一种用于测定膨化食品中脱氢乙酸的高效高精准度的方法

摘要

本发明公开了一种用于测定膨化食品中脱氢乙酸的高效高精准度的方法，涉及食品检测技术领域，包括如下步骤：(1)粉碎处理(2)酶解处理(3)去脂处理(4)高效液相色谱仪测定。本发明方法整体处理步骤简单，分离速度快，分离度高，且方法的线性范围、检出限和定量限、回收率及精密度均能满足定量分析的要求，此方法非常适用于膨化食品中脱氢乙酸的测定。

说明书

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体为一种用于测定膨化食品中脱氢乙酸的高效高精准度的方法。

背景技术

膨化食品以谷物、薯类为原料，添加一定比例的食品添加剂或其他辅料，采用焙烤、油炸、微波或挤压等膨化工艺而加工制成的食品。口感香脆、酥甜，具有一定的营养价值，深受广大消费者，尤其是青少年的喜爱。由于生活水平的逐年提升，消费者对食品质量要求也越来越高，保障膨化食品的安全性显得越发重要。

脱氢乙酸是新一代广谱型食品防腐剂，对霉菌、酵母菌和细菌的抑制能力极强。其防腐效果是苯甲酸钠的2-10倍，受到商家的青睐，可以通过延长食品保质期得到更大利益。但已有毒理学研究表明，脱氢乙酸会对人体的肾脏、肝脏以及中枢神经系统产生慢性影响。目前，我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB2760—2014)中规定膨化食品中不得使用脱氢乙酸。因此，检测膨化食品中的脱氢乙酸含量对于保障食品安全具有重要的意义。国标GB 5009.121-2016食品中脱氢乙酸的检验方法有气相色谱法、高效液相色谱法。高效液相色谱法由于具有灵敏度高、分离好、快速等特点，已被广泛使用。但国标法检测膨化食品中脱氢乙酸时经常会受到膨化食品自身特性的问题，如膨化食品中淀粉含量较高，样品加水提取时，迅速吸水膨胀导致无法离心而且变得比较粘稠等，导致脱氢乙酸提取不完全，且提取效率慢，进而影响了检测的正确性，故需要研究一种更快、更准确的检测方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于测定膨化食品中脱氢乙酸的高效高精准度的方法，解决了现有测试方法提取效率慢、正确性不高的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种用于测定膨化食品中脱氢乙酸的高效高精准度的方法，包括如下步骤：

(1)粉碎处理：

对待测的膨化食品样品进行粉碎处理，得样品粉碎料备用；

(2)酶解处理：

将步骤(1)处理的样品粉碎料置于离心管中，加入去离子水，然后再用氢氧化钠溶液调节pH值至7.5，随后加入淀粉酶进行酶解处理；

(3)去脂处理：

向步骤(2)处理后的离心管中加入正己烷，再进行恒温震荡处理4～6min，完成后离心去除正己烷层，再进行一次上述的重复操作即可；

(4)高效液相色谱仪测定：

将步骤(3)处理后的离心管内的上清液转移入容量瓶中，加水定容后再经微孔滤膜过滤，最后再用高效液相色谱仪测定即可。

进一步的，步骤(2)中所述的样品粉碎料的加入量与去离子水加入量的重量体积比为1:4g/mL。

进一步的，步骤(2)中所述的氢氧化钠溶液的浓度为20～25g/L。

进一步的，步骤(2)中所述的淀粉酶为α-淀粉酶。

进一步的，步骤(2)中所述的淀粉酶的加入量是样品粉碎料总质量的0.4‰。

进一步的，步骤(2)中所述的酶解处理的条件是将离心管放入到温度为60℃的超声波清洗器中超声处理20min。

进一步的，步骤(3)中所述的正己烷的加入量是去离子水总体积的50％；所述恒温震荡处理是在恒温震荡水浴器内以200r/min的转速震荡处理5min；所述离心处理的转速为8000r/min。

进一步的，步骤(4)中所述的微孔滤膜的孔径为0.45μm。

进一步的，步骤(4)中所述的高效液相色谱仪测定时条件控制为：

色谱柱：Waters SymmetryShield C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：A为甲醇，B为0.02mol/L磷酸氢二钠溶液；等度洗脱，流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10uL；波长：293nm；PDA采集波长光谱检测范围为200nm～700nm。

(三)有益效果

本发明提供了一种用于测定膨化食品中脱氢乙酸的高效高精准度的方法。具备以下有益效果：

本发明采用酶法水解淀粉、正己烷除脂、优化色谱条件等方法，解决了膨化食品中脱氢乙酸提取效率低、色谱峰拖尾等问题，并且通过光谱图与保留时间共同定性，避免假阳性发生。上述方法整体处理步骤简单，分离速度快，分离度高，且方法的线性范围、检出限和定量限、回收率及精密度均能满足定量分析的要求，此方法非常适用于膨化食品中脱氢乙酸的测定，极具推广应用价值。

附图说明

图1为本发明测定的α-淀粉酶对色素提取的影响图；

图2为国标方法检测结果图；

图3为本发明方法检测结果图；

图4为二极管阵列检测器采集检测的光谱图；

图5为标准曲线绘制图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所用到的成分及仪器如下：

脱氢乙酸(1000μg/mL)标准溶液(农业部环境保护科研监测所)；α-淀粉酶(天津市光复精细化工研究所)；甲醇(色谱醇)、正己烷、氢氧化钠、磷酸氢二钠均为国产分析纯；超纯水由milli-Q水纯化设备自制；膨化食品(市售)。

戴安UtiMate3000高效液相色谱仪(美国赛默飞公司)；高速冷冻离心机(Sartorius公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；恒温振荡水浴器(Julabo公司)。

实施例1

一种用于测定膨化食品中脱氢乙酸的高效高精准度的方法，包括如下步骤：

(1)粉碎处理：

对待测的膨化食品样品进行粉碎处理，得样品粉碎料备用；

(2)酶解处理：

将步骤(1)处理的样品粉碎料置于离心管中，加入去离子水，然后再用氢氧化钠溶液调节pH值至7.5，随后加入淀粉酶进行酶解处理；

(3)去脂处理：

向步骤(2)处理后的离心管中加入正己烷，再进行恒温震荡处理4～6min，完成后离心去除正己烷层，再进行一次上述的重复操作即可；

(4)高效液相色谱仪测定：

将步骤(3)处理后的离心管内的上清液转移入容量瓶中，加水定容后再经微孔滤膜过滤，最后再用高效液相色谱仪测定即可。

进一步的，步骤(2)中的样品粉碎料的加入量与去离子水加入量的重量体积比为1:4g/mL。

进一步的，步骤(2)中的氢氧化钠溶液的浓度为20～25g/L。

进一步的，步骤(2)中的淀粉酶为α-淀粉酶。

进一步的，步骤(2)中的淀粉酶的加入量是样品粉碎料总质量的0.4‰。

进一步的，步骤(2)中的酶解处理的条件是将离心管放入到温度为60℃的超声波清洗器中超声处理20min。

进一步的，步骤(3)中的正己烷的加入量是去离子水总体积的50％；恒温震荡处理是在恒温震荡水浴器内以200r/min的转速震荡处理5min；离心处理的转速为8000r/min。

进一步的，步骤(4)中的微孔滤膜的孔径为0.45μm。

进一步的，步骤(4)中的高效液相色谱仪测定时条件控制为：

色谱柱：Waters SymmetryShield C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：A为甲醇，B为0.02mol/L磷酸氢二钠溶液；等度洗脱，流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10uL；波长：293nm；PDA采集波长光谱检测范围为200nm～700nm。

实施例2

称取样品粉碎料5g(精确到0.01g)，放入50mL的离心管中。加去离子水20mL，涡旋使样品悬浮起来，用氢氧化钠溶液(20g/L)调pH值至7.5。然后加入2mgα-淀粉酶,放入温度为60℃的超声波清洗器超声20min，然后加入10mL正己烷于转速200r/min恒温振荡水浴器振荡振荡5min，于8000r/min离心5min，弃去正己烷层，重复一次。将上清液移入25mL容量瓶中，加水定容至刻度。经0.45μm微孔滤膜过滤，取10μL在高效液相色谱仪上进行测定。

色谱柱:Waters SymmetryShield C18(4.6×250mm，5μm)；流动相:A为甲醇，B为0.02mol/L磷酸氢二钠溶液；等度洗脱，流速:1.0ml/min；柱温:30℃；进样量:10ul；波长:293nm；PDA采集波长光谱检测范围为200nm～700nm。

准系列溶液的配制：

精密量取适量脱氢乙酸标准储备溶液，加水定容至刻度，依次配制成质量浓度分别为1.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL的标准工作溶液。在上述色谱条件下进行测定，以标准系列溶液浓度为横坐标(X)、相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，绘制标准曲线。

本发明在探究上述技术时，进行了大量的实验操作，其中将部分测试内容公开如下：

考虑到膨化食品中淀粉含量较高，样品加水提取时，迅速吸水膨胀导致无法离心而且变得比较粘稠，进而致使脱氢乙酸提取不完全，本申请人先采用酶法酶法水解样品中淀粉，然后再通过正己烷除去油脂，并配合优化探索测定条件，较好地解决了膨化食品中脱氢乙酸提取回收率较低和脂类物质干扰等问题。

α-淀粉酶对色素提取的影响：

该酶可分解膨化食品中的淀粉，使粘稠的样品变得稀薄。由附图1可知，在酶最适pH、温度和作用时间一致的条件下，加入α-淀粉酶时减少了样品中淀粉对脱氢乙酸的吸附；测得的脱氢乙酸含量随着酶添加量(均以试样为100％计)的增多而变化，当酶添加量为2％时，脱氢乙酸回收率为43.30％，当酶添加量大4％时，随着酶添加量的增加脱氢乙酸的回收率无显著变化。根据添加量最少，提取效果最佳的原则综合分析，可知当酶添加量4％时较为适宜。

流动相的选择：

按照国标方法GB 5009.121提供色液相条件进行检测，如附图2所示，目标峰(脱氢乙酸)色谱峰拖尾严重。原因在于脱氢乙酸的羰基结构易与C18柱中的硅羟基结构发生反应，形成氢键。本发明通过大量的实验结合来确定合适的流动相，具体采用甲醇：0.02mol/L磷酸氢二钠溶液＝10∶90(V/V)作为流动相进行等度洗脱，对膨化食品中脱氢乙酸进行检测，色谱图见附图3所示，可见目标峰对称性好，与杂质峰分离效果好，显著提高了方法的灵敏度。

膨化食品种类繁多、成分复杂。尽管采取有效的处理方法，仍然会出现未知成分的干扰。因此仅依靠保留时间定性将影响结果的准确性。同时利用二极管阵列检测器可以采集被测组分的光谱图，如附图4所示，从而弥补利用单一紫外波长吸收进行色谱分析过程中色谱峰保留时间定性的不足，增强高效液相色谱法定性分析能力，避免假阳性发生。

在上述色谱条件下，以保留时间和吸收光谱进行定性，峰面积进行外标法定量脱氢乙酸标准系列溶液质量浓度为横坐标(X)、其相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，绘制标准曲线，结果见附图5。由附图5可知，该方法在1～200μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，标准曲线线性回归方程为y＝0.5374x+0.0018，相关系数R2为0.9997，以3倍信噪比计算检出限，方法检出限为0.5mg/kg。

分别将脱氢乙酸标准溶液以高中低三个浓度水平添加到空白面筋、糙米卷、膨化玉米棒3个样品中，每个添加水平做2个平行，重复测定6次，按照上述处理样品进行回收实验，结果如下表1所示。样品的平均加标回收率在92.6％～103.2％之间，相对标准偏差＜5％，表明该方法重现性及精密度均能满足分析要求。

表1

综上，本发明解决了膨化食品中脱氢乙酸提取效率低、色谱峰拖尾等问题。同时，通过光谱图与保留时间共同定性，避免假阳性发生。该方法前处理简单，分离速度快，分离度高，且方法的线性范围、检出限和定量限、回收率和精密度均能满足定量分析要求。非常适用于膨化食品中脱氢乙酸的测定。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。