一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法

摘要

本发明公开了一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法，包括以下步骤：1、选取锡林郭勒型驼绒藜枝条生长点下第3‑5片叶子作为外植体，对外植体进行消毒灭菌处理后备用；2、将消毒处理后的外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导；3、将诱导出的丛生芽种于继代培养基中，进行增殖培养；本发明简化了组织培养步骤，降低了锡林郭勒型驼绒藜的培养成本，提高诱导率及增殖系数，提高锡林郭勒型驼绒藜的繁殖速度。

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法。

背景技术

锡林郭勒型驼绒藜为藜科驼绒藜属多年生旱生半灌木；轴根系植物，主根粗壮，入土深，侧根多，株体暗灰绿，被毛较多。叶互生，具短柄，叶片为扁圆披针形，先端锐尖或钝，基部楔形至圆形，全缘，具明显网状脉，两面均具星状毛；单性花，雌雄同株；经过多年的研究发现，锡林郭勒型驼绒藜适合干旱半干旱地区退化草地和沙地生态修复、草牧场建设灌木防护带和建植农田生物篱等，不但建植成本低，而且管护成本低，适合大面积的推广应用。

草原是内蒙古生态的主体；旱生牧草是草原生态保育与可持续发展的重要物质基础。锡林郭勒型驼绒藜是源于本地区原有天然分布的草本植物种群，经过长期的自然选择，具有对当地土壤、气候等自然条件较强的适应性和抗病虫害能力，在植被恢复和退化草地生态治理、维系生态健康中表现出不可替代的作用。

但是，在目前的生产与生态利用中，对旱生牧草种质资源不够重视，种子不只是缺乏，严重地说是根本没有种子。而且推广利用的品种单一，从西到东提到种草只有苜蓿和冰草，大多也是国外种子，甚至有的根本不遵循其生态区系分布，盲目大面积种植，最终导致失败。随着世界范围严重干旱，美国等发达国家的科学家也开始关注驼绒藜、木地肤等旱生、超旱生植物的开发和利用，大量收集其种质资源，并将旱生牧草用于草原改良和荒漠化防治，起到了很好的效果。因此，对这些旱生灌草的开发、选育及合理利用是生态改良与建设必需的基础支撑。

20世纪90年代至本世纪初，随着世界范围的干旱严重，各国科学家均开始关注旱生、超旱生植物的开发和利用，我国学者对驼绒藜属植物的研究进入高潮时期。主要研究成果有：驼绒藜属根、茎、叶的植物形态解剖研究（祝建，1992；富象乾，曹自成，1995）；染色体组型和核型分析（富象乾，1996）；经济性状、栽培技术与饲用价值初探（库尔班·尼扎米丁，1999；潘伯荣，1993；孙浩峰，1998）；种子寿命和贮藏研究（赵书元，1992；易津、李青丰，1994）、根系发育研究（孙祥，1994）；植物抗性生理（包括抗旱和耐盐性）研究（易津，1996；张力君，1998；库尔班·尼扎米丁，1999）；引种栽培和驯化选育的研究（赵书元，阿拉塔，1994）。

野生驼绒藜植株低矮，自然高度35～55cm，种子寿命仅为3～7个月左右，产草量低。通过对野生华北驼绒藜的栽培驯化，以株型直立、草产量高、抗性好、适应范围广、整齐一致等性状为目标，通过混合选择逐步克服草产量低、整齐度差等野生性状，提高产草量，培育出优良抗旱栽培品种—锡林郭勒型驼绒藜，对干旱半干旱草原地区生态改良和拓宽实用牧草的种类具有重要的意义。

锡林郭勒型驼绒藜育苗建植有比较显著的经济效益，通过估算，驼绒藜育苗田建植成本是465元/亩。包括土地耕翻（20元/亩）、平整（20元/亩）、施肥（15元/亩）、种子费（2公斤×50元/公斤=100元/亩）、中耕锄草（200元/亩，2次）、灌溉水电费（30元/亩）、机械起苗费（80元/亩）等支出内容；育苗田每亩种苗生产能力平均为7万株，以当前价格0.05元/株计算，经济收入为3500元，减去成本，育苗每亩纯收入可达3035元。田间生产技术都已实现了机械化作业。在防护带及生态建设应用中，采用灌木移栽机械（5万元/台）建植，日移栽面积50亩，移栽成本为285元/亩（自产种苗）。

经过多年的驯化和选育，锡林郭勒型驼绒藜在生态治理和改良方面表现优异，是目前国内北方干旱地区比较难得的既抗旱又耐寒，而且株型直立，适合建立放牧场应用的具有饲用价值的优良草种，对这种牧草的开发利用具有重要的意义。

然而，锡林郭勒型驼绒藜在干旱半干旱地区直播很难成功，种植以育苗移栽为宜，所以，通过组培扩繁技术提高锡林郭勒型驼绒藜的繁殖速度是解决锡林郭勒型驼绒藜用苗的有效途径。但目前现有技术对锡林郭勒型驼绒藜的组织培养仍处于摸索阶段，其诱导率和增殖系数都比较低。

发明内容

本发明提供一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法，目的在于克服现有技术的不足之处，简化组织培养步骤，降低培养成本，提高诱导率及增殖系数，提高锡林郭勒型驼绒藜的繁殖速度。

为实现上述目的，本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法，包括以下步骤：

步骤1：选取锡林郭勒型驼绒藜枝条生长点下第3-5片叶子作为外植体，对外植体进行消毒灭菌处理后备用；

步骤2：将消毒处理后的外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导，所述诱导培养基的配方为：

初代改良MS+0.18-0.23mg/L 6-BA + 0.03-0.08mg/L NAA；

所述初代改良MS的配方为：将原MS培养基中的钙（Ca）、镁（Mg）的含量减少1.5mg/L；

步骤3：将诱导出的丛生芽种于继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：

继代改良MS+ 0.28-0.33mg/L 6-BA + 0.03-0.08mg/L NAA；

所述继代改良MS的配方为：将原MS培养基中的大量元素减少1.5mg/L，其他组分不变。

而且，所述继代培养基的配方为：继代改良MS+0.28-0.33mg/L 6-BA + 0.03-0.08mg/L NAA。

而且，所述诱导培养基的配方为改良MS+6-BA0.3mg/L+NAA 0.05mg/L。

而且，所述外植体消毒过程为75%酒精浸泡25-35s，升汞溶液浸泡3-5min，最后使用无菌水清洗4-6次，每次25-35s。

而且，丛生芽的诱导培养周期为20-25天；温度18-22℃，湿度55-65%。

而且，培养周期为18-23天左右、温度为17-23℃、湿度为58-63%。

本发明的有益效果在于：

1、本发明采用了初代改良MS培养基对锡林郭勒型驼绒藜外植体进行诱导，诱导率可达70%，较传统的培养基有了大幅度的增加，增加了锡林郭勒型驼绒藜的繁殖速度。

2、本发明采用了继代改良MS锡林郭勒型驼绒藜丛生芽进行增殖培养，其增殖系数可达3.2，得到了大幅度的提升，增加了锡林郭勒型驼绒藜的繁殖速度。

3、本发明采用的初代改良MS培养基和继代改良MS培养基钙（Ca）、镁（Mg）及其他组分均有减少，降低了成本。

4、本发明直接利用外植体在诱导培养基上诱导分化产生丛生芽，这一培养过程大大降低了培养时间，为建立锡林郭勒型驼绒藜快速扩增体系提供了有力支持。

5、本发明操作简便，经济适用，培养效率高，易于实施，缩短了培养周期，提高了诱导率，便于推广。

附图说明

图1是本发明诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法图；

图2是锡林郭勒型驼绒藜增殖培养扩繁苗种植后的根系图；

图3是锡林郭勒型驼绒藜增殖培养扩繁苗种植后的叶片图；

图4是锡林郭勒型驼绒藜增殖培养扩繁苗种植后的花及果实图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1

本发明提供一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法，包括以下步骤：

步骤1、选取锡林郭勒型驼绒藜枝条生长点下第3片叶子作为外植体，对外植体进行消毒灭菌处理后备用；

步骤2、将消毒处理后的外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导，所述诱导培养基的配方为：

初代改良MS+0.18mg/L 6-BA + 0.03mg/L NAA；

所述初代改良MS的配方为：将原MS培养基中的钙（Ca）、镁（Mg）的含量减少1.5mg/L；

步骤3、将诱导出的丛生芽种于继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：

继代改良MS+ 0.28mg/L 6-BA + 0.03mg/L NAA；

所述继代改良MS的配方为：：将原MS培养基中的大量元素减少1.5mg/L，其他组分不变。

优选地，所述外植体消毒过程为75%酒精浸泡25s，升汞溶液浸泡3min，最后使用无菌水清洗4次，每次25s。

优选地，丛生芽的诱导培养周期为20天、温度为18℃、湿度为55%。

优选地，培养周期为18天左右；温度为17℃，湿度为58%。

实施例2

一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法，包括以下步骤：

步骤1、选取锡林郭勒型驼绒藜枝条生长点下第5片叶子作为外植体，对外植体进行消毒灭菌处理后备用；

步骤2、将消毒处理后的外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导，所述诱导培养基的配方为：

初代改良MS+0.23mg/L 6-BA +0.08mg/L NAA；

所述初代改良MS的配方为：将原MS培养基中的钙（Ca）、镁（Mg）的含量减少1.5mg/L；

步骤3、将诱导出的丛生芽种于继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：

继代改良MS+ 0.33mg/L 6-BA + 0.08mg/L NAA；

所述继代改良MS的配方为：：将原MS培养基中的大量元素减少1.5mg/L，其他组分不变。

优选地，所述外植体消毒过程为75%酒精浸泡35s，升汞溶液浸泡5min，最后使用无菌水清洗6次，每次35s。

优选地，丛生芽的诱导培养周期为25天、温度为22℃、湿度为65%。

优选地，培养周期为23天左右；温度为23℃，湿度为63%。

实施例3

一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法，包括以下步骤：

步骤1、选取锡林郭勒型驼绒藜枝条生长点下第4片叶子作为外植体，对外植体进行消毒灭菌处理后备用；

步骤2、将消毒处理后的外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导，所述诱导培养基的配方为：

初代改良MS+0.2mg/L 6-BA +0.05mg/L NAA；

所述初代改良MS的配方为：将原MS培养基中的钙（Ca）、镁（Mg）的含量减少1.5mg/L。

步骤3：将诱导出的丛生芽种于继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：

继代改良MS+0.05mg/L NAA +0.3mg/L6-BA；

所述继代改良MS的配方为：：将原MS培养基中的大量元素减少1.5mg/L，其他组分不变。

优选地，所述外植体消毒过程为75%酒精浸泡30s，升汞溶液浸泡3-5min，最后使用无菌水清洗5次，每次30s。

优选地，丛生芽的诱导培养周期为22天、温度为20℃、湿度为60%。

优选地，培养周期为20天；温度为20℃，湿度为60%。

试验部分

为了证明一种用于诱导锡林郭勒型驼绒藜丛生芽的方法可行，本发明人对本发明方法进行了大量的科学试验，本次试验选取的标本由内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司提供的锡林郭勒型驼绒藜。

相关计算公式如下：

诱导率=未污染丛生芽个数/未污染接种外植体个数×100%；

增殖系数=继代后丛生芽总数/继代前的丛生芽总数。

试验一

选取选取生长健壮的无病虫害植株锡林郭勒型驼绒藜枝条生长点下第4片叶子30片作为外植体，75%酒精消毒30s，升汞溶液消毒4min，最后使用无菌水清洗5次，每次30s，平均分为5组，备用；

本次试验分为5个试验组A1到A5，具体如下：

A1：将消毒处理后的5片外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导；所述诱导培养基的配方为：MS+0.15mg/L6-BA+0.05mg/L NAA，测得其诱导率，具体实验数据见表1。

A2：将消毒处理后的5片外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导；所述诱导培养基的配方为：MS+0.2mg/L6-BA+0.05mg/L NAA，测得其诱导率，具体实验数据见表1。

A3：将消毒处理后的5片外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导；所述诱导培养基的配方为：MS+0.25mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA，测得其诱导率，具体实验数据见表1。

A4：将消毒处理后的5片外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导；所述诱导培养基的配方为：初代改良MS+0.15mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，测得其诱导率，具体实验数据见表1。

A5：将消毒处理后的5片外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导；所述诱导培养基的配方为：初代改良MS+0.2mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，测得其诱导率，具体实验数据见表1。

A6：将消毒处理后的5片外植体接种至诱导培养基进行丛生芽的诱导；所述诱导培养基的配方为：初代改良MS+0.2mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA，测得其诱导率，具体实验数据见表1。

试验二

选取诱导出的生长健壮高度一至的丛芽30株，平均分5组，备用；

本次试验分为5个试验组B1到B5，具体如下：

B1：将备好的丛生芽5株接种至继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：MS+0.20mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，测得其增殖系数，具体实验数据见表2。

B2：将备好的丛生芽5株接种至继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：MS+0.25mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA，测得其增殖系数，具体实验数据见表2。

B3：将备好的丛生芽5株接种至继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：MS+0.30mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA，测得其增殖系数，具体实验数据见表2。

B4：将备好的丛生芽5株接种至继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：继代改良MS+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，测得其增殖系数，具体实验数据见表2。

B5：将备好的丛生芽5株接种至继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：继代改良MS+0.25mg/L 6-BA+0.10mg/L NAA，测得其增殖系数，具体实验数据见表2。

B6：将备好的丛生芽5株接种至继代培养基中，进行增殖培养，所述继代培养基的配方为：继代改良MS+0.20mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，测得其增殖系数，具体实验数据见表2。

表1 不同诱导培养基对丛生芽诱导率的影响

表2 不同继代培养基对丛生芽增殖的影响

试验结论：

通过表1实验数据可以看出，诱导培养基对丛生芽诱导率最高的是A5组实验，诱导率达70%，较A1、A2、A3、A4、A6大幅度提高，显著增加了锡林郭勒型驼绒藜的繁殖速度；通过表2实验数据可以看出，继代培养基对丛生芽增殖的增殖系数最高的是B4组，较B1、B2、B3、B5、B6组有明显提高，进一步增加了锡林郭勒型驼绒藜的繁殖速度。