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Hot1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用

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本发明涉及真核基因表达的转录调控因子的应用，特别是涉及一种组成型启动子Pgap的转录调控因子Hot1p的应用。本发明公开了Hot1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用，所述Hot1p的氨基酸序列是由核苷酸序列为SEQ ID NO:1的Hot1基因所编码的；所述应用为通过在启动子Pgap后插入Hot1基因从而提高宿主细胞中蛋白的表达。本发明所述的应用能增强毕赤酵母组成型启动子Pgap启动子的转录，从而使其后的外源基因在毕赤酵母中高效表达，而且可以避免多拷贝或者多基因表达时，使用同一启动子产生的稀释效应，导致不同基因表达量差异过大。

著录项

公开/公告号CN114773441A

专利类型发明专利
公开/公告日2022-07-22

原文格式PDF
申请/专利权人暨南大学;
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申请/专利号CN202210354712.8
发明设计人姚冬生;林香娜;刘大岭;谢春芳;丁伟秋;
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申请日2022-04-06
分类号C07K14/39;C07K14/395;C07K14/40;C12N15/81;C12N15/67;C12N15/113;C12N1/19;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/72;
代理机构广州三环专利商标代理有限公司;
代理人刘宇峰
地址 510632 广东省广州市天河区黄埔大道西601号
入库时间 2023-06-19 16:04:54

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2022-07-22

公开

发明专利申请公布

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物工程学领域，涉及真核基因表达的转录调控因子的应用，特别是涉及一种组成型启动子Pgap的转录调控因子Hot1p的应用。

背景技术

启动子是调控基因表达的最重要元件之一，P

甲醇诱导毕赤酵母表达系统是目前用于表达大多数异源蛋白常用的表达系统，然而并不是所有的外源蛋白均适合甲醇诱导表达而且甲醇在大规模生产时存在极大的安全隐患。相对甲醇诱导，组成型毕赤酵母表达系统表达异源蛋白时不使用甲醇诱导，但是大多数的组成型启动子强度相对较弱，无法获得较高的蛋白产量，致使其在应用上受限制。

针对甲醇诱导的弊端，近年来对毕赤酵母表达系统的优化改造成为了研究热点。在启动子的改造研究上，目前主要是通过各种方法构建新的启动子文库。其中，有不少研究通过在P

在毕赤酵母中Hot1p(序列号：NC_012963.1，推定为：PAS_chr 1-1_1049)属于Gcr1_c保守蛋白结构域，该家族能够激活糖酵解酶的转录。该基因与酿酒酵母中的Gcr1基因同源。在酿酒酵母中Gcr1p是甘油生物合成基因的转录调控因子，响应于高渗透压。根据文献报道，关于该基因的研究主要是在酿酒酵母上，如有报道称Gcr1p(Gcr1蛋白)能与TPI1启动子结合，它参与糖酵解基因的正向调控，它的缺失会导致酿酒酵母表现出生长缺陷，肌醇水平缺陷，液泡结构异常和自噬减少。另有研究表明Gcr1的过表达能提高细胞的生长和葡萄糖的摄取。而目前尚未有报道提及其对Pgap的转录调控。

发明内容

本发明的主要目的是针对宿主细胞中异源蛋白表达存在的问题和不足，提供了一种调控宿主细胞中异源蛋白表达的转录因子Hot1基因，能增强毕赤酵母组成型启动子Pgap启动子的转录，从而使其后的外源基因在毕赤酵母中高效表达。

本发明的第一个方面，提供了Hot1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用，所述Hot1p的氨基酸序列是由核苷酸序列为SEQ ID NO:1的Hot1基因所编码的；所述应用为通过在启动子Pgap后插入Hot1基因从而提高宿主细胞中蛋白的表达。

根据本发明所述的应用，所述宿主细胞是选自：毕赤酵母、酿酒酵母、产甘油假丝酵母。

根据已有文献报道，毕赤酵母、酿酒酵母、产甘油假丝酵母等均可以接受以Pgap为启动子的酵母表达载体，用以表达异源蛋白，因此可作为本发明的宿主细胞。

本发明的第二个方面，提供了一种调控宿主细胞中异源蛋白表达的基因表达盒，以Pgap为启动子并插入Hot1基因。

本发明的第三个方面，提供了一种载体，其含有本发明所述的基因表达盒。

本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，其含有本发明所述的基因表达盒，或者含有本发明所述的载体。

本发明的第五个方面，提供了一种增强宿主细胞中蛋白表达的方法，包括：提供如本发明所述的宿主细胞，在合适所述异源蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，从培养基中分离所表达的蛋白。

本发明通过实验揭示了：在Hot1基因在以Pgap为启动子的异源蛋白合成通路中起到转录激活作用，该序列翻译后形成转录因子Hot1p参与Pgap启动子的正向调控，从而提高外源基因的表达效率，而且可以避免多拷贝或者多基因表达时，使用同一启动子产生的稀释效应，导致不同基因表达量差异过大。

本发明因此可以构建一种以Pgap为启动子并插入Hot1基因的基因表达盒，Hot1p转录激活因子能够增强毕赤酵母组成型启动子Pgap启动子的转录从而使基因表达盒中的外源基因在毕赤酵母(或其他可以接受以Pgap为启动子的酵母)中高效表达，可以显著提高外源基因的表达强度。

附图说明

图1是ppic3.5k-Pgap-Hot1质粒图谱。

图2是菌株(毕赤酵母)表达木聚糖酶xynB的增长率，图中对照组为未共表达菌株；克隆1至克隆5为Hot1基因共表达菌株。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本文中，Hot1p表示Hot1表达的蛋白。

实施例1：转录调控因子Hot1p表达盒的构建

1、Pgap启动子的扩增

本发明以毕赤酵母的Pgap序列作为参考，采用软件DNAMAN 8设计并合成两条寡核苷酸引物，通过PCR法扩增Pgap目的基因。

两条PCR引物如下：

1-F:ACTTAC

1-R:ACTTACGC

下划线碱基分别为SacI、BamHI限制性内切酶酶切位点。

PCR反应体系如下表1。

表1：

PCR程序设定见表2。

表2：

PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，得到大约480bp的片段。

2、ppic3.5k-Pgap载体的构建

将ppic3.5K质粒与Pgap启动子PCR产物分别用限制性内切酶SacI、BamHI于37℃酶切20min，酶切条件如下表3。

表3：

酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接，连接体系如下表4。

表4：

用连接酶16℃连接12h，连接产物转化DH5a感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用BamHI和SacI双酶切后跑电泳结果显示有8.2kb和483bp两条带，表明连接成功，通过DNA测序，确定为Pgap基因。

3、转录调控因子Hot1基因的扩增和测序

本发明以毕赤酵母基因组中序列为SEQ ID NO:2的同义突变基因作为参考，采用软件DNAMAN 8设计并合成4条寡核苷酸引物，通过Overlap PCR法扩增转录调控因子Hot1基因(SEQ ID NO:1)。

2-F：ACTTACCG

2-R:CCTGTAGGGGGCTCAATTCCACCGAATCCATTTGAC(SEQ ID NO:7)

3-F:CGGTGGAATTGAGCCCCCTACAGGGTATTCGATTGTGT(SEQ ID NO:8)

3-R:ACTTATTT

下划线碱基分别为EcoR I、Not I限制性内切酶酶切位点。

先分别使用2-F/R和3-F/R将Hot1基因分成两个部分扩增，再用2-F/3-R将两个部分重叠延伸扩增。

PCR反应体系与PCR程序设定如上述。

Overlap PCR扩增反应体系如表5。

表5：

注：片段1：片段2摩尔质量比为1:1

PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，得到大约1.2kb的片段(SEQ ID NO:1)。

4、ppic3.5k-Pgap-Hot1表达盒的连接

将ppic3.5K-Pgap质粒(SEQ ID NO:3)与转录调控因子Hot1基因PCR产物(SEQ IDNO:1)分别用限制性内切酶EcoR I、NotI I内切酶双酶切并纯化回收获得。

ppic3.5K-Pgap质粒与转录调控因子Hot1基因PCR产物连接方法同步骤2所示，用BamHI和SacI双酶切后跑电泳结果显示有8.7kb和1.2kb两条带，表明连接成功，通过DNA测序，确定为转录调控因子Hot1基因。

由此转录调控因子Hot1p表达盒构建成功(如图1所示)。

实施例2：Hot1基因整合毕赤酵母基因组

为了提高单考贝表达盒在毕赤酵母染色体上的整合效率，用限制性内切酶Sal I将表达盒线性化并用试剂盒纯化回收。本实验的受体菌为毕赤酵母SMD1168(已含在Pgap之后插入木聚糖酶xynB基因的重组菌，EX6)，电转化后使用含0.3mg/mL的G418平板进行筛选，并提基因组PCR鉴定。

通过PCR产物测序结果显示筛选到的菌株为共表达Hot1p的阳性克隆。

实施例3：Hot1p增强组成型启动子Pgap所驱动的异源蛋白表达测定

将实施例1筛选到的阳性克隆1和实施例2筛选到的阳性克隆2进行发酵，发酵条件为28℃，200rpm，培养72h。同时以含有xynB基因的毕赤酵母(EX6)作为对照，培养72h后取上清进行SDS-PAGE电泳检测，分析木聚糖酶xynB表达水平。

过表达Hot1p转录因子后所挑取的克隆1相比于对照组的表达量提高了99％，克隆2相比于对照组的表达量提高了101％，克隆3相比于对照组的表达量提高了244％，克隆4相比于对照组的表达量提高了129％，克隆5相比于对照组的表达量提高了180％。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> Hot1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1209

<212> DNA

<213> 毕赤酵母

<400> 1

atgaatgcat ctagtatcca aagaaaaaac ccataccaaa gcaaacaaac agcctattta 60

aattggtgtc acaatgaggg gaagaaattc attccaggtc cgcccaaatt gcgtgagatc 120

gttacgccaa agagactctt cctgttcctg aaaactcata ttgaacccgc caaagtacga 180

gaaatccccc tctcgtttgc atccttcgat gcatatgtga gcgctatcgt agacttatat 240

cataggcaac gtactgagtt caaagttaga cctgtattag acgatccaaa cgagcctgat 300

gcggattggg tgacaccaag agacgacaga gttaaagagt atttgaagca gatcaagaaa 360

gagagacaga acgtacatcg cgtgactcaa tcgcatgaga tggcccaaga aagaacggtt 420

accccaacat caactaactc ttcaaatatg ctgataccca ctacgttcac aggaaacagc 480

gacccatccc tgctgtcaaa tgaattcggt ggaattgagc cccctacagg gtattcgatt 540

gtgtctagcc aaggattgag gggttcctcc agcagtacat cttcttctgg aaccgatatt 600

tcatatctca accagcaatt agctaaaaca aatgataagg ttaacagatt atccatggat 660

gttcaacagt taaaagaatt gctgactaat accaacaaca aggtgacaca gatcgtggaa 720

atgctcactt tagtgtctaa agcaggacaa gttggagctc accgaacacc ttcgcaatct 780

gagccagtct ctaattcaat ggaacctcca caacctgcaa acggtcaata tggcattgct 840

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