基于甲基化芯片及测序技术筛选缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物

摘要

背景和目的:
　　脑卒中(Stroke)是一种急性的脑血管疾病，是由于局部血液循环障碍所导致的神经功能缺损综合症，具有死亡率高、发病率高、致残率高的特点，是全世界第二大死亡原因，也是成年人致残的主要原因。
　　脑卒中按照病因可分为缺血性脑卒中（Ischemic Stroke，IS）和出血性脑卒中(Hemorrhagic Stroke，HS)，IS约占脑卒中总数的87％。在我国，脑血管疾病的死亡率和发病率显著高于心血管疾病，因此，脑卒中患者需要大量的社会关注和医疗资源投入，寻找防治缺血性脑卒中的生物标志物尤为迫切。
　　Ana M.Gómez-(U)riz的研究小组发现，在肥胖的缺血性脑卒中患者中，KCNQ1启动子区甲基化水平可作为诊断IS的生物标志物。周淑宇等人的研究发现，在缺血性卒中患者中CDKN2B甲基化水平能够影响主动脉弓的钙化程度。已有大量研究表明，许多疾病以及重要的生物过程受到表观遗传的调控。因此，从DNA甲基化的角度研究其对缺血性脑卒中的影响为我们提供了新的思路。DNA特定位点的甲基化修饰广泛存在于原核生物和真核生物中，能引起染色质的结构、DNA构象、DNA的稳定性及DNA与蛋白质的相互作用方式的改变，从而调控基因的表达，参与代谢途径调节。DNA的甲基化主要发生在基因启动子区CpG岛，其甲基化状态的确定可以通过DNA甲基化测序的方法来实现。
　　目前，从全基因组水平对IS的DNA甲基化水平进行研究未见有报道。因此，本课题应用Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip(850K芯片)及MethylTarget（目的区域甲基化水平测序），对IS患者与正常人外周血全基因组甲基化的差异水平进行分析，筛选IS患者DNA甲基化水平显著变化的基因，最终，利用生物信息学的方法进行数据分析和挖掘，以期寻找与IS发生、发展相关基因的DNA甲基化分子标志物。IS甲基化分子标志物的发现不仅有助于全面揭示IS发生的表观遗传分子机制，更重要的是可为IS的预防、诊断、个体化治疗及预后提供非常有价值的线索及可靠的科学依据。
　　材料与方法:
　　1.1 缺血性脑卒中患者的筛选
　　根据WHO发布的缺血性脑卒中的诊断标准，并排除其它疾病，自2017年3月至2017年10月，在河南中医药大学第一附属医院住院的缺血性脑卒中患者中，按照严格的纳入标准进行选取，其中:
　　第一步初筛人群包括:3例IS患者，分别是2例男性和1例女性，平均年龄为57岁。
　　第二步验证人群包括:60例IS患者，分别是36例男性和24例女性，平均年龄为55岁。
　　1.2 健康对照组的选取
　　随机收录与IS组同一时间段体检的受试者，其中:
　　第一步初筛人群包括:对照组为3例，分别是2例男性和1例女性，平均年龄53岁。
　　第二步验证人群包括:对照组为60例，分别是31例男性和29例女性，平均年龄58岁。
　　1.3 实验方法
　　1.3.1 利用Illumina850K DNA甲基化芯片对初筛的3例缺血性脑卒中患者和3例健康对照者的外周血液样本进行全基因组DNA甲基化位点检测。对比两组具有显著差异(p＜0.05)的甲基化位点，并利用数据库:京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)Pathway、GO分析(Gene Ontology Analysis，GO)进行生物信息学分析，选择与IS相关并有DNA甲基化表达差异的基因。
　　1.3.2 扩大样本量至60例IS样本与60例健康对照，进行MethylTarget（目的区域甲基化水平测序）以验证。
　　结果:
　　1.850K DNA甲基化芯片检测得到:622个有统计学意义的甲基化差异CpG位点，共涉及278个基因(Diffscore值小于-13或大于13;且Delta Beta大于0.17或小于-0.17，即为差异甲基化基因)。
　　2.DNA目的片段甲基化测序对19个候选基因(ABCA1，ADAMTSL5，COL9A2，ERCC5,TGFBI,ABCG1,ATP10A,CYP2E1,HOXA4,PCDHB7,ARL4C,KLF11,SULF2,ADARB2,GDF15,CDH15,CA MTA1,SMG6,RNF144b)验证后得到ABCA1，ADARB2，ATP10A，CAMTA1，CDH15，COL9A2，TGFB1共计7个基因，在病例和对照组之间的甲基化水平差异具有统计学意义。(P-value＜0.05(Ttest)&P-value＜0.05(Utest)&P-value＜0.05(Logistic))
　　3.目的片段甲基化测序结果显示:CAMTA1在IS患者组较健康对照组甲基化程度升高，而ABCA1，ADARB2，ATP10A，CDH15，COL9A2，TGFB1在IS患者组较健康对照组甲基化程度降低。
　　结论:
　　1.本课题应用全基因组甲基化芯片及目的区域甲基化水平测序，对IS患者与正常人外周血全基因组甲基化的差异水平进行分析，筛选出ABCA1，ADARB2，ATP10A，CDH15,COL9A2，TGFB1，CAMTA1共7个基因启动子区的CpG岛甲基化水平可能成为缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物。
　　2.通过生物信息学分析，ADARB2，ABCA1，ATP10A和TGFB1可能分别通过介导胆固醇转运、磷脂转运以及调节基因表达等功能成为缺血性脑卒中的保护因素。CDH15，COL9A2，CAMTA1可能通过介导细胞间粘附作用、参与胶原蛋白的合成与分解等功能而成为缺血性脑卒中的危险因素。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词表

前言

材料和方法

1 研究对象

1．1 IS病例组的选取

1．2 正常对照组选取

2 实验仪器及试剂

2．1 实验仪器

2．2 实验试剂

3 实验方法

3．1 外周血基因组DNA的提取与纯化

3．2 应用Illumina 850K甲基化芯片检测全基因组甲基化水平

3．3 使用MethylTarget目的区域甲基化测序对候选基因进行验证

4 生物信息学分析

结果

1 Illumina 850K甲基化芯片检测结果

1．2 芯片数据质控结果

1．3 芯片数据评价

1．4 差异CpG位点筛选

2 候选基因目的区域甲基化水平测序结果

2．1 目的区域甲基化水平测序数据

2．2 验证人群IS组和对照组甲基化水平的比较结果

2．3 候选基因与IS的磁联性分析结果

讨论

结论

参考文献

综述 基于甲基化芯片及测序技术筛选缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物

致谢

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