一种与猪总产仔数性状相关的lncRNA因果突变位点及其应用

摘要

本发明公开了一种与猪总产仔数性状相关的lncRNA因果突变位点及其应用，该突变位点位于如SEQ ID NO.1所示的猪lnc‑NORHA基因核心启动子的第33位碱基上，该位点为CG单碱基突变，该位点在母猪群体中存在CC和CG 2种基因型，CC型经产母猪总产仔数比CG型母猪高。本发明所述突变位点与总产仔数性状显著关联，采用简便的基因分型技术检测该位点，便可在早期选留高繁后备母猪，这对高繁后备母猪的早期精准选择、减少后备母猪群体规模以节本增效、保障繁殖猪群和后续商品猪群生产性能，以及在非瘟常态化条件下降低风险等具有重要价值。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及猪lncRNA NORHA基因核心启动子序列、与猪总产仔数性状显著关联的因果突变位点及其应用。

背景技术

后备母猪是生猪养殖场的未来，后备母猪的质量直接决定了繁殖猪群和后续商品猪群的生产性能。选择优质后备母猪是生猪生产链的关键一环，不仅可以实现繁殖猪群的有效更新 (母猪每年更新率为40％左右)，维持繁殖猪群结构的稳定、确保繁殖猪群较高生产水平，而且还可以实现商品猪群生产性能最大化，提高猪场总体经济效益。为了选择到优质的后备母猪，一般情况下后备母猪群体规模均较大，约为最终选留数的3倍。因此，后备母猪的早期选留，对于降低后备母猪群体规模，节省一部分培育费用、降低成本等均具有重要意义。对于一些早期表现出现的性状，如断奶窝重、新生仔猪成活率、初生重、有效乳头数和遗传缺陷等，比较容易进行早期选择。但也有部分生产性能特别是繁殖性能在后备母猪早期阶段还无法测定，这就给后备母猪的选留造成了极大的困难。基于遗传标记的基因组选择技术是实现后备母猪早期选留的可靠方案，仔猪出生3日龄即可采样检测，而14日龄就可实施第一次基因组选择。有研究指出，利用基因组技术进行早期选择，准确性与基于性能测定的常规育种相当，但远高于传统的系谱指数准确性。但基因组选择需要大量的遗传标记，但目前鉴定的遗传标记主要集中在蛋白编码基因上，特别是功能已知的可靠遗传标记较少。另外，与母猪繁殖性状显著关联的、长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)上的遗传标记还未见报道。本课题组前期证实lncRNA NORHA是猪卵巢颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁 (母猪繁殖力限制因素)的关键调节因子，且位于一个母猪繁殖性状的数量性状位点(quantitative trait loci，QTL)内，说明其可能与母猪繁殖力有关。但目前尚未在lncRNANORHA基因上发现与母猪繁殖性状关联的突变位点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪lncRNA NORHA基因核心启动子序列、一个与母猪总产仔数性状显著关联的因果突变位点，因果突变位点检测技术，和高繁后备母猪的早期精准选择方法。

本发明的另一目的在于提供上述因果突变位点在高繁后备母猪早期精准选择中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

猪lncRNA NORHA基因核心启动子序列，含有150个核苷酸，如SEQ ID NO.1所示。

一个与母猪总产仔数性状显著关联的突变位点，该突变位点位于如SEQ ID NO.1所示的猪lncRNA NORHA基因核心启动子的第33位碱基上，即7号染色体参考基因组的100136246核苷酸处，该位点为C>G单碱基突变，故命名为rs100136246；该位点在母猪群体中存在CC和CG 2种基因型，CC型母猪总产仔数比CG型母猪高，其中CC型母猪总产仔数比CG型母猪高0.78头/胎，差异显著；该突变通过增强与转录激活因子KLF4的结合促进lncRNANORHA转录，进而降低母猪繁殖力，是一个影响母猪繁殖力的因果突变位点。

用于检测猪基因组中是否存在上述因果突变位点的特异性引物对，其正反向引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

一种检测猪基因组中是否存在上述因果突变位点的方法，利用设计的特异性引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3对猪基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行直接测序，鉴定不同基因型。

一种高繁后备母猪的早期精准选择方法，采用特异性引物对SEQ ID NO.2和SEQID NO.3对猪基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物测序分型，选留CC型后备母猪。

上述的突变位点在高繁后备母猪早期精准选择或者在制备高繁后备母猪早期精准选择芯片中的应用。

上述的特异性引物对在检测上述的突变位点中的应用。

上述的特异性引物对在高繁后备母猪早期精准选择或者在制备高繁后备母猪早期精准选择芯片中的应用。

后备母猪质量直接决定了繁殖猪群和后续商品猪群的生产性能，但部分生产性能特别是繁殖性能在后备母猪阶段还无法测定，给后备母猪的选留造成了极大的困难。由于本发明所述突变位点与总产仔数性状显著关联、且影响基因转录活性，采用简便的基因分型技术检测该位点，便可在早期选留高繁后备母猪(即CC基因型母猪)，这对高繁后备母猪的早期精准选择、减少后备母猪群体规模以节本增效、保障繁殖猪群和后续商品猪群生产性能，以及在非瘟常态化条件下降低风险等具有重要价值。

本发明的有益效果：

本发明提供了猪lncRNA NORHA基因核心启动子全序列、一个与总产仔数性状显著关联的因果突变位点及其检测技术，可用于高繁后备母猪的早期选择。

附图说明

图1猪lncRNA NORHA基因核心启动子突变位点测序分型峰图。

图2猪lncRNA NORHA基因核心启动子突变位点与母猪总产仔数性状的关联分析。

图3猪lncRNA NORHA基因核心启动子突变对启动子活性的影响。

图4猪lncRNA NORHA基因核心启动子突变影响转录激活因子KLF4对其活性的调控。图5转录激活因子KLF4与猪lncRNA NORHA基因核心启动子KLF4结合元件(KBE)直接结合。

具体实施方式

结合实例，进一步说明本发明。

实施例一

1、实验材料

雌性大白猪耳样采自江苏省某国家级核心育种场，记录每头母猪各胎次的产仔数。

2、基因组DNA提取

耳样DNA采用酚/氯仿抽提法提取，稀释成50ng/μL作为PCR扩增模板。

3、引物设计

根据猪lncRNA NORHA基因核心启动子(SEQ ID NO.1)，利用Primer Primer5.0软件设计1对引物，正向引物序列为：5'-CAC CTA GCC AGA GAG CAA CAA T-3'(SEQ IDNO.2)，反向引物序列为：5'-GCC TGT GTT CCT TCC TGT TTC-3'(SEQ ID NO.3)。引物由上海生工生物公司合成。

4、PCR扩增

PCR扩增体系为10μL，含0.5μL DNA模板、0.5μM正向游引物、0.5μM反向引物、 5μL2×Premix rTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)和双蒸水3.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，最后72℃延伸 5min。本发明采用的PCR仪为TaKaRa梯度PCR仪。

5、测序分型

PCR扩增产物采用纯化试剂盒(北京天根公司)纯化后，直接送上海生工生物公司进行测序。测序峰图用Chromas v2.3软件进行分析，判别基因型，rs100136246位点为C单峰的判为CC基因型，双峰则判为CG基因型(附图1)。结果发现CC基因型母猪298头，CG 基因型母猪15头。

6、关联分析

采用SAS9.2软件中的一般线性模型对rs100136246突变位点多态性与总产仔数性状进行关联分析。一般线型模型为：

y＝μ+x

其中：y为繁殖形状观察值，μ为群体平均数，x

结果发现，母猪群体中存在2种基因型(CC和CG)，其中CC型母猪总产仔数比CG 型母猪高0.78头/胎，差异显著。

7.突变位点功能验证

利用3中的引物扩增lncRNA NORHA基因核心启动子序列，并将其克隆到荧光素酶报告载体pGL3-basic(Promega公司)中，构建含有突变位点2种等位型(C等位型和G等位型)的lncRNA NORHA核心启动子荧光报告载体pGL3-C和pGL3-G(为常规技术)。将2 个报告载体转染猪卵巢颗粒细胞，荧光素酶活性分析发现rs100136246突变增强了lncRNA NORHA启动子活性(附图3)；转录激活因子KLF4对G型启动子活性影响较大(附图 4)。ChIP证实KLF4可与突变位点所在的启动子直接结合(附图5)。这些结果说明 rs100136246是一个影响母猪繁殖力的因果突变位点，通过增强启动子与转录激活因子KLF4 的结合，诱导卵泡闭锁(母猪繁殖力限制因素)相关基因lncRNA NORHA转录，进而影响母猪繁殖力。

后备母猪质量直接决定了繁殖猪群和后续商品猪群的生产性能，但部分生产性能特别是繁殖性能在后备母猪阶段还无法测定，给后备母猪的选留造成了极大的困难。由于本发明所述因果突变位点与总产仔数性状显著关联，采用简便的基因分型技术检测该位点，便可在早期选留高繁后备母猪(即CC基因型母猪)，这对高繁后备母猪的早期精准选择、减少后备母猪群体规模以节本增效、保障繁殖猪群和后续商品猪群生产性能，以及在非瘟常态化条件下降低风险等具有重要价值。

猪lncRNA NORHA基因核心启动子序列

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ggccaccccc ccacctttgg gggctctgag accctagaag gaaagcacca ggaaacccca 120

aaccgtctcc ctcccgaaaa caatggcttc 150。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种与猪总产仔数性状相关的lncRNA因果突变位点及其应用

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<210> 1

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agccactcac ttcccatcca ggtcctttca gacgacggcc tgcatggtta ccatggagag 60

ggccaccccc ccacctttgg gggctctgag accctagaag gaaagcacca ggaaacccca 120

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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