一种用于线粒体置换技术的改良显微操作液及其制备方法

摘要

本发明提供了一种用于线粒体置换技术的改良显微操作液及其制备方法。该用于线粒体置换技术的改良显微操作液由细胞松弛素B、二甲亚砜和Vitrolife辅助生殖IVF‑配子处理液配制而成；在该改良显微操作液中，细胞松弛素B的浓度为＞0μg/mL且＜2.5μg/mL。本发明提供的用于线粒体置换技术的改良显微操作液仅通过调整细胞松弛素B的浓度便达到了提高线粒体置换技术的有效性和安全性的目的，操作简单，为彻底阻断线粒体疾病母胎间遗传提供了安全保障。

说明书

技术领域

本发明涉及辅助生殖技术领域，具体涉及一种用于线粒体置换技术的改良显微操作液及其制备方法。

背景技术

卵子中的线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突变引起母系家族性疾病，即遗传性线粒体疾病，目前尚无有效治疗手段。

线粒体置换技术是用健康捐赠者的卵子的卵胞质来替换线粒体遗传病患者含致病mtDNA的卵胞质的一项技术，为这类患者带来了诞生健康后代的福音，有望彻底阻断线粒体疾病母胎间遗传，但其有效性和安全性一直是国内外专家争论的焦点，也是阻碍其临床广泛应用的关键。目前该技术常规使用的显微操作液中含有浓度为5μg/mL的细胞松弛素B(cytochalasin B，CB)来维持生殖细胞质的稳定性，从而保障线粒体置换操作的顺利进行。然而CB是一种真菌分泌的细胞渗透性毒素，具有抑制肌动蛋白聚合，从而破坏细胞骨架的作用。在小鼠和人卵母细胞的显微操作中普遍能观察到一种现象：含浓度为5μg/mL的CB的显微操作液会引起卵母细胞中线粒体朝细胞核聚集或形成团簇状。我们不禁要问，这种非生理现象是否会对线粒体置换技术的有效性和重构胚胎的安全性造成影响呢？细胞核周围的线粒体聚集是否会在核供体取出过程中带入更多的含致病基因的线粒体呢？迄今为止，尚未有研究能确切回答这些问题。由于线粒体遗传疾病的严重程度取决于突变和正常mtDNA的比率，即卵子/胚胎线粒体的异质性，这促使科学家们尝试各种方法使患者卵胞浆内的线粒体异质性尽可能降至最低，包括线粒体自噬、极体移植、基因编辑、提高显微操作机械技术等，但这些方法均昂贵且实施难度高，目前尚未有研究从改良显微操作液中CB的浓度这一简单易行的方法入手，来突破线粒体置换技术有效性和安全性的研究瓶颈。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种用于线粒体置换技术的改良显微操作液及其制备方法，来提高线粒体置换技术的有效性和安全性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种用于线粒体置换技术的改良显微操作液，由细胞松弛素B、二甲亚砜和Vitrolife辅助生殖IVF-配子处理液配制而成；在该改良显微操作液中，细胞松弛素B的浓度为＞0μg/mL且＜2.5μg/mL。

进一步地，在该改良显微操作液中，细胞松弛素B的浓度为＞0μg/mL且≤1μg/mL。

进一步地，在该改良显微操作液中，细胞松弛素B的浓度为1μg/mL。

本发明的第二方面提供上述改良显微操作液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将细胞松弛素B干粉溶解于二甲亚砜中混匀，配成细胞松弛素B 母液；

步骤二，将细胞松弛素B母液加入Vitrolife辅助生殖IVF-配子处理液中使得细胞松弛素B的浓度为＞0μg/mL且＜2.5μg/mL；优选为＞0μg/mL且≤1μg/mL，更优选为1μg/mL。

进一步地，步骤一中的细胞松弛素B母液的浓度为5～15mg/mL。

进一步地，步骤一中的细胞松弛素B母液的浓度为10mg/mL。

本发明的第三方面是提供一种用于线粒体置换疗法的试剂盒，该试剂盒包括上述改良显微操作液。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的用于线粒体置换技术的改良显微操作液仅通过调整细胞松弛素B的浓度便达到了提高线粒体置换技术的有效性和安全性的目的，操作简单，为彻底阻断线粒体疾病母胎间遗传提供了安全保障。

附图说明

图1是本发明一实施例中梯度浓度CB处理后小鼠卵子中线粒体呈聚集模式的卵子数目占两种分布模式总卵子数的百分比，其中柱下n为每组卵子数目， ****P＜0.0001；

图2显示了本发明一实施例中不同浓度CB处理的小鼠卵子线粒体在透射电镜下观察的超微形态；其中，图a-c分别显示了0μg/mL、1μg/mL和5μg/mL浓度CB处理的小鼠卵子线粒体的超微形态，图a和图b中白色箭头所指为正常线粒体分裂相，图c中深色箭头所指为异常分裂相；

图3显示了本发明一实施例中梯度浓度CB处理后(图a)或梯度浓度CB 处理并在不含CB的培养液中恢复30分钟后(图b)的小鼠卵子中纺锤体的宽度，其中，柱下n为每组卵子数目，***P＜0.001，****P＜0.0001；

图4显示了本发明一实施例中与传统显微操作液相对比，改良显微操作液对人类卵母细胞/受精卵取出的核小体携带mtDNA(图a)和对人类重构胚胎线粒体异质性(图b)的影响，**P＜0.01，***P＜0.001。

具体实施方式

本发明提供了一种用于线粒体置换技术的改良显微操作液及其制备方法，首次提出通过改良显微操作液中CB浓度这一简单可行的手段来提高线粒体置换技术的有效性和安全性。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供一种用于线粒体置换技术的改良显微操作液，其制备方法如下：

将10mg细胞松弛素B(CB，C6762，Sigma)干粉于室温下溶解于1mL的二甲亚砜(DMSO，D2650，Sigma)中混匀，配成10mg/mL的CB母液。吸取 1μL CB母液，加入至10mLVitrolife辅助生殖IVF-配子处理液(G-GAMETE

实施例2

本实施例在小鼠卵母细胞上全面评估含有不同浓度CB的显微操作液对卵子受精率、胚胎发育率、卵子线粒体分布、超微结构和纺锤体的形态的影响，具体的实验步骤和结果如下：

(1)共聚焦显微镜下观察梯度浓度CB处理对小鼠卵子线粒体分布模式的影响

1)将总数为978枚小鼠MII卵子在250nM的线粒体荧光染料MitoTracker Red(M7512，Life Technologies)和1mg/mL的染色体荧光染料Hoechst 33342 (R37605，LifeTechnologies)中进行共染色培养20分钟。

2)取10mg/mL CB母液1μL，加入含1mL的G-GAMETE溶液的离心管中，混匀，标为5号(5μg/mL CB组)；从5号离心管中吸取500μL溶液，加入含 500μL G-GAMETE溶液和0.5μLDMSO的离心管中，混匀，标为4号(2.5μg/mL CB组)；从4号离心管中吸取400μL溶液，加入含600μL G-GAMETE溶液和 0.6μL DMSO的离心管中，混匀，标为3号(1.0μg/mL CB组)；从3号离心管中吸取500μL溶液，加入含500μL G-GAMETE溶液和0.5μL DMSO的离心管中，混匀，标为2号(0.5μg/mL CB组)；1号离心管(0μg/mL CB组)中加入0.5μL DMSO和1mL的G-GAMETE溶液，混匀。

3)每组小鼠MII卵子分别在梯度浓度的CB溶液(0、0.5、1、2.5、5和 10μg/mL)中培养30分钟，每个实验组设置3个生物学重复(分3批次时间进行)。

4)共聚焦显微镜下观察卵子中线粒体的聚集情况，所有图像均在相同的显微镜设置和曝光时间下观察。图像呈现出两种线粒体聚集模式：①聚集模式，即超过50％的线粒体聚集在核周围；②分散模式，即线粒体分散在整个细胞质。聚集模式的评估由两位经过良好训练的互盲的观测者进行。每组卵子的聚集百分比 (％)＝[(观测者1标记的聚集模式卵子数+观测者2标记的聚集模式卵子数)/该组卵子数目×2]×100。

由图1可知，经CB浓度超过1μg/mL的显微操作液处理后，小鼠卵子中线粒体的聚集随CB的浓度升高而显著增加。

(2)培养液中CB浓度对小鼠卵子受精和发育的影响

1)6-8周龄BDF1雌鼠10只，采用PMSG 5IU超促排卵，hCG 5IU注射14小时后采用颈椎脱臼法处死小鼠并收集输卵管中的卵子，用透明质酸酶脱颗粒细胞，保留MII成熟卵子，弃去MI和GV未成熟卵子。

2)将收集到的216枚MII卵分至5个不同浓度CB处理组(0、0.5、1、 2.5和5μg/mL)，分别在含梯度浓度CB的显微操作液中培养30分钟，不同浓度CB显微操作液的制备方法同(1)的步骤2)；

3)10-12周龄BDF1雄鼠2只，采用颈椎脱臼法处死小鼠从附睾中获取精子，转移至200μL的HTF液滴中央获能，精子悬液最终浓度为4×10

4)卵子转移至精子悬液培养6小时后观察受精情况，并将受精卵转移至G-1 培养液(10128，Vitrolife)中继续培养，受精1天后观察卵裂数，受精2天后观察4细胞数，受精4天后观察囊胚发育情况。

由下表1可知，降低培养液中CB浓度不影响小鼠卵子受精和发育。

表1.不同浓度CB处理对小鼠卵子受精和发育的影响

注：每两组间进行卡方检验，无统计学差异，P＞0.05。

(3)透射电镜下观察不同浓度CB处理对小鼠线粒体超微结构的影响

1)将0、1、5μg/mL CB组的9枚小鼠MII卵母细胞在2.5％戊二醛中4℃固定2小时。卵母细胞用伊红染色30秒，包埋在1.2％的琼脂糖中。将琼脂糖凝胶立方体固定在2.5％戊二醛中，4℃过夜。

2)用0.1M磷酸盐缓冲液(PB)冲洗标本，1％四氧化锇固定1小时后，用 0.1M PB冲洗。样品在梯度乙醇中依次浸润脱水，并在100％丙酮中洗涤三次。用50％丙酮和50％树脂的混合物洗涤3小时，然后在树脂中渗透过夜。

3)超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，然后在透射电镜(TEM， JEM-2100；JEOL)下观察卵母细胞线粒体超微结构。

由图2可知，0μg/mL和1μg/mL浓度CB处理的小鼠卵子线粒体透射电镜下观察的超微形态：线粒体呈圆形、幼稚、空泡少，观察到正常分裂相；5μg/mL 浓度CB处理的小鼠卵子线粒体超微形态：变长、肿胀、空泡多，观察到较多异常分裂相。所以，CB浓度≥5μg/mL时会造成小鼠卵子线粒体分裂障碍和超微结构的异常。

(4)纺锤体观测仪观察不同浓度CB处理后小鼠纺锤体形态的变化

1)将282枚小鼠MII卵子分别在在梯度浓度的CB溶液(0、0.5、1、2.5 和5μg/mL)中培养30分钟，然后在不含CB的G-GAMETE溶液中洗涤三遍并培养15分钟；

2)通过Oosight成像系统纺锤体观测仪对卵子的纺锤体进行观测，通过对卵子旋转使得纺锤体清晰显示在卵子赤道平面并拍照；

3)对卵子进行恢复：在不含CB的G-1培养液中洗涤并培养1小时，然后同2)再通过纺锤体观测仪对卵子拍照留存；

4)使用Imsage J软件(v1.8.0)对每个卵子的纺锤体的长度进行测量。

由图3可知，CB浓度超过1μg/mL时纺锤体变宽且不可逆。

实施例3

本实施例探究与传统显微操作液相对比，改良显微操作液对人类卵母细胞/ 受精卵取出的核小体携带mtDNA和对人类重构胚胎线粒体异质性的影响，具体的实验步骤和结果如下：

1)纺锤体移植(ST)操作步骤：将30枚人MII卵子在显微操作前转移到含有不同浓度CB(1μg/mL和5μg/mL)的操作液微滴中5分钟。利用Oosight 成像系统确定主轴位置，并将其调整到3点钟位置。用手持移液管固定卵母细胞，然后用激光在3点钟方向的透明带上钻孔。抽吸纺锤体-染色体复合体，并短暂暴露于HVJ-E，然后转移到去核受体卵母细胞进行融合。重组卵母细胞经多次冲洗后置于G-GAMETE培养液中恢复和进行卵胞浆内单精子注射(ICSI)。

2)原核移植(PNT)操作步骤：将30枚人受精卵在显微操作前转移到含有不同浓度CB(1μg/mL和5μg/mL)的操作液微滴中5分钟。用移液管固定受精卵，旋转直至检出清晰的雌前核和雄前核。用激光在3点钟位置钻透透明带后，用去核移液管从开口吸出雌、雄原核。然后将原核短暂暴露于HVJ-E微滴下。将供者的原核移植入受者去核受精卵的卵胞浆内，进行融合，形成重组受精卵，经多次洗涤后置于G-1培养液中恢复发育。

3)采用三维数字聚合酶链反应(3D-digital Polymerase Chain Reaction，PCR)技术检测纺锤体-染色体复合体和原核的核小体中mtDNA的携带载量。选择 mtDNA的目标模板为nt16413-nt1648。正向引物序列为： GAAATCAATATCCCGCACAAGAG(SEQ ID No：1)，反向引物序列为： TTAGCTACCCCCAAGTGTTATGG(SEQ ID No：2)；TaqMan探针序列为 5-FAM-ACTCTCCTCGCTCCGG-MGB-3(SEQ ID No：3)。然后按照试剂盒说明书对mtDNA进行定量测定。

4)用焦磷酸测序法评估供体mtDNA的异质性。使用以下引物从全基因组中扩增人类线粒体位移环(D-loop)区域：正向引物序列为 TTAAACTATTCTCTGTTCTTTCATGGG(SEQ IDNo：4)；反向引物序列为 AAACATTTTCAGTGTATTGCTTTGAG(SEQ ID No：5)。扩增后的D-loop被克隆到pMD18-T载体中。对克隆的PCR产物进行测序，并使用Sequencher v.4.7 软件(GeneCodes)识别信息丰富的单核苷酸多态性(SNP)位点。为了检测重组胚胎中供体mtDNA的异质性，根据供体和受体女性不同的SNP位点设计了焦磷酸测序引物。然后按照试剂盒说明书对人类重构胚胎进行mtDNA异质性检测。

由图4可知，改良1μg/mL低CB浓度显微操作液组(即mST和mPNT组) 的核小体含有的mtDNA拷贝数显著低于传统操作液5μg/mL CB组(即ST和PNT 组)(图4a)，改良1μg/mL低CB浓度显微操作液组(即mST和mPNT组)的重构胚胎的线粒体异质性显著低于传统操作液5μg/mL CB组(即ST和PNT组)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海市同济医院

<120> 一种用于线粒体置换技术的改良显微操作液及其制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<400> 1

gaaatcaata tcccgcacaa gag 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<400> 2

ttagctaccc ccaagtgtta tgg 23

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<400> 3

actctcctcg ctccgg 16

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<400> 4

ttaaactatt ctctgttctt tcatggg 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<400> 5

aaacattttc agtgtattgc tttgag 26