预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒

摘要

本发明涉及一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒，DNA羟甲基化标志物包括NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348，其羟甲基化程度指示缺血性脑卒中发病风险程度。本发明提供的NPPA基因DNA羟甲基化标志物可用于预测缺血性脑卒中发病风险，也可以作为预防和控制缺血性脑卒中的干预靶点，不仅有助于阐释心房利钠肽作用于缺血性脑卒中的分子机制，也将为NPPA基因羟甲基化作为预防和控制缺血性脑卒中的药物靶点提供重要的流行病学证据。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒。

背景技术

近年来虽然我国在心脑血管疾病的预防和治疗方面已取得一定的成绩，但脑卒中发病率、患病率、复发率和死亡率仍然居高不下，是我国居民死亡和残疾的首要原因，且随着社会老龄化和城市化进程加速，居民不健康生活方式流行，心脑血管疾病危险因素普遍暴露，我国脑卒中疾病未来有爆发式增长的态势。脑卒中主要可以分为缺血性脑卒中和出血性卒中两类，我国脑卒中主要以缺血性脑卒中为主，约占脑卒中总数的70％～80％。据全球疾病负担研究(GBD)数据显示，我国缺血性脑卒中的患病率由2010年的1100/10 万上升至2019年的1256/10万，出血性卒中的患病率由2010年的232/10 万下降至215/10万，脑卒中患病率总体呈上升趋势。另外，《中国卒中报告2019》显示我国每5位死者中至少有1人死于脑卒中，带病生存的脑卒中患者在我国已多达1300万。因此，如何有效地预防和控制脑卒中主要的类型(缺血性脑卒中)，寻找并发现更多缺血性脑卒中的潜在危险因素和干预靶点迫在眉睫。

利钠肽轴是机体应对外界环境刺激的重要的心脏内分泌调节系统，在维持机体水钠平衡、血压稳定和能量代谢平衡方面发挥着重要作用。利钠肽轴主要由心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)、C型钠尿肽(CNP)以及他们的受体构成。当血容量增加时，心肌细胞就会分泌并释放大量的无生物活性的心房钠尿肽前体(pro-ANP)和脑钠尿肽前体(pro-BNP)，pro-ANP、pro-NNP进一步活化为有活性的ANP和BNP，并与其受体结合激活利钠肽轴，进而促进水钠代谢、降低血容量、扩张血管、促进能量代谢，从而维持心血管稳态。作为利钠肽轴的重要组成之一，ANP可能在缺血性脑卒中的发生发展过程中扮演重要角色，已有大量流行病学证据支持这一假设，例如， ANP的编码基因NPPA的基因多态性与高血压、脑卒中、心肌梗死和冠心病的人群易感性显著相关；人工合成的ANP(重组卡培立肽、缬沙坦)已经被用来治疗急性心衰，但会引起低血压和血管性水肿等不良结局。可见，合成ANP作为药物可能存在较大隐患，更好的理解ANP参与缺血性脑卒中的作用机理将有助于针对ANP的药物研发，促进ANP的相关研究结果向临床转化。但是，尚未见关于NPPA基因DNA羟甲基化与缺血性脑卒中的研究报道，也没有报道一种合适的羟甲基化标志物可作为缺血性脑卒中的干预靶点。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过对NPPA基因DNA羟甲基化与缺血性脑卒中相关性的研究，提供了一种与缺血性脑卒中相关的DNA羟甲基化标志物，其羟甲基化程度指示缺血性脑卒中发病风险，有助于阐释心房利钠肽作用于缺血性脑卒中的分子机制，且羟甲基化水平每增加2倍，缺血性脑卒中的发病风险升高39％，检测灵敏度高。

本发明的第一个目的是提供一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物，该DNA羟甲基化标志物包括NPPA基因启动子区的DNA 羟甲基化位点Chr1:11908348，其羟甲基化程度指示缺血性脑卒中发病风险程度。

进一步地，DNA羟甲基化位点Chr1:11908348的羟甲基化水平高于 2.5％指示缺血性脑卒中发病风险较高。

进一步地，DNA羟甲基化位点Chr1:11908348的羟甲基化水平每增加 2倍，缺血性脑卒中的发病风险升高39％。

进一步地，扩增上述DNA羟甲基化标志物的上游引物如SEQ ID NO.1 所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，检测上述DNA羟甲基化标志物的羟甲基化水平包括以下步骤：

(1)提取DNA样本，用T4β-葡糖基转移酶和APOBEC3A酶处理DNA 样本；

(2)用合适的引物对(如上述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)扩增步骤(1)处理后的DNA样本，得到扩增产物；

(3)对步骤(2)的扩增产物进行转录和酶切，得到转录和酶切产物；

(4)对步骤(3)的转录和酶切产物进行检测，获取序列中Chr1:11908348 位点的羟甲基化程度。

进一步地，DNA样本为血液样本。

本发明的第二个目的是提供上述DNA羟甲基化标志物在制备预测缺血性脑卒中发病风险的试剂盒中的应用。

进一步地，试剂盒中还包括扩增NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348的引物。

进一步地，上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2 所示。

本发明的第三个目的是提供扩增上述DNA羟甲基化标志物的引物在制备预测缺血性脑卒中发病风险的试剂盒中的应用，上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ IDNO.2所示，具体地，

F：TTTTGTTTGAGGTTAGAGGTTTGTTTA

R：AAAAATCCTTAATTATCTCACCRCC，其中，R表示碱基A/G。

本发明的第四个目的是提供一种预测缺血性脑卒中发病风险的试剂盒，该试剂盒中包括：扩增NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1: 11908348的引物。

进一步地，试剂盒中还包括检测NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348羟甲基化水平的试剂。

本发明的第五个目的是提供上述DNA羟甲基化标志物在制备缺血性脑卒中治疗药物中的应用，以NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1: 11908348为靶点进行设计，抑制该靶点的羟甲基化水平。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供的NPPA基因DNA羟甲基化标志物可用于预测缺血性脑卒中的发病风险，也可以作为预防和控制缺血性脑卒中的干预靶点，该羟甲基化标志物的检测灵敏度明显优于现有的缺血性脑卒中的检测标志物，同时具有良好的准确度和特异性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明的DNA羟甲基化标志物的示意图；

图2为检测的NPPA基因启动子区域9个CpG位点的示意图，其中2 号位点为本发明的羟甲基化标志物；

图3为NPPA基因DNA羟甲基化水平与缺血性脑卒中发病风险的关系；

图4为NPPA基因Chr1:11908348DNA羟甲基化对缺血性脑卒中预测的 ROC曲线；

图5为传统危险因素加上NPPA基因Chr1:11908348DNA羟甲基化前后两个模型对缺血性脑卒中预测的比较示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

首先从患有缺血性脑卒中且有DNA生物样本的人群中随机选择1000 名作为病例，然后从正常且有DNA生物样本的健康社区人群中与病例按照基于年龄和性别的频数匹配选择1000名作为对照，最后符合条件纳入研究的共853名病例和918名对照。提取每一位研究对象的全血DNA标本，运用目标区域测序技术检测NPPA基因启动子区域各CpG位点羟甲基化水平，即利用ENSEMBL数据库查询人类NPPA基因(基因编号：ENSG00000175206) 的启动子区域，该区域为Chromosome 1:11908117-11908380(GRCh37.P13，距TSS:-540bp to-277bp)，在NCBI上截取该区域的核酸序列，将核酸序列导入EMBOSS Cpgplot软件预测CpG岛，然后运用Epidesigner程序对CpG 岛及CpG密集区域序列进行引物设计，挑选合适的引物进行DNA羟甲基化检测(引物序列信息见表1)。经过挑选，共获得9个CpG位点的羟甲基化水平，9个CpG位点如图2所示，分别为Chr1:11908353(CpG1)、 Chr1:11908348(CpG2)、Chr1:11908299(CpG3)、Chr1:11908200(CpG4)、 Chr1:11908182(CpG5)、Chr1:11908178(CpG6)、Chr1:11908168(CpG7)、 Chr1:11908165(CpG8)、Chr1:11908142(CpG9)。

表1 NPPA基因启动子区域DNA羟甲基化检测引物序列

DNA羟甲基化的具体检测方法为：

首先用DNA羟甲基化检测试剂盒对DNA标本依次进行T4β-葡萄糖基转移酶和APOBEC3A酶处理，以葡萄糖基标记样本DNA中的羟甲基化胞嘧啶，被标记了的羟甲基化胞嘧啶不会被APOBEC3A酶脱去氨基，而其余的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶则在APOBEC3A酶的作用下转化为胸腺嘧啶。接着用表1中的引物，以酶转化后的样品基因组为模板，进行多重PCR扩增。为区分不同样品，利用带有Index序列的引物，通过PCR扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列。最终，将所有样品Index PCR 扩增产物等量混合，在IlluminaHiseq/Miseq平台，以2×150bp/2×250bp 的双端测序模式进行高通量测序，获得FastQ数据。各CpG位点羟甲基化水平量化为该位点羟甲基化的reads数目(即检测到碱基C的reads数目)/ 该位点总的reads数目×100％。

研究结果如下：

1、研究对象的临床特征

表2表示研究对象的临床特征，发现与健康对照组相比，缺血性脑卒中患者具有更多的传统危险因素，例如高血压史、糖尿病史、肥胖、高血糖、高血脂等(所有P<0.05)。

表2研究对象的临床特征

2、能独立预测缺血性脑卒中发病风险的羟甲基化位点

通过构建Logistic回归模型分析NPPA基因DNA羟甲基化水平与缺血性脑卒中事件的关系，发现能够独立预测缺血性脑卒中发病风险的羟甲基化位点。结果如图3所示，调整传统危险因素及矫正多重检验后，仅有CpG2 与缺血性脑卒中发病风险显著相关(P＜0.05且q＜0.05)，该位点羟甲基化水平每增加2倍，缺血性脑卒中发病风险升高39％。

NPPA基因Chr1:11908348位点的DNA羟甲基化水平对缺血性脑卒中的预测效能如图4-5所示。图4为该位点羟甲基化水平与缺血性脑卒中的ROC 曲线图，AUC为0.53＞0.5，表示该位点羟甲基化具有一定预测缺血性脑卒中的能力。

进一步计算净重新分类指数NRI和综合判别指数IDI。NRI值为 0.2297(0.1226-0.3368)，IDI值为0.0066(0.0018-0.0114)，计算结果及图5均可表明该位点羟甲基化水平能增加传统危险因素对缺血性脑卒中的预测效能且具有统计学意义。同时，采用似然比检验评价构建的两个模型是否有统计学差异，P＝0.0005<0.05，差异具有统计学意义。

实施例2构建羟甲基化检测试剂盒

基于以上研究，可以得知：位于启动子区域的CpG2位点发生羟甲基化之后，可能促进NPPA基因表达和pro-ANP蛋白分泌，进而参与缺血性脑卒中的发病，可以作为缺血性脑卒中发病风险的预测标志物和潜在药物靶点。因此，本发明构建了基于这个CpG2位点的羟甲基化检测试剂盒。

具体检测方法为：

①全血DNA提取并质检

a.琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性：电泳条带清晰可见，无明显降解，且无RNA污染。

b.Nanodrop 2000检测基因组DNA质量：浓度≥20ng/μL，总量≥1μg， OD260/280＝1.7～2.0，OD260/230≥1.8。

②T4β-葡萄糖基转移酶和APOBEC3A酶处理

用DNA羟甲基化检测试剂盒对质检合格的DNA标本进行T4β-葡萄糖基转移酶和APOBEC3A酶处理，以葡萄糖基标记样本DNA中的羟甲基化胞嘧啶，被标记了的羟甲基化胞嘧啶不会被APOBEC3A酶脱去氨基，而其余的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶则在APOBEC3A酶的作用下转化为胸腺嘧啶。

③多重PCR扩增

接着用设计好的引物(F：TTTTGTTTGAGGTTAGAGGTTTGTTTA；R：AAAAATCCTTAATTATCTCACCRCC)对酶转化过的标本进行DNA扩增，得到带有T7 RNA聚合酶启动子序列的扩增产物。

④CpG片段切割

然后运用T7 RNA聚合酶将扩增的DNA产物转录为RNA片段，用 RNase A将所得的RNA片段切割成带有CpG的小片段。

⑤飞行质谱分析

最终，在每一个小的RNA片段内，胞嘧啶和甲基化的胞嘧啶最终产物为CpA，羟甲基化的胞嘧啶最终产物为CpG，使用Agena MassArray飞行质谱分析系统检测这个最终产物的分子量。

⑥羟甲基化水平计算和缺血性脑卒中风险预测

该CpG位点羟甲基化水平量化为产物质量CpG/(CpG+CpA)×100％，羟甲基化水平>2.5％提示缺血性脑卒中发病风险较高(见图4)，应密切关注并采取预防性治疗措施。CpG2位点甲基化模型对脑卒中发病诊断情况见表 3。

表3 CpG2位点甲基化模型对脑卒中发病诊断情况

基于以上研究可以得知，位于启动子区域的Chr1:11908348CpG位点发生羟甲基化之后，可能促进NPPA基因表达和pro-ANP蛋白分泌，进而参与缺血性脑卒中的发病，可以作为缺血性脑卒中发病风险的预测标志物和潜在药物靶点。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

ttttgtttga ggttagaggt ttgttta 27

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

aaaaatcctt aattatctca ccrcc 25