一种VRA-NAG底物法检测NAG的技术及试剂

摘要

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种VRA‑NAG底物法检测NAG的技术及试剂。本发明提供的NAG检测试剂的线性范围可达(0，500]U/L；在范围内，当抗血酸≤340μmol/L，尿素≤42.9mmol/L，尿酸≤1.4mmol/L，白蛋白≤100mg/dL，胆红素≤342μmol/L，乳酸≤6.6mmol/L，葡萄糖≤55mmol/L，甘油三酯≤37mmol/L，草酸≤81μmol/L时，这些组分对测试无明显干扰。并且，检测试剂加速老化10天造成的相对标准偏差不超过±10％。与现有技术相比，本发明提供的试剂盒灵敏度高、线性范围宽、特异性强，且稳定性好，有利于临床对肾脏疾病的早发现早治疗。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种VRA-NAG(5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-饶丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D葡萄糖苷酶)底物法检测NAG的技术及试剂。

背景技术

葡萄糖苷酶(NAG)是一种人体内比较重要的溶酶体水解酶，相对分子质量为130～140KD，在血浆中半衰期仅为5分钟。NAG广泛存在于人体内，当肾功能损害会造成溶酶体破裂释放NAG，使NAG指标数值增高，NAG测试值可以非常敏感地反映肾的损伤。肾小球不能滤过血浆中的NAG，近年来，尿液中NGA的含量成为较为理想的监测肾脏病变的指标，检测尿NGA的含量具有临床实用性。

现有的NAG检测技术较多，主要包括荧光分光光度法和紫外分光光度法。其中荧光分光光度法需要昂贵的仪器和底物溶液，不适宜作为普通医院的常规检测方法。

基于需求，发展出来许多快速廉价的紫外分光光度检测法，如CNP-NAG法、PNP-NAG法、MNP-G1CNAc法和VRA-NAG法等。其原理是：NAG催化底物发生分解，通过在不同时间测定底物或产物在特定波长下的吸光度来测定浓度变化，从而能判断催化酶NAG的浓度。CNP-NAG底物法使用的底物溶解缓慢且稳定性差，加热至于60℃6h才能完全溶解，溶解后4℃条件下只能存储7天，使用不方便；PNP-NAG法的分解产物与尿液颜色非常接，进而易对检测产生严重干扰；MNP-G1CNAc底物法的最大吸收峰在500nm，也易受尿液微黄色的干扰。目前，市场上现有产品的线性范围较窄，一般仅为(0，200]U/L，有待提高。总之，其它成分对光检测的干扰、试剂的不稳定性及试剂的老化问题是研发NAG紫外分光检测试剂的过程中，一直需要解决的问题。

近年来，VRA-NAG底物的研发和使用在一定程度改善了底物不稳定、减少了反应底物或产物对光检测的干扰。但检测过程中其它成分对检测造成干扰的问题仍有待改善，试剂的稳定性及检测的灵敏度需要进一步地提高，因此有必要进一步优化NAG的检测。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种稳定性好、灵敏度高的NAG检测试剂及检测方法。

本发明提供了一种NAG检测试剂盒，其包括试剂R1；所述试剂R1包括：反应底物VRA-NAG、抗坏血酸氧化酶、表面活性剂、缓冲溶液、保护剂和增稳剂；其中，所述增稳剂包括氯化镁、EDTA、AES和HPD。

一些实施例中，不添加AES或HPD，其抗老化能力不如本发明提供的R1。

所述试剂R1中：所述缓冲溶液包括柠檬酸缓冲溶液，所述表面活性剂包括TritonX-100、Tween-20、PEG 6000中的一种或几种，所述保护剂包括蔗糖、海藻糖、葡萄糖中的一种或几种。

具体地，所述增稳剂包括：0.5～50mmol/L的氯化镁、0.5～50mmol/L的EDTA、0.1％～7.5％(V/V)的AES和0.1％～7.5％(V/V)的HPD。

具体地，所述试剂R1中：所述反应底物VRA-NAG的浓度为0.5～50mmol、所述抗坏血酸氧化酶的浓度为1～5KU/L、所述表面活性剂的浓度为0.02％～0.1％(V/V)、所述缓冲溶液为50～200mmol/L、所述缓冲溶液的pH为4.6-5.0、所述保护剂的浓度为0.5～25g/L。

优选的，所述试剂R1包括：15mmol/L的VRA-NAG、2KU/L的抗坏血酸氧化酶、10mmol/L的氯化镁，2mmol/L的EDTA、1％(V/V)的AES、2.5％(V/V)的HPD、100mmol/L且pH为4.8的檬酸缓冲溶液、体积浓度为0.1％的Triton X-100和5g/L的海藻糖保护剂。

所述试剂R1还包括防腐剂，所述防腐剂包括NaN3或Proclin300。

具体地，所述R1试剂中，防腐剂的浓度为0.02％～0.1％(V/V)。

本发明提供的检测试剂盒还包括试剂R2，所述试剂R2包括：碳酸钠缓冲溶液、表面活性剂和防腐剂，所述表面活性剂包括Triton X-100、Tween-20和PEG 6000中的一种或几种；所述防腐剂包括NaN

具体地，所述的试剂R2包括：0～200mmol/L，pH 10～10.8的碳酸钠缓冲溶液、0.02％～0.1％(V/V)的表面活性剂和0.02％～0.1％(V/V)的防腐剂。

优选地，所述的试剂R2包括：100mmol/L，pH 10.2的碳酸钠缓冲溶液、0.1％(V/V)的Triton X-100表面活性剂和0.1％(V/V)的Proclin30。

本发明还提供了利用所述试剂盒测试NAG含量的方法：先向比色杯加入750μL试剂R1和样品(S)50μL，混匀，在37℃下孵育5min，读取吸光度A1，然后加入250μL试剂R2，混匀，在37℃下孵育5min，读取吸光度A2。最后计算ΔA(ΔA＝A2-A1)。

本发明提供的NAG检测试剂盒，其检测的线性范围可达(0，500]U/L；在范围内，当抗血酸≤340μmol/L，尿素≤42.9mmol/L，尿酸≤1.4mmol/L，白蛋白≤100mg/dL，胆红素≤342μmol/L，乳酸≤6.6mmol/L，葡萄糖≤55mmol/L，甘油三酯≤37mmol/L，草酸≤81μ mol/L时，这些组分对测试无明显干扰。并且，检测试剂加速老化10天造成的相对标准偏差不超过±10％。与现有技术相比，本发明提供的试剂盒灵敏度高、线性范围宽、特异性强，且稳定性好，有利于临床对肾脏疾病的早发现早治疗。

附图说明

图1示重复性测试的线性拟合曲线图；

图2示试剂盒说明书线性范围(0，200U/L]和扩大范围(0，300U/L]下的线性拟合对比图。

具体实施方式

本发明提供了一种NAG的检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

本方法采用5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-饶丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D葡萄糖苷酶(简称VRA-NAG)底物法检测尿NAG活性方法，VRA-NAG是近几年新合成的NAG底物，具有良好的水溶性，较强的稳定性，且在pH4.75-5.0的条件下的浓度可达NAG酶催化该底物分解反应的Km值的五倍，在该底物浓度下，尿中的尿素对反应的竞争抑制作用已被消除。

本发明提供的技术灵敏度高、线性范围宽、精密度好、准确度高，操作简便快速，能够适用于全自动生化仪大批量标本操作，且适用于小型全自动生化仪、半自动生化仪等仪器小批量标本检测，有利于临床对肾脏疾病的早发现早治疗。

实施例1VRA-NAG法测试NAG含量值

(1)试剂配制

试剂R1：

柠檬酸缓冲溶液：100mmol/L，pH 4.8；

VRA-NAG：15mmol/L：

抗坏血酸氧化酶：2KU/L；

表面活性剂：Triton X-100 0.1％(V/V)；

防腐剂：山梨酸钾0.1％(V/V)；

增稳剂：氯化镁10mmol/L、EDTA 2mmol/L、1％(V/V)AES和2.5％(V/V)HPD；

保护剂：海藻糖5g/L。

试剂R2：

碳酸钠缓冲溶液：100mmol/L，pH 10.2；

表面活性剂：Triton X-100 0.1％(V/V)；

防腐剂：Proclin300 0.1％(V/V)。

(2)测定条件

表1 实验测定条件

(3)操作步骤

按照表1所示的条件测试样品的吸光度，先向比色杯加入750μL试剂R1和50μL样品(S)，混匀，在37℃下孵育5min，读取吸光度A1，然后加入250μL试剂R2，混匀，在37℃下孵育5min，读取吸光度A2。最后计算ΔA(ΔA＝A2-A1)，ΔA即为所测的吸光度值。

(4)实验结果与数据分析

4.1测试空白试剂

表2 空白吸光率结果

测试空白吸光度。在A505nm下按照步骤(3)的操作测试空白试样，重复三次测得的吸光度值分别是0.019、0.018、0.020。可见A505nm下测定空白样品的吸光度小于或者等于0.05。

测试空白度吸光率。在A505nm下，按照步骤(3)的操作测试5min内空白吸光度变化情况。测试结果如表2所示，空白吸光率(ΔA/min)为0.0004。

4.2分析灵敏度

表3 分析灵敏度测试结果

使用同一批次试剂，按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的步骤和方法对浓度为50.3U/L(满足浓度为(50±0.5)U/L)的尿液样本进行测试，重复测试3次，吸光度值变化如表3所示，吸光度值在0.20～0.30之间。可见，50U/L的NAG也能被准确重复地检测到，说明该测试方法灵敏度较高。

4.3测试线性范围

选用无明显颜色，医院未检出NAG的尿液样本作为样本基质，按照表4所示的浓度，配制一系列的标准浓度的NAG样品并按照实施例1步骤(3)分别测试标准样品的吸光度值。

表4 线性测试结果

测试结果如表4所示，然后以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，做拟合曲线，结果如图1所示。在(0，500U/L)区间内，浓度和吸光度值的线性相关系数r≥0.990。线性范围较比市面试剂盒(0，200U/L)要宽。且本发明提供的试剂在(0，50)U/L区间内测定的线性偏差不超过±5U/L，在[50，500]区间内测定的线性偏差不超过±10％。同时，根据测定的吸光度数和NAG(U/L)浓度之间的线性关系，后面测定相应溶液的吸光度即可推测溶液中NAG的含量(U/L)。

4.4测试重复性

表5 重复性测试结果

使用同一批次试剂，按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的步骤和方法对低中高三个不同浓度的尿液样本进行测试和计算，测试组分别命名为第一组、第二组和第三组，三组分别重复测试10次。测试结果如表5所示：对于低、中、高三个浓度的尿液样本或质控品重复测定10次，其测定值的变异系数(CV)≤10％。

4.5测试批间差

随机抽取三批试剂盒按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的步骤和方法测试低、中、高浓度尿液样本，平行测试3次，浓度值在(0，50)U/L区间内的测试结果计算极差，[50，500]区间内计算其相对极差。

表6 批间差测试结果

随机抽取三批试剂盒在(0，50)U/L区间内测定的极差不超过±5U/L，在[50，500]区间内测定的相对极差不超过±10％。

4.6测试加标回收率

表7 加标回收率检测结果

取低中高三个不同浓度的样本，加入一定量的标物，按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的步骤和方法测定加标后样本浓度，计算加标回收率。若样本加标回收率满足90％-110％之间，则认为回收率较好。测试结果如表7所示，本发明提供的试剂对三种不同浓度的样品加标回收率都较好。

4.7测试抗干扰能力

取低中高三种不同NAG浓度的尿液样本，设置为对照组；然后分别取同样的样本并加入对应干扰因素，设置为相应的干扰物实验组，测试试剂的抗干扰能力。

表8-1 抗干扰能力情况

部分所加入的干扰因素如表8-1所示，为尿酸或者胆红素。部分所加入的干扰因素如表8-2所示，为抗坏血酸、白蛋白、尿素、乳酸、GLU、甘油三酯或草酸。

然后用本发明提供的试剂，按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的步骤和方法测试并计算对照组及以干扰因素命名的各干扰组的NAG含量。

测试结果如表8-1和表8-2所示，当抗坏血酸≤340μmol/L，尿素≤42.9mmol/L，尿酸≤1.4mmol/L，白蛋白≤100mg/dL，胆红素≤342μmol/L，乳酸≤6.6mmol/L，葡萄糖≤55mmol/L，甘油三酯≤37mmol/L，草酸≤81μmol/L时，该方法在(0，50)U/L区间内测定的标准偏差不超过±5U/L，在[50，500]区间内测定的相对标准偏差不超过±10％，对试剂无明显干扰，本发明研发的测试试剂和方法抗干扰能力强、特异性好。

表8-2 抗干扰能力情况

4.8测试加速稳定性

将试剂R1和试剂R2放在37℃烘箱中进行加速老化，按表9所示间隔时间取相应的试剂，分别按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的步骤和方法，测试中低高三种浓度的样品的NAG含量值。老化测试的结果如表9所示，37℃下对测试试剂R1和R2进行加速老化，与对照相比，该试剂老化后在(0，50)U/L区间内测定的标准偏差不超过±5U/L，在[50，500]U/L区间内测定的相对标准偏差不超过±10％，该试剂加速老化10天稳定性较好。

表9 37℃加速老化实验

实施例2、MNP-GlcNAc底物法测试NAG测试值

表10 对照试剂盒线性考察数据

使用市场上常见MNP-GlcNAc底物法试剂盒作为对照，其说明书显示组分如下：

试剂R1：MNP-GlcNAc，HCl≥0.1mmol/L；柠檬酸≥10mmol/L。

试剂R2：碳酸钠缓冲液≥100mmol/L。

检测过程按照试剂盒说明书操作。测试线性范围，测试的数据如表10所示。对测试的数据进行分析，结果如图2所示：图2中曲线1为说明书所述线性范围内的拟合曲线；曲线2为在说明书所述线性范围基础上扩大至(0，300U/L]的范围内的拟合曲线。当扩大线性范围至(0，300U/L]，曲线的拟合相关性明显下降。该试剂盒不能达到本发明提供的试剂盒在实例1中所测的线性范围(0，500U/L](图1所示)。

实施例3、缺少抗坏血酸氧化酶的VRA-NAG法测试NAG含量

(1)试剂配制。

试剂R1：

柠檬酸缓冲溶液：100mmol/L，pH 4.8；5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-饶丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D葡萄糖苷酶(简称VRA-NAG)15mmol/L；

表面活性剂：Triton X-100 0.1％(V/V)；

防腐剂：山梨酸钾0.1％(V/V)；

增稳剂：氯化镁10mmol/L、EDTA 2mmol/L、1％(V/V)AES、2.5％(V/V)HPD；

保护剂：海藻糖5g/L。

试剂R2：

碳酸钠缓冲溶液：100mmol/L，pH 10.2；

表面活性剂：Triton X-100 0.1％(V/V)；

防腐剂：Proclin 300 0.1％(V/V)；

(2)测定条件。测定条件同本专利实例1中步骤(2)的测定条件。

(3)操作步骤。操作步骤同本专利实例1中步骤(3)、(4)的操作步骤。

(3)抗坏血酸干扰考察

抗坏血酸干扰的测定结果如表11所示：

未加入抗坏血酸氧化酶的试剂的抗抗坏血酸干扰的能力减弱，当样品中抗坏血酸的含量≤170μmol/L时对该试剂的检测效果无明显干扰，当＞170μmol/L时就会产生明显干扰。而本发明实例1所提供的检测配方在样品中抗坏血酸的含量≤340μmol/L时对检测都无明显干扰，可见，本发明实施例1中提供的检测试剂具有更好的抗干扰能力。

表11 抗干扰能力考察结果

实施例4、缺少增稳剂HPD、AES的VRA-NAG法测试NAG含量

(1)试剂配制

试剂R1：

柠檬酸缓冲溶液：100mmol/L，pH 4.8；

VRA-NAG15mmol/L；

抗坏血酸氧化酶2KU/L；

表面活性剂：Triton X-100 0.1％(V/V)；

防腐剂：山梨酸钾0.1％(V/V)；

增稳剂：氯化镁 10mmol/L、EDTA 2mmol/L；

保护剂：海藻糖 5g/L；

试剂R2：

碳酸钠缓冲溶液：100mmol/L，pH 10.2；

表面活性剂：Triton X-100 0.1％(V/V)；

防腐剂：Proclin300 0.1％(V/V)。

(2)测定条件。测定条件同本专利实例1中步骤(2)的测定条件。

(3)操作步骤。操作步骤同本专利实例1中步骤(3)、(4)的操作步骤。

(4)加速稳定性。将试剂R1和试剂R2放在37℃烘箱中进行加速老化，每天取相应的试剂分别测试中低高三种浓度的样品的NAG含量值。与实施例1所提供的配方相比，该实施例的配方中未加入增稳剂中的AES和HPD。该实施例中老化测试的结果如表12所示，与实例1中的表9对比，该实施例配方的加速稳定性明显低于本发明实施例1的配方。

表12 37℃加速老化实验结果

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。