一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊叶枯病球毛壳菌的方法

摘要

本发明提供了一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊球毛壳菌C.globosum的方法，包括如下步骤：借助PCR技术对杭白菊球毛壳菌C.globosum特异性基因片段进行扩增；在crRNA的介导下，Cas12a特异性识别扩增产物，并激活核酸酶活性，从而切割两端修饰有FAM和BHQ1的任意碱基序列ssDNA(Reporter)，形成FAM‑ssDNA片段与BHQ1‑ssDNA片段；FAM‑ssDNA和BHQ1‑ssDNA能在蓝光透射仪的照射下展现出荧光，由此实现对于杭白菊球毛壳菌C.globosum的检测。该方法操作简单便携，不依赖大型仪器设备，成本低廉，且灵敏度高、特异性强，具有一定的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物与化学领域，涉及一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊叶枯病球毛壳菌Chaetomium globosum(C.globosum，Cg)的方法。

背景技术

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR，Clustered regularly interspacedshortpalindromic repeats)是许多细菌和古细菌中的一种应对入侵的免疫机制。CRISPR及CRISPR相关蛋白(CRISPR associated proteins,Cas)被称为CRISPR/Cas系统。Cas12a为第2类V型Cas蛋白，它在未激活时无切割活性，当其与特定的crRNA结合后，Cas12a构象将发生改变，与crRNA结合形成Cas12a-crRNA二元复合物。该复合物能特异性得识别靶标DNA，并激活其核酸内切酶活性。当Cas12a依次对DNA双链进行顺式切割后，该活性位点将持续暴露，展现出反式切割活性，对周围的ssDNA进行非特异性切割。针对Cas12a的特性，科学家们设计了多种高灵敏度、高特异性的核酸检测平台。

杭白菊(Chrysanthemum morifolium Ramat)为菊科菊属，是我国传统的药用栽培植物和浙江省八大药材“浙八味”之一。目前浙江杭白菊常年种植面积7万亩，年均总产值超过1亿元，约占全国菊花总销量的50％。现代药理研究表明其具有消炎、抗氧化、抗癌，舒血管、降血脂、改善肠道微环境等多种功效。而叶枯病是杭白菊主要的叶片病害，病叶初期先变黄，黄色部分逐渐变褐色坏死。由局部扩展到整个叶脉，呈现褐色至红褐色的叶缘病斑，病斑边缘波状，颜色较深。病健交界明显，其外缘有时还有宽窄不等的黄色浅带，随后，病斑逐渐向叶基部延伸，直至整个叶片变为褐色至灰褐色。叶枯病的产生严重影响了农产品的经济效益。然而，传统的分离鉴定法检验周期较长，操作步骤繁复，耗时费力，难以满足田间的便捷检测的需求，因此，克服传统分离鉴定方法的局限，引入前沿技术，开发出准确、快速、便捷、灵敏、特异的杭白菊叶枯病球毛壳菌C.globosum菌检测技术具有重大意义。

现阶段杭白菊叶枯病球毛壳菌C.globosum的检测技术主要依赖分子生物学或免疫学检测的方法。分子生物学依靠对目的基因ITS序列进行扩增，然后通过进化树分析确定物种信息。整个过程需要7-10天的时间，无法进行快速检测。或者通过荧光定量PCR的方法确定特异性基因的表达水平，但该类检测方法对仪器和检测人员的技术要求较高，同时需要昂贵的实验设备，难以实现现场即时检测；免疫学用两个特异性探针分别对自然感染白叶枯菌和条斑菌的叶片M1N提取液和种子浸泡液进行实时荧光GHI，此类检测方法检测虽然特异性好，但灵敏度较低，耗时较长，成本较高，因此并不适用于基层大批量检测。

发明内容

本发明的目的在于克服传统叶枯病球毛壳菌C.globosum检测的技术缺陷，以特异性基因片段为检测目标，提供一种简单、快速、灵敏、特异、便携的检测方法。

为此，本发明采用的技术方案如下：

利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊叶枯病球毛壳菌C.globosum的方法，其包括如下步骤：

步骤一：对杭白菊叶枯病球毛壳菌C.globosum基因组中的特异性目的基因片段进行PCR扩增；

PCR扩增所用引物序列包括：

C.g-PCR-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

C.g-PCR-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

步骤二：将扩增的PCR产物加入含CRISPR/Cas体系的反应管中，孵育，所述的CRISPR/Cas体系包括针对目的基因的特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和用于酶标仪荧光检测的reporter序列，crRNA序列如SEQ ID No.3所示；在crRNA的介导下，CRISPR/Cas12a蛋白特异性识别特异性基因片段的扩增片段，并激活核酸酶活性，从而切割两端修饰有FAM和BHQ1的reporter序列形成FAM-ssDNA与BHQ1-ssDNA；

步骤三：FAM-ssDNA与BHQ1-ssDNA在蓝光投射仪下显现出荧光，实现对于杭白菊叶枯病球毛壳菌C.globosum的可视化检测。

作为本发明的优选方案，步骤一中，PCR步骤为：95℃预变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共循环30次；后72℃延伸10min。

作为本发明的优选方案，步骤二中，孵育温度为37℃，孵育时间为30min。

作为本发明的优选方案，所述reporter序列为用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQreporter，其序列如下：5’-FAM-NNNNN-BHQ1-3’，NNNNN指任意碱基序列。

作为本发明的优选方案，步骤二中，Cas12a浓度为100nM，Cas12a与crRNA的浓度比为1:1-1:5，Reporter序列的浓度为250-2000nM。

作为本发明的优选方案，步骤二中，CRISPR/Cas12a体系的反应温度为35-40℃，反应时间为10-90min；

作为本发明的优选方案，步骤三中，反应管直接于蓝光透射仪的照射下展现出荧光，实现对于杭白菊叶枯病球毛壳菌C.globosum的可视化检测。

由上述对本发明的描述可知，本发明提出了一种CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊叶枯病球毛壳菌C.globosum的新方法。与现有的检测方法相比，该方法具有灵敏度高、特异性强、快速高效、操作便捷、用户友好且价格低廉等优点，是一种具有广泛推广价值的杭白菊叶枯病球毛壳菌C.globosum即时检测新平台。

附图说明

图1为本发明的工作原理图。

图2为本发明中阳性样品的检出图。

图3为不同杭白菊球毛壳菌C.globosum含量的样品对检测的影响情况；

图4为采用凝胶电泳分析后，杭白菊球毛壳菌C.globosum含量与荧光强度之间的关系。

图5为本发明对样品的检测可行性实验的结果图。

图6为本发明对杭白菊球毛壳菌C.globosum的检测特异性实验的结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述：

一、CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊球毛壳菌C.globosum

利用热裂解法对实际样本进行预处理，无菌条件下，取样品匀液1mL至灭菌离心管中，8000×g离心2min，弃上清；用200μL的灭菌去离子水重悬，8000×g离心2min，弃上清；加入100μL的灭菌去离子水，于100℃煮沸10min；将热裂解液8000×g离心2min，取上清液作为后续扩增反应的底物(即Target DNA)，如图1为具体的操作步骤。利用PCR扩增技术对目标片段的扩增，特异性基因片段体系所用引物即SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

具体的，SEQ ID No.1序列：

5’-CGTTACCTATACCGTTGC-3’；

SEQ ID No.2序列：

5’-AGAGCGAGATGTATGCTACT-3’；

构建CRISPR/Cas12a反应体系，加入250nM Cas12a、100nM crRNA(即SEQ ID No.3：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGCCUCUCUGAGUCUUCUGUACU-3’；)、1000nM FAM-Reporter-BHQ1(5’-FAM-NNNNN-BHQ1-3’；NNNNN代表任意碱基序列)、2μL扩增产物、2μL buffer C(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl

二、本发明方法检测杭白菊球毛壳菌C.globosum的灵敏度表征

为考察本发明对杭白菊样品中杭白菊球毛壳菌C.globosum的检测灵敏度，将具有不同含量6.5ng/μl、650pg/μl、65pg/μl、6.5pg/μl、650fg/μl、65fg/μl、6.5fg/μl、650ag/μl、65ag/μl杭白菊球毛壳菌C.globosum含量的样品经本发明的特异性基因片段体系所用引物PCR扩增后，利用本发明的CRISPR/Cas12a体系可视化检测方法对特异性基因片段体系进行分析。图3展示了不同杭白菊球毛壳菌C.globosum含量的样品对检测荧光强度的影响情况，经裸眼观测可直接识别低至的65ag/μl杭白菊球毛壳菌C.g。图4展现了对应的扩增子跑胶分析可知，本发明的方法的检出限为65ag/μl。

三、本发明方法检测杭白菊样品中的杭白菊球毛壳菌C.globosum

利用该CRISPR/Cas12a体系可视化检测方法分别对最低检出限的65ag/μl杭白菊球毛壳菌C.globosum的不同样品进行检测。如图5展示了对①Cas12a+crRNA+substrate②Cas12a+crRNA③Cas12a+substrate④crRNA+substrate的特异性基因片段体系的荧光检测情况，结果显示，只有含substrate的Cas12a以及特异性crRNA能够产生可视性荧光。说明该CRISPR/Cas12a体系可视化检测方法具有良好的检测能力。

四、本发明方法的检测特异性表征

为表征该CRISPR/Cas12a体系可视化检测方法对检测杭白菊球毛壳菌C.globosum的特异性，利用杭白菊球毛壳菌C.globosum分离株及根腐病砖红镰刀菌F.in、黑斑病菌Alt分离株为检测样本进行该方法的检测。通过蓝光照射仪观察，如图6所示展示了对杭白菊球毛壳菌C.globosum和非杭白菊球毛壳菌C.globosum的荧光检测情况；利用杭白菊黑斑病菌Alternaria alternata(Alt)、根腐病砖红镰刀菌Fusarium incarnatum(Fin)、叶枯病球毛壳菌C.globosum(C.g)临床分离株为检测样本，进行样品预处理、C.globosum特异性基因片段体系所用引物即SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行PCR扩增，利用C.globosum的crRNA即SEQ ID No.3进入CRISPR/Cas12a体系可视化检测体系进行分析，经裸眼观测及热图展现，杭白菊球毛壳菌C.g临床分离株在蓝光透射仪下检测显示为阳性；对根腐病砖红镰刀菌F.in、黑斑病菌Alt的特异性体系的荧光检测均显示阴性。说明该CRISPR/Cas12a体系可视化检测方法具有良好的准确性和特异性。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测杭白菊叶枯病球毛壳菌的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgttacctat accgttgc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagcgagat gtatgctact 20

<210> 3

<211> 45

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga uuggccucuc ugagucuucu guacu 45