与鸡性成熟或杂种优势相关的lncRNA及其调控的靶基因和应用

摘要

本发明公开了与鸡性成熟或杂种优势相关的lncRNA及其调控的靶基因和应用。本发明通过高通量测序技术和不同杂交组合卵巢组织LncRNA‑mRNA联合分析筛选到与鸡开产日龄、耻骨宽度和输卵管长度杂种优势显著相关的LncRNA并初步确定CACNA1C为其靶基因，其中，所述LncRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明通过实验验证证明，该LncRNA通过上调CACNA1C表达，影响机体GnRH分泌，调控鸡性成熟。本发明成功筛选出卵巢组织中高表达的LncRNA及其靶基因，其可作为性成熟和杂种优势的分子标志物或靶点，应用于鸡性成熟及其杂种优势预测和育种并有利于进一步阐明鸡性成熟的分子机制。

说明书

技术领域

本发明涉及与鸡性成熟或杂种优势相关的长链非编码RNA（lncRNA）及其调控的靶基因，本发明进一步涉及它们作为鸡性成熟或杂种优势预测的分子标记物的应用，属于长链非编码RNA及其调控的靶基因和应用领域。

背景技术

在家禽生产中，性成熟是一个具有重要经济价值的性状，适宜的性成熟时间对家禽产蛋量及蛋品质好坏至关重要。产蛋鸡的性成熟通常受到下丘脑-垂体-卵巢性腺轴调控，促性腺激素释放激素(GnRH) 分泌调节则是动物性成熟的基础。下丘脑通过分泌GnRH经由垂体门脉系统作用于垂体腺细胞，促进促性腺激素卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的分泌；FSH和LH经血液循环作用于卵巢，促进配子的形成和性腺类固醇激素(雄激素、雌二醇和孕酮等)分泌。类固醇激素参与卵泡的发育成熟，同时通过神经内分泌反馈通路影响GnRH分泌并促进性成熟。

杂种优势是指杂交后代在生产、繁殖、抗病等性能上表现出优于双亲均值的现象。研究表明大多数经济性状的杂种优势来源于基因的杂合性和基因间的相互调控作用，受到微效多基因的控制。中国地方鸡有着适应性强、蛋肉品质优良等性状，但产蛋量、产肉量普遍较低。在鸡品种改良和生产实践中，育种者常引入外国高产品种鸡的血缘，来改善地方品种的产蛋、产肉性状。比如，高产品种白来航和洛岛红被广泛用于改善地方品种生产性能，培育了众多的品种和专门化品系。杂种优势虽然被广泛应用，但是其形成原因仍然不清楚。

长链非编码RNA (Long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸，不具有编码蛋白潜能的长链RNA分子。在人类和动物的全部RNA序列中，大部分非编码序列为LncRNAs。研究证明LncRNA可分别通过与基因靶点、启动子和转录因子等结合，在转录、转录后及表观遗传学水平上调控基因的表达，进而调控复杂性状。LncRNA的表达谱具有时空特异性，这使得LncRNA作为复杂性状分子标记物具有独特的优势。

已有研究表明LncRNA在畜禽性腺发育和性成熟过程中发挥重要调控作用，但目前可以用于评估鸡性成熟及其杂种优势的相关LncRNA尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供了与鸡性成熟或杂种优势相关的LncRNA及其调控靶基因。

本发明的目的之二是将所述的与鸡性成熟或杂种优势相关的LncRNA及其调控靶基因作为鸡性成熟或杂种优势预测的分子标记物。

本发明首先提供了与鸡性成熟或杂种优势相关的LncRNA，其核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示，本发明进一步发现GnRH信号通路中的电压门控钙通道α1C亚基（CACNA1C，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示）为其调控的靶基因。

本发明通过组建北京油鸡和白来航纯繁和正反交组合，通过高通量测序技术和不同组合卵巢组织LncRNA-mRNA联合分析，筛选到与鸡开产日龄、耻骨宽度和输卵管长度杂种优势显著相关的LncRNA，并初步确定GnRH信号通路中的电压门控钙通道α1C亚基（CACNA1C）为其靶基因（其核苷酸序列为SEQ ID No.2），将LncRNA命名为LncRNA647520，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明进一步通过实验验证证明，Lnc-CACNA1C和CACNA1C在白来航和北京油鸡样本间显著性差异表达，且表达量和血液GnRH水平表现出杂种优势，即LncRNA647520通过上调CACNA1C表达，影响机体GnRH分泌，调控鸡性成熟。

因此，所述的与鸡性成熟杂种优势相关的LncRNA647520及其调控靶基因CACNA1C能作为鸡性成熟或杂种优势预测的分子标记物应用，包括：

（Ⅰ）评估鸡性成熟：检测待测品种鸡卵巢中所述lncRNA647520或CACNA1C的表达水平或者是同时检测所述lncRNA647520或CACNA1C的表达水平，与参照品种卵巢组织的lncRNA647520或/和CACNA1C的表达水平比较，根据表达水平判断鸡性成熟早晚。

作为一种优选的具体方式，本发明提供了一种应用所述lncRNA647520评估鸡性成熟的方法，包括：

①提取待测鸡卵巢组织样本的总RNA；

②以oligo-dT为3’引物，利用反转录酶进行lncRNA647520的反转录；

③采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.34所示的扩增引物进行所述lncRNA647520的荧光定量PCR检测；

④将检测的lncRNA647520的表达水平结果与参照品种卵巢组织的lncRNA647520的表达水平进行比较，评估鸡性成熟的早晚。

LncRNA647520的调控靶点CACNA1C的表达水平也与鸡性成熟具有明显的相关性，也可用于作为分子标记检测性成熟，在应用时，可单独使用LncRNA647520，也可将LncRNA647520和CACNA1C两者联合使用以进一步提高检测的准确性。

（Ⅱ）预测杂种优势：检测杂交鸡卵巢中所述lncRNA647520或CACNA1C的表达水平或者同时检测所述lncRNA647520或CACNA1C的表达水平，与亲本卵巢组织的lncRNA647520或/和CACNA1C的表达水平比较，根据表达水平的杂种优势判断鸡性成熟杂种优势；

作为一种优选的具体方式，本发明提供了一种应用所述lncRNA647520预测鸡杂种优势的方法，包括如下步骤：

①提取待测鸡卵巢组织样本的总RNA；

②以oligo-dT为3’引物，利用反转录酶进行lncRNA的反转录；

③采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行所述lncRNA的荧光定量PCR检测；

④将检测的lncRNA647520的表达水平结果与亲本品种卵巢组织的lncRNA647520的表达水平进行比较，判断鸡性成熟杂种优势。

LncRNA647520的调控靶点CACNA1C的表达水平也与鸡性成熟具有明显的相关性，也可用于作为分子标记检测性成熟，在应用时，可单独使用LncRNA647520，也可将LncRNA647520和CACNA1C两者联合使用以进一步提高检测的准确性。

（Ⅲ）选育不同性成熟鸡；作为参考，其选育方法和标准包括：检测留种个体全同胞卵巢组织中所述lncRNA或CACNA1C表达量或者同时检测所述lncRNA647520或CACNA1C的表达水平，根据表达量排序，选取靠前个体所在全同胞个体进行选留，达到选育性早熟个体和家系。

作为一种优选的具体方式，本发明提供了一种应用所述lncRNA647520选育不同性成熟鸡的具体方法，包括：

①提取待测鸡卵巢组织样本的总RNA；

②以oligo-dT为3’引物，利用反转录酶进行lncRNA647520的反转录；

③采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行所述lncRNA647520的荧光定量PCR检测；

④根据lncRNA647520的表达量排序，选取靠前个体所在全同胞个体进行选留实现选育性早熟个体和家系。

所述lncRNA647520的调控靶点CACNA1C的表达水平也与鸡性成熟具有明显的相关性，也可用于作为分子标记检测性成熟，在应用时，可单独使用所述lncRNA647520，也可将所述lncRNA647520和CACNA1C两者联合使用以进一步提高选育的准确性。

（Ⅳ）预测或辅助预测不同品种鸡性成熟，包括：检测不同品种鸡卵巢组织中所述lncRNA647520或CACNA1C表达量或者同时检测lncRNA647520和CACNA1C的表达量，根据表达量预测该品种性成熟早晚。

其中，作为一种优选的实施方式，应用所述lncRNA647520预测或辅助预测不同品种鸡性成熟的方法，包括如下步骤：

①提取待测品种鸡卵巢组织样本的总RNA；

②以oligo-dT为3’引物，利用反转录酶进行lncRNA647520的反转录；

③采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行所述lncRNA647520的荧光定量PCR检测；

④根据lncRNA647520表达量预测该品种性成熟早晚程度。

所述lncRNA647520的调控靶点CACNA1C的表达水平也与鸡性成熟具有明显的相关性，也可用于作为分子标记检测性成熟，在应用时，可单独使用所述lncRNA647520，也可将所述lncRNA647520和CACNA1C两者联合使用以进一步提高选育的准确性。

（Ⅴ）制备基因编辑鸡及性成熟基因组编辑育种

本领域技术人员可针对所述lncRNA647520和CACNA1C中遗传变异，包括但不限于SNP、CNV、SV、InDel等进行定向编辑，从而达到改变所述lncRNA647520和CACNA1C表达水平，进而改变个体的性成熟早晚。

本发明提供了评估鸡性成熟或预测杂种优势的荧光定量PCR试剂盒，包括：RNA反转录试剂、荧光定量RT-PCR扩增试剂、荧光定量PCR引物对；其中，荧光定量PCR引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了评估鸡性成熟或预测杂种优势的荧光定量PCR试剂盒，包括：RNA反转录试剂、荧光定量RT-PCR扩增试剂、荧光定量PCR引物对；其中，荧光定量PCR引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

本发明成功筛选出卵巢组织中高表达的LncRNA及其靶基因，其可作为性成熟和杂种优势的分子标志物或靶点，应用于鸡性成熟及其杂种优势预测和育种，并有利于进一步阐明鸡性成熟的分子机制，极具应用前景和理论价值。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992); Rossolini等人, Mol Cell. Probes8:91-98 (1994)）。

LncRNA(Long non-coding RNA)：长链非编码RNA，是一类长度大于200个核苷酸，不具有编码蛋白潜能的长链RNA分子。

附图说明

图1为性成熟相关性状的表型和杂种优势。

图2为杂交组合共有显性表达LncRNA和基因的韦恩图。

图3为非加性表达LncRNA、靶基因及信号通路网络图。

图4为激素水平和测序数据验证结果图。

图5为qRT-PCR检测LncRNA647520及其靶基因在不同组合卵巢组织中的相对表达量。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 筛选与鸡性成熟相关的分子标志物

⒈试验方法

⑴群体构建

选择白来航鸡（WW）与北京油鸡（YY），按照公母1:5配比进行纯繁和正反杂交组建2个纯繁组合（WW、YY）和2个杂交组合（WY、YW）。采用同一的管理方式饲养鸡群于同一栋鸡舍。

⑵表型分析和样本采集

鸡群22周龄时，根据个体耻骨宽度在WW、YY、WY、YW组合中分别挑选6个个体进行卵巢组织样本采集和输卵管长度测定，并将卵巢组织投入液氮中保存，随后转入-80℃冰箱备用，整个采样过程保持无菌环境。同时，采集选中个体的血液，分离血清，进行GnRH激素水平测定。显著性检验结果显示耻骨宽度、输卵管长度、开产日龄表现出显著的杂种优势（图1）。

⑶RNA样品制备

在无菌环境中，采用TRIzol试剂盒（(Invitrogen, USA)）提取个体卵巢组织总RNA，用NanoDrop 2000紫外分光光度计对所提RNA的纯度和浓度进行检测，在1.5%琼脂糖凝胶上检测RNA降解和污染。使用Bioanalyzer 2100检测样品RNA的RIN值。建库测序的要求是RNA总量不少于6 ug，OD260 nm和OD280 nm两者比值在1.8~2.2的范围内、RIN ≥7且28S/18S ≥1.0，浓度≥65 ng/μL，以确保使用合格的样品进行转录组测序，同时满足以上条件的样品可以进行下一步实验。

实施例2 LncRNA及其靶基因调控关系和关联信号通路分析

⒈建库测序

利用Epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒去除样品rRNA。然后进行片段化处理，利用随机引物和反转录酶合成第一链cDNA，再合成双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A并连接测序接头，最后通过PCR扩增得到cDNA文库。文库质检合格后使用Illumina HiSeq测序仪进行测序，得到原始测序数据。

⒉ LncRNA筛选

原始测序数据经过质控后得到clean reads。以Gallus-gallus 6.0版本基因组为参考基因组，按照Hisat2-Stringtie流程比对和组装得到转录本后，进行LncRNA预测。首先筛选长度大于200，外显子个数大于2，开放阅读框小于120个氨基酸，且位于基因间区、内含子区或者反义链上的转录本；然后应用CPC、CNCI、PLEK软件对候选转录本进行蛋白编码能力预测后取交集，并与Pfam数据库进行比对，最终得到LncRNA集。

⒊LncRNA和基因的表达模式分析

对LncRNA和基因Reads的数目和转录本长度进行归一化，采用FPKM（FragmentsPer Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作为基因和lncRNA表达量的指标。Log2|Fold Change| > 1.2且 FDR < 0.05作为差异基因筛选标准，鉴定非加性表达的LncRNA和基因。进一步在WY和YW中筛选到共有非加性表达基因771个和LncRNA 142个，这些基因显著（FDR < 0.05）富集在tissue development、anatomical structuremorphogenesis和regulation of cell population proliferation等生物学过程以及ECM-receptor interaction、Focal adhesion和GnRH signaling pathway等信号通路，图2为杂交组合共有显性表达LncRNA和基因的韦恩图。

⒋LncRNA和基因的共表达网络分析

根据不同样本FPKM的绝对离差中位数，筛选前40%的基因与LncRNA组成表达矩阵，采用R软件中WGCNA包进行共表达网络分析。首先根据LncRNA和基因相关系数构建邻接矩阵，然后采用一步法鉴定共表达模块，最后将共表达模块与输卵管长度进行相关分析，选取p < 0.05的共表达模块为候选模块。最终鉴定到5个共表达模块与输卵管长度、耻骨间距显著相关，其中绿色模块中的基因显著（FDR < 0.05）富集在anatomical structuremorphogenesis、ECM-receptor interaction、Focal adhesion和GnRH signaling pathway等生物学过程和信号通路。图3为非加性表达LncRNA、靶基因及信号通路网络图。如前所述，下丘脑释放GnRH刺激垂体前叶分泌促性腺激素进而调节性腺功能，GnRH信号通路在鸡性成熟过程中具有重要作用。因此，将GnRH信号通路中的基因确定为候选基因。

⒌LncRNA靶基因预测

进一步的发现分析3和4中GnRH信号通路共有一个候选基因CACNA1C。采用Bedtools软件预测距离LncRNA 上下游100kb范围内的顺式靶基因。通过Pearson相关分析计算样本LncRNA与基因表达量的相关性，以显著性p < 0 .05和相关性绝对值|R|>0.9为标准筛选反式靶基因。最终在绿色模块中找到一个反式调控CACNA1C的LncRNA，将其命名为LncRNA647520。

试验例1 血清GnRH水平检测和LncRNA及其靶基因的差异表达验证

根据GnRH检测试剂盒（CK-E60101，北京莱博泰瑞生物技术有限公司，北京）说明，每只鸡吸取血清40μL添加到96孔板中，随后添加工作液混合，并在37℃下培养1小时。弃上清，使用洗涤液洗涤五次。将底物A和B依次添加至每孔中。室温下培养10分钟后，每孔添加50μL终止液，终止反应。使用THERMO Multiskan Ascent在450nm处检测每孔OD值并计算血清GnRH含量。

在4个组合中对LncRNA647520和CACNA1C表达量进行PCR检测，每个基因3个重复，并随机挑选10个显性表达的LncRNA和基因进行表达趋势验证。

⒈反转录

根据RNA浓度，使用无RNA酶的ddH

⒉qPCR

反应混合物（10µL）由cDNA 1.5µL、正向引物0.5µL、反向引物0.5µL、SYBR GreenMaster（Mix）5µL, Rox 0.2µL和ddH2O 2.3µL组成。PCR扩增条件如下：95℃ 3min，然后在95℃下循环40次3s，60℃ 32s。最后，单次熔融循环为95℃ 15秒，65℃ 1分钟。使用LightCyler SYBR Green I Master Kit对每个cDNA样本进行三次重复。选取GAPDH为参考基因，以调整靶基因的相对定量。

⒊数据分析及结果

利用2

图4为激素水平和测序数据验证结果图。图5为qRT-PCR检测LncRNA647520及其靶基因在不同组合卵巢组织中的相对表达量。

本试验通过数据分析发现，杂交组合中非加性表达基因CACNA1C显著富集到GnRH信号通路，即基因通过参与该信号通路调节机体血清GnRH含量，调控性成熟。图4中，一方面为了证明CACNA1C的非加性表达调控性成熟和杂种优势，测定发现血清GnRH含量在杂交组合WY和YW中表现出杂种优势，与前期数据分析结果吻合；另一方面为了验证测序结果，随机选取了基因 LOXL2、GCH1、P2RX1、FHL1、ACTN1、CSRP1、KCNH2、TPM1、CYP21A1、FAM20A、TGFB1和lncRNA进行qPCR验证，结果与测序结果相关性达到0.9，证明了RNA测序的可靠性。此外，数据分析显示所述lncRNA的靶基因为CACNA1C，二者同时为WGCNA模块中共表达的非加性表达基因和lncRNA，与耻骨间距和输卵管长度杂种优势显著相关。图5中通过qRT-PCR检测发现所述lncRNA和CACNA1C均为非加性表达，验证了数据分析结果。综上，本试验结果能够证明LncRNA647520及其靶基因CACNA1C能应用于评估鸡性成熟及其杂种优势。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与鸡性成熟或杂种优势相关的lncRNA及其调控的靶基因和应用

<130> BJ-2001-220415A-L

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2716

<212> DNA

<213> Chicken

<400> 1

taaaatttag gtaagtccca ttgagctgag gtattcaaaa gctttggagg gaaagtctgt 60

gcggttgctg gatcctgtat atttacaaac ccatccgtac tgagtagagc actgcgatct 120

ccagatcctc agctctggaa ggaaggtgtc tgctgcctcg gcgacgcgtg cagaacgcag 180

ctctaatttg ggcttgacgt gactctgtgc tttgtgctgg tgcacaggcc atgcgtgtct 240

cctgcgtgat gaatgctcac atgctggtga tgcaagcgag ccgtctctgt gctctgttga 300

taatggcagg agtgggagtg gggctccgaa ttcaggcggt gcagtgtgaa gcgcttggcg 360

ctgtgtgcac ccagcccggc tgctgcaggg gggctgtggg gcagcgcctg tgggtgctgc 420

tggcggagct gcggccccgg ctgtgcccat gggtgctgcg gtggaaccgc ctgccgcgcg 480

gggttctgaa tccgaaatac gtggggtacg gtacgaagga tcagacagga tttcgggagt 540

tcactgcctt ttctattttt attcgtatgt tcagcagcag cacggagggg cacaaatcat 600

tttcatgtat gcaaaaataa tttcgaaaat ggtattagtc tcagcaggtg aggccttttg 660

tttcttccat gcttatgtac aaactcctag ggaacactaa atattaaatt gaaataaccc 720

tcccttatta ttacacagct atggattcaa tttaattctc ttcagataag gtttttctgg 780

acacatattt gcaattgcct gtcctgtaaa tacagctcag cctgcaggtt cgctcctgcc 840

tgcttttcgg tgggaagggc gctgtgttta tgtgcctttg gattttttgg atgtcggcac 900

ttccacattg tcattatgtt tatggattgc aagactgctg taaggcgtcc cccctccccc 960

ttacctggcc agagaaatga gttaatctct ccacagagac attcctttac ttcaccacct 1020

gttttcaaat cccggtaacc aaaggagtgg aaatagagag cccagcctga gcccaaaggc 1080

ggtgccaatg gagcatcccc agcacctgta gcacatgggg ctaaggctca acgtgcaggc 1140

tgaaatgaag gtgattttgc catgcctgtc ttttgttatg gctggcaaaa aaggtaggcc 1200

ttgaaattgc atcactacca tttgtatttc atagccaccc aggattcaga tatttggtgc 1260

tgttgcatag tgccttctta tggagagcac aaggactttt aaaacctttg tgtcttctaa 1320

caaaatacct cagattcaga gatgagacag taatcatcca aagctttaca tttttttctt 1380

tacactaagg aattagtctc atttttagga aaataaatat atggtctagc tcgcctagta 1440

agactgtctt cactgtgttt aagtaataat catttattgt ttaaatacag tagaggctgt 1500

aacaaaatgc tgtcaagagc catcacactc attaacctgc cagctaatta gcctcctcct 1560

gcctgattgc tgacaagttc ttcaatctga acctatcgct gttgtgtcag cactgaagca 1620

ccaagcgaag tggaggaggg ctccattaga tgtttgcgaa caaagtctgt gcattaaagg 1680

tttgttttct gcactccaac aaatgttaca gcattaatat tctcagctat aattaaattg 1740

gaaactctta attatgataa ttagtgcatt aaccatttat ttcctagcat cactaccagg 1800

tgaggctcag gaactcaaga caaaagccaa ggcaatgctc gctgctcttt ggagctgctg 1860

ggcacgaaga ggttggtgcc ctccttcccc gggcagggca gcagcaggag atgctggagg 1920

gacgtgcacc cagacctgag gcccggtgct gggaagcacc tgtggaaatg caatgaatgc 1980

aaatgtcctc acccaggcag actgagctgt aggacggtgc tttgtggact ctcaaaagag 2040

cagagcagat tgccctttca gcagcctccc caagtctgtt atcagtaatt ttatctctta 2100

gggaattcag gaatttttca gtctcagttt attgcttttg atcttctgtt cacatgatag 2160

aaccaaactg tgaattgccg taatgtgcat ttcttcgcac acagacgtgc caggccaaag 2220

caaacatctt tacctgcatt gtgcaaaaga gaaccttttc agtcagccct gaaacctgtc 2280

tccgagtata tcaccttagt ggaggtaaga aaagttctgc cctgatgttt ctggtttaac 2340

acagcagatt ttcaggagta gaaattcttg ccactttcaa agggagagaa ggtgttacct 2400

tgatattagc gttttttccc tgcctagtgc ttaataattc tgtatgtata tagtaaaagg 2460

gagataaccc aaggcaaatt taatttcaga ttgggctttt gcttaatgta ttattcatag 2520

tattatttat atcatcactt agacatatcc ctggcaataa actgaaaact tcactttaac 2580

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<210> 2

<211> 11206

<212> DNA

<213> Chicken

<400> 2

agcgagagcg agcaagctca cattccaaga gaagttttct ggctatgtca ggactgaagt 60

ccaccccttg ctagacaaac ctattttttt tttcaaacac aagaggatat tatcagagaa 120

gcctgtgctg atatacagaa accagagatg gccatggctc ggtgaggtga cgagctgacg 180

ggcggatggc ccccactatc tccacttctc agtcctgaaa aagttttcct gaaaaaccac 240

aaggggagga gaagactcca acggaacata aggcacacaa gacaagaaaa ggattaggag 300

tgaggagcaa ggaaaggaag aagagtgcat tagatattgc ggaggcttca gagagctgga 360

aagtagcttc tagatgaaag gaccaagttg tcagtagctc tggtttttgg ttttttaact 420

tctgcacaag gctattacat aaaataactc cgcattagga aacaatcgtc taaaaggaat 480

ttacctcctt tatattgaga aaatatattc aagctcagtg gtttcaaagc tccttggaat 540

tttaaaacat gtttcaagcc tttgttcggc aagcatacca accgctatcc agccaccagc 600

aaggggaatc tgaaacgaag tacaggggga agctggtgca tgaaactcag ctcaactgct 660

tctacatcaa acctggaggt tccaattatg ggagtccccg tccagctcat gccaacatga 720

atgccaatgc agctgcaggg cttgccccag agcatatccc tacaccaggg gcagctctgt 780

cctggcaagc tgcaattgat gctgccaggc aagccaaatt gatgggtagt gctggcaatg 840

caacaatatc cacagctagc tccacgcaga gaaaacggca gcagtacggg aaacagaaaa 900

aacagggtac cacgacagct acgcgtcctc cccgggcact gctgtgttta acactgaaaa 960

atcccatccg gagggcatgc atcagcatcg tcgaatggaa accatttgaa ataattattt 1020

tactgactat ttttgccaat tgtgtggcct tagctatcta tatccccttt ccagaagatg 1080

attccaatgc caccaattcc aatctggaac gagtggaata tctctttctc ataattttta 1140

cagtggaagc atttttaaaa gtaatagcat atggacttct ctttcacccc aacgcttacc 1200

tccgcaatgg ctggaattta ctagatttta taattgtggt agtagggctt tttagtgcaa 1260

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ttgatgttaa agcactgcgg gctttccgag tattacgtcc cttacgactg gtgtctggag 1380

ttcctagtct ccaggtggtt ttaaattcaa ttatcaaggc catggtccct ttgttgcata 1440

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