一种环状RNA在制备诊断乳腺癌产品中的应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种环状RNA在制备诊断乳腺癌产品中的应用。诊断乳腺癌产品能检测待测组织样品中的环状RNA的表达，环状RNA为hsa_circ_0075796。与癌旁对照组相比，发现hsa_circ_0075796在乳腺癌组织中明显下调，并与乳腺癌淋巴结转移、HER2的表达、较大的肿瘤直径、较高的Ki‑67表达水平、较高的组织学分级、更具侵袭性的分子分型及更晚的临床分期相关，从而实现对乳腺癌的确诊及恶性程度进行检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种环状RNA在制备诊断乳腺癌产品中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

乳腺癌是女性发病率最高的肿瘤之一，同时也是女性死于肿瘤的主要原因之一，同时乳腺癌患者还面临转移与复发的巨大风险。所以早期发现并诊断乳腺癌十分重要。乳腺钼靶对于发现早期乳腺癌有十分重要的意义，但它同时也存在漏诊、诊断滞后、经济负担重等局限性。而常规的血清标志物检查如CEA、CA-153等在乳腺癌术前诊断中特异性和敏感性均不高，临床价值有限。

环状RNA(circRNA)是一类非编码RNA，其结构特点在于共价闭合的连续环，既不具有5'至3'端的极性也不具有聚腺苷酸化的尾部，可抵抗RNA酶的降解，因此环状RNA比线性RNA更加稳定和保守。近年来circRNA已成为分子机制研究的热点。已有研究证实circRNA在多种疾病中发挥着重要的调节作用，同时越来越多的研究表明circRNA的异常表达在包括乳腺癌的多种恶性肿瘤的发生发展中起到重要作用，并可作为某些疾病的生物标志物。因而需要一种新的circRNA作为乳腺癌的生物标志物及预估其恶性程度的可行性和临床效用。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种环状RNA在制备诊断乳腺癌产品中的应用。

本发明的技术方案为：

一方面，一种用于作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的环状RNA，所述环状RNA为hsa_circ_0075796。

另一方面，一种环状RNA在制备诊断乳腺癌产品中的应用，所述诊断乳腺癌产品能检测待测组织样品中的环状RNA的表达，所述环状RNA为hsa_circ_0075796。

第三方面，一种检测环状RNA的试剂在制备筛选乳腺癌分子标志物制剂中的应用，所述环状RNA为hsa_circ_0075796。

第四方面，一种乳腺癌诊断的检测试剂盒，所述检测试剂盒中装有检测乳腺癌组织中hsa_circ_0075796的检测体系。

第五方面，一种环状RNA在制备治疗乳腺癌药物中的应用，所述环状RNA为hsa_circ_0075796。

第六方面，一种筛选治疗乳腺癌药物的方法，包括检测用药后乳腺癌组织中hsa_circ_0075796的表达水平。

本发明的有益效果为：

ROC曲线分析显示hsa_circ_0075796可以较好地区分乳腺癌组织及其癌旁组织，曲线下面积为0.8015，敏感性为65.61％，特异性93.12％。与癌旁对照组相比，发现hsa_circ_0075796在乳腺癌组织中明显下调，并与乳腺癌淋巴结转移、HER2的表达、较大的肿瘤直径、较高的Ki-67表达水平、较高的组织学分级、更具侵袭性的分子分型及更晚的临床分期相关，从而实现对乳腺癌的确诊及恶性程度进行检测。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中对乳腺癌组织和癌旁组织进行的qRT-PCR检测图；

图2为本发明实施例中hsa_circ_0075796的受试者工作特征曲线；

图3为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与淋巴结转移的关系图；

图4为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与HER2的关系图；

图5为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与肿瘤直径的关系图；

图6为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与肿瘤直径的相关性分析结果图；

图7为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与Ki-67表达水平的关系图；

图8为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与Ki-67表达水平的相关性分析结果图；

图9为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与病理N分期的关系图；

图10为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与组织学分级的关系图；

图11为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与Luminal A型乳腺癌的关系图；

图12为本发明实施例中hsa_circ_0075796表达水平与临床分期关系图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种用于作为乳腺癌诊断和/或预后标志物的环状RNA，所述环状RNA为hsa_circ_0075796。

hsa_circ_0075796的序列为：

AAAAGAGTCTCATCGTGGAAGGCAAGAGGGAAAAGAAAAAAGTAGAGAGGTTGACAATGCAAGTCTCTTCCTTACAGAGAGAGCCATTTACAATTGCACAAGGAAAGGGGCAGAAACTTTGTGAAATTGAGAGGATACATTTTTTTCTAAGTAAGAAGAAAACCGATGAACTTAGAAATCTACACAAACTGCTTTACAACAGGCCAGGCACTGTGTCCTCATTAAAGAAGAATGTGGGTCAGTTCAGTGGCTTTCCATTTGAAAAAGGAAGTGTCCAATATAAAAAGAAGGAAGAAATGTTGAAAAAATTTAGAAATGCCATGTTAAAGAGCATCTGTGAGGTTCTTGATTTGGAGAGATCAGGTGTAAATAGTGAACTAGTGAAGAGGATCTTGAATTTCTTAATGCATCCAAAGCCTTCTGGCAAACCATTGCCGAAATCTAAAAAAACTTGTAGCAAAGGCAGTAAAAAGGAACGGAACAGTTCTGGAATGGCAAGGAAGGCTAAGCGAACCAAATGTCCTGAAATTCTGTCAGATGAATCTAGTAGTGATGAAGATGAAAAGAAAAACAAGGAAGAGTCTTCAGATGATGAAGATAAAGAAAGTGAAGAGGAGCCACCAAAAAAGACAGCCAAAAGAGAAAAACCTAAACAGAAAGCTACTTCTAAAAGTAAAAAATCTGTGAAAAGTGCCAATGTTAAGAAAGCAGATAGCAGCACCACCAAGAAGAATCAAAACAGTTCCAAAAAAGAAAGTGAGTCTGAGGATAGTTCAGATGATGAACCTTTAATTAAAAAGTTGAAGAAACCCCCTACAGATGAAGAGTTAAAGGAAACAATAAAGAAATTACTGGCCAGTGCTAACTTGGAAGAAGTCACAATGAAACAGATTTGCAAAAAG，见SEQ ID NO.1。

当hsa_circ_0075796作为乳腺癌诊断的诊断标志物时，可以通过检测患者待检测组织样本中hsa_circ_0075796的表达量，通过hsa_circ_0075796的表达量确定患者是否患有乳腺癌以及乳腺癌的恶性程度。

当hsa_circ_0075796作为预后标志物时，可以通过检测患者待检测组织样本中治疗前和治疗后的hsa_circ_0075796的表达量，通过治疗前和治疗后的hsa_circ_0075796的表达量的差值评估预后的情况。

本发明的另一种实施方式，提供了一种环状RNA在制备诊断乳腺癌产品中的应用，所述诊断乳腺癌产品能检测待测组织样品中的环状RNA的表达量，所述环状RNA为hsa_circ_0075796。

该实施方式的一些实施例中，所述诊断乳腺癌产品包括用于检测hsa_circ_0075796的上游引物和下游引物。用于检测hsa_circ_0075796的上游引物的序列为：TGGCCAGTGCTAACTTGGA，用于检测hsa_circ_0075796的下游引物的序列为TCTGCCCCTTTCCTTGTG。

该实施方式的一些实施例中，所述诊断乳腺癌产品包括内参引物。所述内参引物包括上游引物和下游引物，内参引物的上游引物的序列为：GGCCTCCAAGGAGTAAGACC，内参引物的下游引物的序列为：AGGGGAGATTCAGTGTGGTG。

该实施方式的一些实施例中，所述诊断乳腺癌产品包括检测反应体系，检测反应体系包括反转录RNA反应体系和实时定量聚合酶链反应体系。反转录RNA反应体系至少包括逆转录缓冲溶液、逆转录酶、无核酸酶纯水。实时定量聚合酶链反应体系至少包括SYBRGreen实时PCR预混液、无核糖核酸酶双蒸水等。

本发明的第三种实施方式，提供了一种检测环状RNA的试剂在制备筛选乳腺癌分子标志物制剂中的应用，所述环状RNA为hsa_circ_0075796。

本发明的第四种实施方式，提供了一种乳腺癌诊断的检测试剂盒，所述检测试剂盒中装有检测乳腺癌组织中hsa_circ_0075796的检测体系。

该实施方式的一些实施例中，所述检测体系包括反转录RNA反应体系和实时定量聚合酶链反应体系。

在一种或多种实施例中，反转录RNA反应体系逆转录缓冲溶液、逆转录酶、无核酸酶纯水、反转录引物等。

在一种或多种实施例中，实时定量聚合酶链反应体系至少包括SYBR Green实时PCR预混液、无核糖核酸酶双蒸水、用于检测hsa_circ_0075796的上游引物和用于检测hsa_circ_0075796的下游引物等。

本发明的第五种实施方式，提供了一种环状RNA在制备治疗乳腺癌药物中的应用，所述环状RNA为hsa_circ_0075796。

本发明的第六种实施方式，提供了一种筛选治疗乳腺癌药物的方法，包括检测用药后乳腺癌组织中hsa_circ_0075796的表达水平。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

(1)临床样本

2017年5月至2021年7月，于山东大学齐鲁医院招募了189名乳腺癌患者。所有患者和对照组均为汉族女性。

收集189名乳腺癌患者的癌及癌旁组织，并将新鲜的组织样品立即储存在液氮中直至进一步分析。所有乳腺癌及癌旁组织均在手术中获取。所有参与者均获得书面知情同意书。本实施例的研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准。

(2)RNA提取

1)将30-50mg储存于液氮中的组织标本取出后迅速转移到EP管中，加入RNA-easyIsolation Reagent试剂700μl，用组织剪充分剪碎组织，直至成糊末状(无明显可见颗粒)。向上述裂解液中加入280ml的RNase-free ddH

2)取出离心管，此时溶液分成上层水相(含RNA)和深色的下层沉淀(含蛋白质、DNA、多糖等杂质)，小心吸取上层水相至一个新的离心管中。

3)加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置10min。

4)12,000rpm(室温)离心10min，通常可以看见白色沉淀，小心弃去上清。

5)向EP管中加入75％乙醇1000μl(RNase-free ddH2O配制)，轻弹管底，使沉淀悬浮，并上下颠倒数次。

6)8,000rpm(室温)离心3min，弃去上清，在室温下晾干。注：不可过度干燥，否则RNA样品很难溶解。

7)向EP管中加入适量RNase-free ddH

8)对RNA的浓度及纯度进行测量。先使用RNase-free ddH

(3)反转录RNA

1)RNA的变性

把RNA在65℃条件下进行5分钟后，立即放于冰上冷却。

2)配制反应液

3)逆转录反应

a.在37℃条件下，进行15分钟的逆转录反应。

b.在98℃条件下，进行5分钟的酶失活反应。

c.反应结束后，保存于-20℃条件下。

(4)实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

1)融化并混匀各种PCR反应所需溶液，并置于冰上。

2)配制PCR反应体系

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。

3)加样：将9ul混合液加到PCR板对应的每个孔中。再加入对应的1μlcDNA。小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。

4)将上述PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，30s；40个PCR循环(95℃，5s；55℃，15s；72℃，15s(收集荧光))。

5)融解曲线分析，GAPDH作为内参将circRNA表达进行标准化，并使用

(5)统计分析

使用GraphPad Prism 5(San Diego，CA)和SPSS 20.0(SPSS,Chicago,IL,USA)进行统计学分析。Student t检验和卡方检验用于分析两组之间的差异。受试者工作特征曲线(ROC)分析用于确circRNA的诊断价值。P<0.05被认为具有统计学意义。

在189对乳腺癌组织和癌旁组织进行的qRT-PCR检测结果显示，与癌旁组织相比，hsa_circ_0075796在乳腺癌组织中表达明显下调(图1，P＝0.0028)。此外，hsa_circ_0075796的受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.8015(图2，P<0.0001)，表明hsa_circ_0075796可以很好地区分乳腺癌与癌旁组织，揭示了hsa_circ_0075796在乳腺癌中良好的诊断价值。

对hsa_circ_0075796表达水平与乳腺癌患者临床病理特征关系的分析结果显示，hsa_circ_0075796表达与多种临床病理参数密切相关。与淋巴结无转移的患者相比，淋巴结有转移的患者乳腺癌组织中hsa_circ_0075796的表达下调(图3，P＝0.0174)。在HER2阳性患者乳腺癌组织中，hsa_circ_0075796的表达水平低于HER2阴性患者的乳腺癌组织(图4，P＝0.0182)。同时卡方检验的结果表明hsa_circ_0075796的表达水平与HER2的表达呈负相关(表1，P＝0.028)。在肿瘤直径方面，分析结果表明在肿瘤直径＞2cm的患者乳腺癌组织中hsa_circ_0075796的表达水平较肿瘤直径≤2cm的患者乳腺癌组织表达下调(图5，P＝0.0251)。相关性分析及卡方检验的结果表明hsa_circ_0075796的表达水平与肿瘤直径呈负相关(图6，Spearman correlation r＝-0.2253，P＝0.0018；表1，P＝0.029)。此外，hsa_circ_0075796表达水平较高患者的Ki-67表达水平较低(图7，P＝0.0320)。hsa_circ_0075796表达水平与Ki-67表达水平呈负相关(图8，Spearman correlation r＝-0.1405，P＝0.0279)。hsa_circ_0075796的表达水平还随着病理N(pN)分期的增加呈进行式下降(图9，P＝0.0368)。其中，pN0分期患者hsa_circ_0075796表达水平分别高于pN1分期和pN2-3分期患者(图9，pN0 vs pN1，P＝0.0338；pN0 vs pN2-3，P＝0.0489)。在组织学分级中，hsa_circ_0075796的表达水平从Ⅰ级、Ⅱ级到Ⅲ级均有所下降(图10，P＝0.0118)。其中，hsa_circ_0075796在Ⅰ级组织学分级患者中的表达高于II级组织学分级和III级组织学分级患者(图10，I级vs II级，P＝0.0355；I级vs III级，P＝0.0038)。卡方分析的结果表明hsa_circ_0075796的表达与组织学分级也存在负相关(表1，P＝0.006)。此外，hsa_circ_0075796在乳腺癌不同分子分型中也表现出了差异表达。其中，hsa_circ_0075796在Luminal A型乳腺癌患者中的表达水平高于HER2阳性型乳腺癌患者(图11，Luminal A型乳腺癌vs HER2阳性型乳腺癌患者，P＝0.0252)。在乳腺癌临床分期中，hsa_circ_0075796在临床晚期患者中的表达低于临床早期患者(图12，P＝0.0480)。而hsa_circ_0075796的表达水平与雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)无关(表1)。

表1.hsa_circ_0075796表达与乳腺癌患者临床病理特征的相关性

*P＜0.05。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学齐鲁医院

<120> 一种环状RNA在制备诊断乳腺癌产品中的应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 902

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaagagtct catcgtggaa ggcaagaggg aaaagaaaaa agtagagagg ttgacaatgc 60

aagtctcttc cttacagaga gagccattta caattgcaca aggaaagggg cagaaacttt 120

gtgaaattga gaggatacat ttttttctaa gtaagaagaa aaccgatgaa cttagaaatc 180

tacacaaact gctttacaac aggccaggca ctgtgtcctc attaaagaag aatgtgggtc 240

agttcagtgg ctttccattt gaaaaaggaa gtgtccaata taaaaagaag gaagaaatgt 300

tgaaaaaatt tagaaatgcc atgttaaaga gcatctgtga ggttcttgat ttggagagat 360

caggtgtaaa tagtgaacta gtgaagagga tcttgaattt cttaatgcat ccaaagcctt 420

ctggcaaacc attgccgaaa tctaaaaaaa cttgtagcaa aggcagtaaa aaggaacgga 480

acagttctgg aatggcaagg aaggctaagc gaaccaaatg tcctgaaatt ctgtcagatg 540

aatctagtag tgatgaagat gaaaagaaaa acaaggaaga gtcttcagat gatgaagata 600

aagaaagtga agaggagcca ccaaaaaaga cagccaaaag agaaaaacct aaacagaaag 660

ctacttctaa aagtaaaaaa tctgtgaaaa gtgccaatgt taagaaagca gatagcagca 720

ccaccaagaa gaatcaaaac agttccaaaa aagaaagtga gtctgaggat agttcagatg 780

atgaaccttt aattaaaaag ttgaagaaac cccctacaga tgaagagtta aaggaaacaa 840

taaagaaatt actggccagt gctaacttgg aagaagtcac aatgaaacag atttgcaaaa 900

ag 902

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<211> 19

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<213> 人工序列

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tggccagtgc taacttgga 19

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<212> DNA

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tctgcccctt tccttgtg 18

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<211> 20

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