR是一种受esaR抑制的天然启动子，而PesaS是一种受esaR激活的天然启动子。在低细胞密度下，细胞产生的AHL信号分子较少，esaR与其靶DNA序列(esa box)结合，开启PesaS下游基因的表达，关闭PesaR启动子下游基因的表达。在高细胞密度下，细胞产生AHL信号分子较多，esaR释放了esa box与AHL结合，此时，启动子PesaR打开而PesaS关闭。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株含群体感应动态调控生物膜形成的大肠杆菌基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述大肠杆菌基因工程菌中所含质粒的构建方法。

本发明进一步要解决的技术问题是提供上述大肠杆菌基因工程菌的应用。

发明思路：esaI/esaR系统与luxI/luxR系统同源，且具有双向调节功能的群体感应系统，黏附基因fimH已被证明可促进大肠杆菌生物膜的形成，因此本发明利用fimH应用于esaI/esaR系统来实现动态调控的目的。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株大肠杆菌基因工程菌，向大肠杆菌BL21中导入含esaI/R系统的pUC19-PJ23119-MCS质粒，并将其与黏附基因fimH相结合，应用在提升大肠杆菌成膜量中，进一步在固定化发酵中提高发酵效率。

其中，所述esaI/R系统所含基因为核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的转录调控因子：esaI、esaR；核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的启动子：P

其中，所述fimH的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增得到esaI、esaR基因；以通用生物合成基因P

(2)以步骤(1)所得片段为模板，通过overlap PCR扩增得到esaI+esaR片段、P

(3)将步骤(2)所得基因片段克隆到质粒pUC19-PJ23119-MCS的HindⅢ和SacⅠ两个酶切位点之间，得到重组质粒pUC19-PJ23119-MCS-esaI/R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

(4)将步骤(3)所得重组质粒转化到大肠杆菌T1感受态中，从大肠杆菌T1中进行重组质粒的提取、纯化、回收；

(5)将步骤(4)提取得到的重组质粒转化到大肠杆菌BL21的感受态中，即得到大肠杆菌基因工程菌。

步骤(1)中，扩增esaI、esaR基因的引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的esaI-F、esaI-R、esaR-F、esaR-R。

步骤(1)中，扩增P

步骤(1)中，扩增mCherry、EGFP基因的引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的mcherry-F、mcherry-R、EGFP-F、EGFP-R。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述大大肠杆菌基因工程菌在产木聚糖酶中的应用。

其中，所述应用为将其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的木聚糖酶基因替换到所述大大肠杆菌基因工程菌中EGFP基因的位置，再将该菌接种到发酵培养基中发酵产木聚糖酶。

其中，所述发酵培养基为葡萄糖30g/L，氯化钠0.8g/L，硫酸铵20-22g/L，无水磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.8g/L，五水合硫酸锰0.02g/L，七水合硫酸铁0.02g/L，维生素B1 0.002g/L，酵母粉1g/L，碳酸钙15-30g/L。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

本发明首次将大肠杆菌成膜相关的黏附基因fimH与群体感应系统esaI/R结合，通过群体感应信号分子之间的信号传递控制生物膜的形成、分解与扩散，建立特异性的调控方式，精确调控发酵过程中生物膜的形成过程，加强生物膜在发酵前中期的形成、削弱其后期的分解与扩散，提高生物膜固定化效率和催化效率。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为实施例1中fimH、esaI、esaR、P

图2为实施例1中OVERLAP后的esaI+esaR片段、P

图3为实施例1中构建重组的表达质粒示意图。

图4为实施例1中质粒转化菌落PCR示意图。

图5为实施例2中荧光显微镜结果示意图。

图6为实施例3中酶标仪检测荧光强度结果示意图。

图7为实施例4中结晶紫染色实验结果示意图。

图8为实施例5中酶活测定实验结果示意图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

在以下所实施的方案当中，本发明所选用的大肠杆菌菌株是BL21，本发明所选用的以铜绿假单胞菌为ATCC 15692。

实施例1：目的菌株的构建

一、目的基因的扩增

(1)以原始大肠杆菌的基因组为模板，用普通PCR以fimH-F、fimH-R(序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示)为引物扩增得到fimH；以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，用普通PCR以esaI-F、esaI-R、esaR-F、esaR-R(序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示)为引物扩增得到esaI、esaR；以通用生物合成基因P

PCR反应体系见下表1，反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸2min；变性、退火、延伸三个步骤循环35次；68℃再延伸10min。其中，退火的温度取决于引物的Tm值，68℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb/min)。PCR完成后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图1，切胶回收得到目的基因fimH、esaI、esaR、P

表1 PCR反应体系

(2)以步骤(1)所得esaI基因及esaR基因为模板，以esaI-F为上引物、esaR-R为下引物，运用overlap PCR技术扩增得到esaI+esaR片段；以步骤(1)所得P

PCR反应体系见下表3，反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸2min；变性、退火、延伸三个步骤循环30次；68℃再延伸10min。其中，退火的温度取决于引物的Tm值，68℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb/min)。PCR完成后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图2，切胶回收得到三个片段组件esaI+esaR片段、P

表2 PCR反应体系

二、重组质粒的构建

(1)提质粒

将E.coli DH5α甘油菌(含质粒pUC19-PJ23119-MCS)接于液体LB(氨苄青霉素抗性，100μg/mL)，37℃培养12小时。用1.5mL的离心管收集上一步骤所培养的细胞，以10000rpm，离心2min，去上清。依照Corning生命科学有限公司的AxyPrep质粒提取试剂盒，提取出质粒pUC19-PJ23119-MCS。

(2)载体的线性化

为了将目的基因片段(esaI+esaR、P

其中，所述的buffer：10×Loading buffer：0.9％SDS，50％Glycerol，0.05％Bromophenol Blue；

所述的HindⅢ酶：限制性内切酶

所述的SacⅠ酶：限制性内切酶

酶活的定义：在50μL反应液中，37℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

(3)构建质粒pUC19-PJ23119-MCS-esaI/R

将上述三个片段(esaI+esaR、P

表3多片段一步克隆反应体系

其中，所述的双酶切后的质粒pUC19-PJ23119-MCS、纯化后的基因片段esaI+esaR、纯化后的基因片段P

(4)重组质粒的转化与筛选

取出TI感受态细胞冰上解冻至液态，预冷离心管中加入比例为10:1v/v的感受态细胞和重组质粒pUC19-PJ23119-MCS-esaI/R。冰上放置30min，于42℃水浴锅进行热激，热激90秒。冰盒中冷却3分钟，加入1mL LB后于摇床37℃、200rpm培养1小时，离心去除大部分上清后重悬菌液并涂布于氨苄青霉素抗性平板。37℃培养箱过夜培养，挑取平板上的单点，接入摇管中氨苄青霉素抗性，100μg/mL)，然后提质粒pUC19-PJ23119-MCS-esaI/R，进行测序验证。

三、重组菌株的构建

上述重组质粒验证成功后，构建含esaI/R系统菌株，命名为大肠杆菌BL21-R。将验证成功的质粒以相同的转化方法转入到大肠杆菌BL21感受态中，挑取单菌落进行菌落PCR验证。菌落PCR实验结果如图4所示，可见转化成功。

实施例2：对原始菌BL21及改造菌BL21-R进行荧光显微镜观察

(1)将甘油菌WT(原始菌BL21)和改造菌BL21-R(实施例1构建得到的含esaI/R系统的菌株)各取100μL加入灭菌的5mL LB液体培养基中过夜培养(氨苄青霉素抗性，100μg/mL)，活化；

(2)按照体积比1：10的比例，将步骤(1)活化的菌液转接至100mL的LB液体培养基(氨苄青霉素抗性，100μg/mL；在适当的时候加入1M L-阿拉伯糖3mL诱导)，在37℃、220rpm条件下继续培养13h；

(3)将步骤(2)培养好的菌液取样后直接在荧光显微镜下观察，荧光显微镜结果如图5所示，表明原始没有发光而改造菌有发光，说明改造菌BL21-R的esaI/R系统构建无误。

实施例3：对改造菌BL21-R用进行酶标仪检测荧光强度实验

(1)因为原始菌BL21在上述荧光显微镜观察中没有发光，所以荧光强度检测实验仅对改造菌进行了检测。将改造菌BL21-R(实施例1构建得到的含esaI/R系统的菌株)取100μL加入灭菌的5mL LB液体培养基中过夜培养(氨苄青霉素抗性，100μg/mL)，活化；

(2)按照体积比1：10的比例，将步骤(1)活化的菌液转接至100mL的LB液体培养基(氨苄青霉素抗性，100μg/mL)，在37℃、220rpm条件下继续培养，每隔4h取一次样，共取48h；

(3)将取好的样品用PBS缓冲液稀释20倍，在96孔板中加入200μL，用酶标仪分别在不同的波长下进行检测：检测激发波长485nm、发射波长528nm的绿色荧光强度，检测激发波长587nm、发射波长610nm的红色荧光强度。荧光强度如图6所示，红色荧光(mCherry)在前期比较强，绿色荧光(EGFP)强度后期较强，与我们esaI/R系统过程及实验设计理念相符合，可以进行下一步的应用。

实施例4：生物膜结晶紫染色实验

1)将甘油菌WT(原始菌BL21)和改造菌BL21-R(实施例1构建得到的含esaI/R系统的菌株)各取100μL加入灭菌的5mL LB液体培养基中过夜培养(氨苄青霉素抗性，100μg/mL)，活化；

(2)按照体积比1：10的比例，将步骤(1)活化的菌液转接至100mL的LB液体培养基，在37℃、220rpm条件下继续培养至菌液OD600值在0.8-1.2之间；

(3)取2mL菌液在OD600下测吸光度值，用灭菌的LB液体培养基稀释菌液，使得稀释后菌液OD600为1；

(4)取200μL稀释后的菌液加入96孔板中，用液体培养基做对照，37℃培养12h、24h和36h；

(5)将96孔板中菌液倒出，取200μL 0.01M PBS缓冲液清洗2-3次，拍干；

(6)加入200μL多聚甲醛固定液固定15min后，倒掉晾干。

(7)取200μL 1％结晶紫溶液加入96孔板，染色10-20min，再用PBS缓冲液冲洗2-3次，拍干；

(8)取200μL冰醋酸加入96孔板溶解生物膜，轻轻振荡40min，测量OD570nm生物膜产率，取平均值。结晶紫染色实验结果如图7所示，原始菌生物膜量在0.3786，改造菌生物膜量在0.9649，改造菌生物膜量提高了2.54倍，表明改造菌株BL21-R生物膜明显增多，可以进行生物膜固定化发酵实验。

实施例5：将改造菌BL21-R应用在固定化发酵产木聚糖酶

(1)将木聚糖酶基因xyn(来源于嗜热厌氧杆菌属Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum M5)替换到EGFP基因的位置。

替换方式利用酶切位点将重组质粒的EGFP切掉再用诺唯赞的一步克隆试剂盒C112进行一步克隆将xyn连上，具体步骤与上述实施例1步骤(3)相似，得菌株BL21-R-xyn。

同时构建一株只含xyn基因的菌株WT-xyn(方法与上述相同，所用质粒为不含esaI/R系统的空质粒PUC19)。

(2)将步骤(1)得到的菌进行固定化发酵产木聚糖酶

将WT-xyn、BL21-R-xyn从-80℃冰箱取出，试管中准备5mL LB培养基其中一瓶含有100μg/mL氨苄青霉素，1％接种量。于37℃摇床中培养12h，转速200rpm，得到菌液。

把上述得到的菌液稀释到OD＝0.1接种于100mL的LB发酵培养基中(培养基中事先放入剪成四方形5g的棉纤维)，于37℃摇床中培养36h，转速200-220rpm。

其中，LB发酵培养基：葡萄糖30g/L，氯化钠0.8g/L，硫酸铵20g/L，无水磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.8g/L，五水合硫酸锰0.02g/L，七水合硫酸铁0.02g/L，维生素B10.002g/L，酵母粉1g/L，碳酸钙15g/L。

检测方法：木聚糖酶活采用二硝基水杨酸法(DNS)来测定，二硝基水杨酸可与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，其在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内，其颜色深浅与还原糖含量成比例关系。反应过程如下：1mL酶液(必要时稀释一定倍数)和1mL 1％木聚糖(溶于pH6.0的PBS缓冲液)于55℃水浴锅反应10min，而后加入2mLDNS溶液，沸水浴5min，定容至25mL，测A540。酶活定义(U)：每分钟生成1μM木糖所需的酶量。

酶活实验结果如图8所示，原始菌WT-xyn酶活测定为0.55U/mg，改造菌BL21-R-xyn酶活测定为0.97U/mg，改造菌酶活提高1.76倍。

本发明提供了一株含esaI/R群体感应系统的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种将菌毛黏附蛋白fimH应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 606

<212> DNA

<213> esaI

<400> 1

atgatcgtac aaattggtcg gcgcgaagag ttcgataaaa aactgctggg cgagatgcac 60

aagttgcgtg ctcaagtgtt caaggagcgc aaaggctggg acgttagtgt catcgacgag 120

atggaaatcg atggttatga cgcactcagt ccttattaca tgttgatcca ggaagatact 180

cctgaagccc aggttttcgg ttgctggcga attctcgata ccactggccc ctacatgctg 240

aagaacacct tcccggagct tctgcacggc aaggaagcgc cttgctcgcc gcacatctgg 300

gaactcagcc gtttcgccat caactctgga cagaaaggct cgctgggctt ttccgactgt 360

acgctggagg cgatgcgcgc gctggcccgc tacagcctgc agaacgacat ccagacgctg 420

gtgacggtaa ccaccgtagg cgtggagaag atgatgatcc gtgccggcct ggacgtatcg 480

cgcttcggtc cgcacctgaa gatcggcatc gagcgcgcgg tggccttgcg catcgaactc 540

aatgccaaga cccagatcgc gctttacggg ggagtgctgg tggaacagcg actggcggtt 600

tcatga 606

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> esaR

<400> 2

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gccatcctgc agaagatggc gagcgacctt ggattctcga agatcctgtt cggcctgttg 120

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gtgacctccc gccgcgtagc ggccattatg gccgttaatt tgggtcttat tactctctga 720

<210> 3

<211> 184

<212> DNA

<213> PesaS

<400> 3

gctcacaaca gtgtaagcgt atccgttatt gtttgatttt caaggaaaaa agaaaacatt 60

caggctccat gctgcttctt ttacttaacg tggacttaac ctgcactata gtacaggcaa 120

gatgatactt aagagtaact tacaatgaat cattcagagg ttacaatggc ttcagttgtt 180

tagc 184

<210> 4

<211> 102

<212> DNA

<213> PesaR

<400> 4

ttgtaacctc tgaatgattc attgtaagtt actcttaagt atcatcttgc ctgtactata 60

gtgcaggtta agtccacgtt aagtaaaaga agcagcggat cc 102

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> mCherry

<400> 5

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gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt ttctagagga catcacctcc cacaacgagg actacaccat cgtggaacag 660

tacgaacgcg ccgagggccg ccactccacc ggcggcatgg acgagctgta caagtaa 717

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> EGFP

<400> 6

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ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

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<211> 903

<212> DNA

<213> fimH

<400> 7

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tcattcgcct gtaaaaccgc caatggtacc gctatcccta ttggcggtgg cagcgccaat 120

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agtagctatc catttcctac caccagcgaa acgccgcgcg ttgtttataa ttcgagaacg 360

gataagccgt ggccggtggc gctttatttg acgcctgtga gcagtgcggg cggggtggcg 420

attaaagctg gctcattaat tgccgtgctt attttgcgac agaccaacaa ctataacagc 480

gatgatttcc agtttgtgtg gaatatttac gccaataatg atgtggtggt gcctactggc 540

ggctgcgatg tttctgctcg tgatgtcacc gttactctgc cggactaccc tggttcagtg 600

ccaattcctc ttaccgttta ttgtgcgaaa agccaaaacc tggggtatta cctctccggc 660

acaaccgcag atgcgggcaa ctcgattttc accaataccg cgtcgttttc acctgcacag 720

ggcgtcggcg tacagttgac gcgcaacggt acgattattc cagcgaataa cacggtatcg 780

ttaggagcag tagggacttc ggcggtgagt ctgggattaa cggcaaatta tgcacgtacc 840

ggagggcagg tgactgcagg gaatgtgcaa tcgattattg gcgtgacttt tgtttatcaa 900

taa 903

<210> 8

<211> 6959

<212> DNA

<213> pUC19-PJ23119-MCS-esaI/R

<400> 8

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg cttgacagct agctcagtcc taggtataat actagttttc 180

acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttaa gaaaccaatt gtccatattg 240

catcagacat tgccgtcact gcgtctttta ctggcacttc tcgctaacca aaccggtaac 300

cccgcttatt aaaagcattc tgtaacaaag cgggaccaaa gccatgacaa aaacgcgtaa 360

caaaagtgtc tataatcacg gcagaaaagt ccacattgat tatttgcacg gcgtcacact 420

ttgctatgcc atagcatttt tatccataag attagcggat cctacctgac gctttttatc 480

gcaactctct actgtttctc catgtcgaca tgatcgtaca aattggtcgg cgcgaagagt 540

tcgataaaaa actgctgggc gagatgcaca agttgcgtgc tcaagtgttc aaggagcgca 600

aaggctggga cgttagtgtc atcgacgaga tggaaatcga tggttatgac gcactcagtc 660

cttattacat gttgatccag gaagatactc ctgaagccca ggttttcggt tgctggcgaa 720

ttctcgatac cactggcccc tacatgctga agaacacctt cccggagctt ctgcacggca 780

aggaagcgcc ttgctcgccg cacatctggg aactcagccg tttcgccatc aactctggac 840

agaaaggctc gctgggcttt tccgactgta cgctggaggc gatgcgcgcg ctggcccgct 900

acagcctgca gaacgacatc cagacgctgg tgacggtaac caccgtaggc gtggagaaga 960

tgatgatccg tgccggcctg gacgtatcgc gcttcggtcc gcacctgaag atcggcatcg 1020

agcgcgcggt ggccttgcgc atcgaactca atgccaagac ccagatcgcg ctttacgggg 1080

gagtgctggt ggaacagcga ctggcggttt catgataatg tgagttagct cactcattag 1140

gcaccccagg cttgacagct agctcagtcc taggtataat actagtatgg ccttggttga 1200

cggttttctt gagctggaac gctcaagtgg aaaattggag tggagcgcca tcctgcagaa 1260

gatggcgagc gaccttggat tctcgaagat cctgttcggc ctgttgccta aggacagcca 1320

ggactacgag aacgccttca tcgtcggcaa ctacccggcc gcctggcgcg agcattacga 1380

ccgggctggc tacgcgcggg tcgacccgac ggtcagtcac tgtacccaga gcgtactgcc 1440

gattttctgg gaaccgtcca tctaccagac gcgaaagcag cacgagttct tcgaggaagc 1500

ctcggccgcc ggcctggtgt atgggctgac catgccgctg catggtgctc gcggcgaact 1560

cggcgcgctg agcctcagcg tggaagcgga aaaccgggcc gaggccaacc gtttcatgga 1620

gtcggtcctg ccgaccctgt ggatgctcaa ggactacgca ctgcagagcg gtgccggact 1680

ggccttcgaa catccggtca gcaaaccggt ggttctgacc agccgggaga aggaagtgtt 1740

gcagtggtgc gccatcggca agaccagttg ggagatatcg gttatctgca actgctcgga 1800

agccaatgtg aacttccata tgggaaatat tcggcggaag ttcggtgtga cctcccgccg 1860

cgtagcggcc attatggccg ttaatttggg tcttattact ctctgagcat gcgctcacaa 1920

cagtgtaagc gtatccgtta ttgtttgatt ttcaaggaaa aaagaaaaca ttcaggctcc 1980

atgctgcttc ttttacttaa cgtggactta acctgcacta tagtacaggc aagatgatac 2040

ttaagagtaa cttacaatga atcattcaga ggttacaatg gcttcagttg tttagcgtcg 2100

acatgaaacg agttattacc ctgtttgctg tactgctgat gggctggtcg gtaaatgcct 2160

ggtcattcgc ctgtaaaacc gccaatggta ccgctatccc tattggcggt ggcagcgcca 2220

atgtttatgt aaaccttgcg cccgtcgtga atgtggggca aaacctggtc gtggatcttt 2280

cgacgcaaat cttttgccat aacgattatc cggaaaccat tacagactat gtcacactgc 2340

aacgaggctc ggcttatggc ggcgtgttat ctaatttttc cgggaccgta aaatatagtg 2400

gcagtagcta tccatttcct accaccagcg aaacgccgcg cgttgtttat aattcgagaa 2460

cggataagcc gtggccggtg gcgctttatt tgacgcctgt gagcagtgcg ggcggggtgg 2520

cgattaaagc tggctcatta attgccgtgc ttattttgcg acagaccaac aactataaca 2580

gcgatgattt ccagtttgtg tggaatattt acgccaataa tgatgtggtg gtgcctactg 2640

gcggctgcga tgtttctgct cgtgatgtca ccgttactct gccggactac cctggttcag 2700

tgccaattcc tcttaccgtt tattgtgcga aaagccaaaa cctggggtat tacctctccg 2760

gcacaaccgc agatgcgggc aactcgattt tcaccaatac cgcgtcgttt tcacctgcac 2820

agggcgtcgg cgtacagttg acgcgcaacg gtacgattat tccagcgaat aacacggtat 2880

cgttaggagc agtagggact tcggcggtga gtctgggatt aacggcaaat tatgcacgta 2940

ccggagggca ggtgactgca gggaatgtgc aatcgattat tggcgtgact tttgtttatc 3000

aataaatggt gagcaagggc gaggaggata acatggccat catcaaggag ttcatgcgct 3060

tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg 3120

agggccgccc ctacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc 3180

tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc agttcatgta cggctccaag gcctacgtga 3240

agcaccccgc cgacatcccc gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg 3300

agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc 3360

aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc 3420

ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg 3480

acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg 3540

acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca 3600

acgtcaacat caagtttcta gaggacatca cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg 3660

aacagtacga acgcgccgag ggccgccact ccaccggcgg catggacgag ctgtacaagt 3720

aattgtaacc tctgaatgat tcattgtaag ttactcttaa gtatcatctt gcctgtacta 3780

tagtgcaggt taagtccacg ttaagtaaaa gaagcagcgg atccctcgag atggtgagca 3840

agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa 3900

acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga 3960

ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca 4020

ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact 4080

tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg 4140

acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca 4200

tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt 4260

acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg 4320

tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc 4380

agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca 4440

cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt 4500

tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa gagctcgaat 4560

tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 4620

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 4680

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 4740

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 4800

gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 4860

gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 4920

tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc 4980

ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt 5040

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 5100

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 5160

agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 5220

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 5280

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 5340

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 5400

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 5460

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 5520

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 5580

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 5640

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 5700

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 5760

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 5820

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 5880

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 5940

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 6000

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 6060

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 6120

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 6180

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 6240

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 6300

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 6360

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 6420

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 6480

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gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 6840

tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 6900

accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaaga 6959

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<212> DNA

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caatggcttc agttgtttag cgtcgacatg aaacgagtta ttaccct 47

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<211> 47

<212> DNA

<213> fimH-R

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atcctcctcg cccttgctca ccatttattg ataaacaaaa gtcacgc 47

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gcaactctct actgtttctc catgtcgaca tgatcgtaca aattggtcgg 50

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gtcaaccaag gccatactag tattatacct aggactgagc tagctgtcaa tcatgaaacc 60

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aaatttttat ttggttgtgg agcatttgat tctcttcctc ttgccaatgg tgaattgaaa 180

gaaaatgata aagaaaaaat tgaagaccgt tttgagaaat tttttgactt atttaactat 240

gctacgattc cattttattg gggcaggttc gagcctgaaa aaggaaagcc agacacaaat 300

agactcaaaa aggcttcaga atggcttgta tcaaaaggtt gccttgtaaa aggccatcca 360

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aaggctcagc tatcccgcat aaaacgtgaa gtaagcgatt ttaaaggatt agtgaatata 480

tgggatgtaa taaatgaagt tgtcatcatg cctatttttg ataaatacga caatggaata 540

accaggatat gcaaagaatt aggccgtatt cgcctcgtaa aagaagtttt taatgaagct 600

aaaaaagcta atcctgaagc agttctcctt ataaatgact ttaatacatc aatttcatac 660

gaaatactca tagaaggatg ccttgaagct ggaatcccta ttgatgccat aggaattcag 720

tcacacatgc atcaaggata ttggggagtt gaaaaaactt tagaagtact tgaaagattt 780

tcgcatttca acattccatt gcattttaca gaaaacacat tattatcagg gcatttgatg 840

ccacctgaaa tagaagactt aaatgactac cagataaggg attggccttc aacacctgat 900

ggtgaagaac gacaagcgat ggaaatagta cagcattaca aaactctttt ttcacatcca 960

atggtagaat caattacgtg gtggaatttt tgtgatgaaa atgcatggct tggtgcacca 1020

gcaggtcttt tacgccgtga caattcatgc aaaccatcat attacgaatt aaaaaagctt 1080

ataaaagatg aatggtggac acatcctaca cgtcttgtca caagtaacac aggcgaattt 1140

gaatttacag gtttcttagg cgaatacgaa ttagtcatta gcgataaaag gttttacttt 1200

acccttgata aaaacagcac aacaattgaa atcacgattt aa 1242