枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其与球毛壳菌协同防治黄瓜枯萎病的研究

摘要

黄瓜枯萎病是由尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）引起的一种严重危害黄瓜生产的土传真菌病害，严重时甚至会导致黄瓜绝产。生产中主要通过嫁接防治、化学防治等措施来防治黄瓜枯萎病，但是这些措施也有自身的不足和问题，如嫁接前种子带病、造成环境污染等。近年来，生物防治凭借绿色安全无污染等特点受到越来越多的关注，逐渐成为黄瓜枯萎病的一种重要防治措施。本研究采用对峙培养和盆栽试验筛选鉴定出拮抗黄瓜枯萎病菌的优良细菌菌株；盆栽试验筛选出防治黄瓜枯萎病的生防细菌与真菌的优良组合；通过检测各处理植株的根系活力、总活性氧含量、植物防御酶活变化及其酶活基因表达量等研究生防菌及其组合防治黄瓜枯萎病的机理；测定了盆栽和大田条件下生防菌各处理及其组合对黄瓜生长和产量的影响，试验结果如下。 从健康的的黄瓜根际土中分离得到10株细菌菌株，通过试验筛选出了一株对黄瓜枯萎病具有良好防效的细菌菌株J2，其对黄瓜枯萎病菌的平板抑制率为80.95%，盆栽防效能够达到72.61%；通过形态学鉴定、生理生化鉴定以及基于16S rDNA基因分子生物学鉴定，将细菌J2菌株鉴定为枯草芽孢杆菌；通过枯草芽孢杆菌J2的抑菌试验发现，其对多种植物病原菌具有较好的平板抑制效果。枯草芽孢杆菌J2对苦瓜枯萎病菌、合欢枯萎病菌、苹果树腐烂病菌、杨树烂皮病菌、小麦赤霉病菌以及核桃炭疽病菌均具有较高的抑菌活性，抑制率分别为81.01%、71.75%、77.48%、83.61%、69.77%以及63.49%；本试验探究了菌株J2的一些基本特性，经过摇瓶测定J2菌株发酵液中IAA产量达到了19.80μg/mL；经检测J2菌株能够产蛋白酶；在28℃,180r/min条件下发酵，6h时达到指数生长期，在20h时指数生长期结束。 为优化生物防治技术，提高生物防治效果，探究生防菌组合诱导抗病机制，采用盆栽试验将枯草芽孢杆菌J2与能够对黄瓜枯萎病菌有拮抗作用的几株生防菌进行组合，通过与单一施加枯草芽孢杆菌J2相比，筛选出对黄瓜枯萎病具有良好防效的生防菌组合。盆栽试验结果发现，枯草芽孢杆菌J2菌株与球毛壳菌（Chaetomium globosum）ND35菌株组合防治黄瓜枯萎病的效果良好，且防病效果好于单一生防菌处理。 进一步探究了枯草芽孢杆菌J2菌株与球毛壳菌ND35菌株组合协同防治黄瓜枯萎病的机理：根系活力对于植株健康生长具有重要作用。在病原菌胁迫下，测定了不同处理对黄瓜根系活力的影响，结果显示，相比于其它处理J2+ND35能够延缓根系活力的下降，使根系活力保持在一个较高水平；活性氧反应是植物抗病的早期反应之一，我们分析了生防菌组合处理对黄瓜总活性氧含量影响，发现J2+ND35处理能够使黄瓜更快的响应外界胁迫，诱导黄瓜在取样中前期迅速产生大量活性氧，但是在中后期其活性氧含量迅速降低至FOC水平之下；本研究检测了与植物防病相关的几种关键酶（SOD、CAT、POD、PAL、PPO）的变化情况，结果显示：在病原菌胁迫下，各酶活变化总体呈现一个先上升后下降的趋势，其中J2+ND35处理的平均防御酶活力在大部分取样周期中保持一个相对较高的水平；本研究还检测了与上述酶活相关的已验证功能性的酶活基因的表达情况，结果显示：各处理的酶活基因表达量与酶活力水平基本一致，证明了生防菌能够在转录水平影响酶活基因的表达，进而影响酶活水平，其中J2+ND35处理平均酶活基因表达水平和防御酶活力显著高于其他处理。 盆栽试验和大田试验发现，与CK、J2和ND35相比较，J2+ND35对黄瓜各项生长指标以及产量都起到了明显的促进作用。与对照CK相比，J2+ND35的叶绿素a提高了68.22%，净光合速率提高了94.38%，各项生长指标也都显著提高；大田试验结果显示，J2+ND35的产量相比于CK提高了22.65%。 通过对生防菌组合对黄瓜防病促生等方面的作用机理研究可以看出，在病原菌胁迫下，生防菌组合J2+ND35的防病效果之所以好于单一生防菌处理，推测可能是通过直接拮抗病原物、促进植株生长、延缓根系活力下降、保持活性氧代谢平衡、上调防御酶活基因表达、提高酶活力水平以及有效提高植株自身防御反应的速度和幅度等机制来实现的，从而达到了降低病害并改善植株抗病性的目的。本研究也为生防菌组合的田间防病以及推广应用奠定了基础。

目录

声明

符号说明

1引言

1. 1黄瓜枯萎病研究进展

1.1.1黄瓜枯萎病病原菌及发病症状

1.1.2黄瓜枯萎病病原菌致病机理

1.1.3黄瓜枯萎病发病规律

1.1.4黄瓜枯萎病防治措施

1. 2枯草芽孢杆菌研究进展

1.2.1枯草芽孢杆菌概述及应用

1.2.2枯草芽孢杆菌生物防治机理

1.3植物防御酶活性

1.3.1超氧化物歧化酶

1.3.2过氧化氢酶

1.3.3过氧化物酶

1.3.4苯丙氨酸解氨酶

1.3.5多酚氧化酶

1. 4复合微生物防治病害研究进展

1. 5本研究的背景、目的、意义

2材料与方法

2. 1供试材料

2. 2供试培养基

2. 3试剂与仪器

2.3.1供试主要试剂

2.3.2试验仪器

2. 4方法

2.4.1拮抗黄瓜枯萎病细菌菌株的筛选

2.4.2菌种鉴定

2.4.3枯草芽孢杆菌J2菌株基本特性检测

2.4.4组合生防菌筛选

2.4.5防病作用的测定

2.4.6黄瓜相关防御酶活力的测定

2.4.7黄瓜SOD、CAT、PAL、POD、PPO相关酶活基因表达情况测定

2.4.8促生作用的测定

3结果与分析

3. 1拮抗黄瓜枯萎病的生防菌筛选

3.1.1菌株的分离与纯化结果

3.1.2菌株平板对峙试验以及盆栽防效试验结果

3.1.3菌株对不同病原菌的抑菌结果

3. 2菌种鉴定

3.2.1菌株形态特征

3.2.2菌株生理生化特征

3.2.3菌株分析序列分析

3.3菌株J2基本特性研究结果

3.3.1菌株J2生长曲线分析

3.3.2菌株J2产蛋白酶的结果分析

3.3.3菌株J2产IAA能力的结果分析

3. 4组合生防菌筛选

3. 5生防菌组合处理对黄瓜枯萎病防病效果

3.5.1生防菌组合J2+ND35对黄瓜枯萎病盆栽防病效果

3.5.2盆栽条件下不同处理对黄瓜根系活力的影响

3.5.3盆栽条件下不同处理对黄瓜总ROS活性氧量影响

3.5.4盆栽条件下不同处理对黄瓜防御酶活力的影响

3.5.5 盆栽条件下不同处理对黄瓜防御酶活基因表达的影响

3. 6黄瓜促生效果分析

3.6.1盆栽条件下不同处理对黄瓜促生的影响

3.6.2盆栽条件下不同处理对叶绿体色素含量的影响

3.6.3盆栽条件下不同处理对黄瓜光合性能的影响

3.6.4大田条件下不同处理对黄瓜促生的影响

3.6.5大田条件下不同处理对黄瓜产量的影响

4 讨论

4. 1枯草芽孢杆菌对病原菌的防治效果

4. 2生防菌组合构建以及对病害的防治效果

4. 3组合生防菌诱导抗病机制初探

5结论

参考文献

致谢

研究生期间发表论文

附表1枯草芽孢杆菌J2菌株基因片段序列信息