Ai-2群体感应系统对禽致病大肠杆菌耐药性的调控机制研究

摘要

禽致病大肠杆菌家禽养殖业中常见的致病菌之一，是制约中国家禽养殖业持续发展，给养殖场和相关肉、蛋等副产业带来巨大损失的原因之一。抗生素的长期使用已使得禽致病大肠杆菌的耐药性不断增强，成为当今养殖业面临的重要难题，通过研究大肠杆菌耐药的发生与转移的调控机制，寻找新的防治耐药大肠杆菌的潜在药物靶点，对控制禽致病大肠杆菌耐药菌株的感染具有十分重要的意义。群体感应系统是普遍见于各类细菌的重要调控系统，Autoinducer-2(AI-2)是大肠杆菌产生的主要群体感应信号分子，在多重耐药的禽致病大肠杆菌中，AI-2与其致病性及耐药基因的表达调控是否有关联，学术界鲜有报道。
　　探寻了AI-2对禽致病大肠杆菌卡那霉素耐药性的影响效应，进而研究其对卡那霉素耐药基因aadA的调控机制，发现AI-2群体感应系统能够通过下调aadA的表达水平使禽致病大肠杆菌对卡纳霉素更加敏感。
　　1.为了检测禽致病大肠杆菌分离株的耐药性，本试验利用二倍稀释法检测了禽致病大肠杆菌分离株APEC28，APEC32和APEC56对卡那霉素的耐药性，结果发现，APEC28，APEC32和APEC56对卡那霉素的最小抑菌浓度分别为2.5mg/mL，2.5mg/mL和5mg/mL，表明APEC28，APEC32和APEC56这三株禽致病性大肠杆菌分离株为卡那霉素耐药菌。
　　2.本试验利用PCR扩增技术和BLAST软件进行对比分析检测禽致病大肠杆菌分离株的耐药基因。结果发现，耐药基因aadA编码腺嘌呤转移酶，是导致禽致病大肠杆菌耐药的主要原因。
　　3.本试验利用生长曲线法和菌落计数法(CFU)通过体外添加AI-2检测其对禽致病大肠杆菌生长的影响，结果表明，体外添加AI-2可使APEC28，APEC32和APEC56的耐药性降低。进而证明禽致病大肠杆菌分离株可通过AI-2下调其耐药性。
　　4.本试验利用反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测卡那耐药基因aadA的转录水平。结果显示，在卡那霉素压力下，体外添加AI-2会导致APEC28的卡那耐药基因aadA的转录水平在不同时间分别降低1.75倍、2.6倍和1.2倍;APEC32的卡那耐药基因aadA的转录水平在不同时间分别降低1.2倍、2.7倍和1.5倍;APEC56的卡那耐药基因aadA的转录水平在不同时间分别降低1.5倍、2倍和1.2倍。
　　本项目拟以前期研究为基础，利用微生物学、分子生物学等研究手段，探寻AI-2群体感应对禽致病大肠杆菌卡那霉素抗性基因aadA表达的影响及调控机制，该研究的进一步深入或可为控制耐药型禽致病大肠杆菌的感染提供新的药物靶标与治疗思路。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩写词表

文献综述

1．大肠杆菌的研究进展概述

2．大肠杆菌血清型分析

3．大肠杆菌耐药性研究概述

4．群体感应系统研究进展

5．群体感应信号分子AI-2的作用机制

1． 引言

1．1 本课题研究的目的及意义

1．2 国内外研究进展

1．3 研究内容与方法

1．4 主要技术路线

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株来源

2．1．2 试剂

2．1．3 培养基和常用试剂的配制

2．1．4 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 分子生物学法鉴定菌株

2．2．2 APEC药敏试验

2．2．3 群体感应信号分子AI-2对APEC生长的影响

2．2．4 APEC耐药基因及种类检测

2．2．5 APEC总RNA的提取

2．2．6 反转录实时荧光定量PCR检测AI-2对lsrR和aadA基因的影响

3． 结果

3．1 分子生物学法鉴定菌株

3．2 APEC药敏试验

3．3．1 比浊法

3．3．2 菌落计数法(CFU法)

3．4 APEC耐药基因及种类检测

3．5 反转录实时荧光定量PCR(RT-q PCR)

3．5．1 总RNA质量鉴定

3．5．2 反转录实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对lsrR和aadA转录水平检测

4．讨论

4．1 禽致病大肠杆菌研究现状

4．2 氨基糖苷类修饰酶的作用

4．3 群体感应信号分子AI-2对禽致病大肠杆菌的影响

4．4 试验展望

5．结论

参考文献

作者简介

附在校读研期间发表的学术论文