一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法

摘要

本发明适用于细菌检测领域，提供了一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，包括以下步骤：步骤S1：血培养阳性瓶中细菌的分离；步骤S2：细菌特异性目的序列的获取，包括以下步骤：细菌DNA的提纯；细菌16SrDNA基因序列比对；引物设计与合成；PCR扩增目的序列；回收目的序列；步骤S3：变性梯度凝胶电泳鉴定细菌，包括以下步骤：试剂配制；DGGE变性胶的配方；梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳。本发明基于DGGE技术，加入变性剂(尿素和甲酰胺)，能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开，比常规使用的细菌鉴定方法提前两天得到结果，节省鉴定时间，降低检测成本，为临床早期治疗提供科学研究。

说明书

技术领域

本发明属于细菌检测领域，尤其涉及一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法。

背景技术

目前临床进行细菌鉴定主要应用质谱技术，前期需要在血培养阳性瓶中震荡培养大量扩增细菌，同时还需涂板分离，才能进行质谱鉴定，中间耗费时间较长，成本也较高。

本申请通过DGGE对血培养阳性瓶中细菌进行菌种鉴定，旨在节省细菌鉴定时间，降低检测成本，为临床早期治疗提供科学研究。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，包括以下步骤：

步骤S1：血培养阳性瓶中细菌的分离；

步骤S2：细菌特异性目的序列的获取，包括以下步骤：细菌DNA的提纯；细菌16SrDNA基因序列比对；引物设计与合成；PCR扩增目的序列；回收目的序列；

步骤S3：变性梯度凝胶电泳鉴定细菌，包括以下步骤：试剂配制；DGGE变性胶的配方；梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳。

进一步的，所述步骤S1中，血培养阳性瓶中细菌的分离包括以下步骤：

(1)将阳性血培养瓶反复轻微震荡，使瓶中液体混匀，取一次性注射器从瓶中抽取培养液涂于一次性玻片上，使其形成厚薄均匀的液体薄膜，晾干后用革兰染液染色，确定有细菌生长的为阳性标本，排除假阳性；

(2)用75％无菌酒精消毒血培养瓶瓶口后，将血培养瓶轻微摇匀，用无菌注射器吸取5mL培养液，并注入到分离胶采血管内，室温下3000r/min离心2min，通过离心将碳粉及大部分红细胞分离到分离胶下层，将细菌离心至分离胶上层沉淀及上清液中，将离心后的上清液转移至EP管；

(3)将EP管以5000r/min的转速离心5min，弃去EP管汇中的上清液，再加入200uL生理盐水于EP管中，混匀，以8000r/min的转速离心5min，最后弃去上清液，得到沉淀物备用。

进一步的，所述步骤S2中，细菌16SrDNA基因序列比对的具体步骤为：

从NCBI上查找细菌16SrDNA基因序列并下载，利用SnapGene软件进行基因序列比对，找到细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域。

进一步的，所述步骤S2中，引物设计与合成的具体步骤为：

在细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域的两端设计引物，利用Oligo6.44软件进行引物分析，在V3引物For5’端加入一个高熔点的40bpGC夹，引物序列为：

V3-357F：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；

V3-518R：ATTACCGCGGCTGCTGG。

进一步的，所述步骤S2中，PCR扩增目的序列的具体步骤为：

PCR扩增16SrDNAV3片段，引物使用V3-357F，V3-518R，利用Taq酶扩增目的片段。

进一步的，所述步骤S2中，回收目的序列的具体步骤为：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，把目的条带切胶回收，利用DNA回收试剂盒进行DNA回收。

进一步的，所述步骤S3中，试剂配制包括以下步骤：

(1)50×TAE：称取37.2gEDTA·Na

(2)40％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺：称取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉丙烯酰胺溶于100mLddH

(3)50％尿素溶液：称取10g尿素溶于20mlRO水中，42℃水浴加热至固体完全溶解，即为50％尿素溶液；

(4)DGGE固定液：50mL冰醋酸与450mLddH

(5)DGGE染色液：称取0.4gAgNO

(6)DGGE显色液：称取5gNaOH溶于500mLddH

进一步的，所述步骤S3中，梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳包括以下步骤：

(1)将两块玻璃对齐放入电泳支架上，旋紧固定螺丝并夹好夹子，注入去离子水，检测是否漏水后倒出去离子水；

(2)配制高变性剂浓度凝胶溶液和低变性剂浓度凝胶溶液，在灌胶前加入适量的10％过硫酸铵溶液和TEMED作为聚合引发剂和催化剂并充分混匀，关闭梯度混合仪的两个阀门，将高浓度变性剂凝胶溶液加入梯度混合仪靠近出口的一端，将低浓度变性剂凝胶溶液加入另一端，并打开磁力搅拌器；

(3)先打开梯度混合仪出口端阀门，待液流稳定无气泡时将针头插入两块玻璃缝隙中部，接着打开梯度混合仪中间阀门开始灌胶；

(4)待凝胶灌至距上端1.5cm处时停止灌胶，加入1mL去离子水液封胶面，待凝胶聚合后，配制不含变性剂的0％凝胶，用移液器灌胶，插好梳子，待凝胶完全聚合；

(5)电泳缓冲液为10L1×TAE缓冲液，提前向电泳槽中加入9L缓冲液，提前2h预热至60℃，待上层胶凝固后，将胶板整个放入电泳槽，胶板上层中央补满缓冲液，拔出梳子，以电压100V预电泳30min后，用进样针上样，100V电泳30min后将电压改为80V，电泳15h；

(6)电泳结束后，拿出电泳架取出玻璃，将一侧玻璃揭去取出凝胶，用SuperGelBlue染色30min后，置于凝胶成像仪中拍照。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

该变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，基于DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来；本发明应用DGGE对血培养阳性瓶中细菌进行菌种鉴定，可比目前常规使用的细菌鉴定方法提前两天得到结果，节省鉴定时间，降低检测成本，为临床早期治疗提供科学研究。

附图说明

图1为PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为变性梯度凝胶电泳结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

本发明一个实施例提供的一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，包括以下步骤：

步骤S1：血培养阳性瓶中细菌的分离；

步骤S2：细菌特异性目的序列的获取，包括以下步骤：细菌DNA的提纯；细菌16SrDNA基因序列比对；引物设计与合成；PCR扩增目的序列；回收目的序列；

步骤S3：变性梯度凝胶电泳鉴定细菌，包括以下步骤：试剂配制；DGGE变性胶的配方；梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳。

在本发明实施例中，本发明基于DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来；本发明应用DGGE对血培养阳性瓶中细菌进行菌种鉴定，可比目前常规使用的细菌鉴定方法提前两天得到结果，节省鉴定时间，降低检测成本，为临床早期治疗提供科学研究。

作为本发明的一种优选实施例，所述步骤S1中，血培养阳性瓶中细菌的分离包括以下步骤：

(1)将阳性血培养瓶反复轻微震荡，使瓶中液体混匀，取一次性注射器从瓶中抽取培养液涂于一次性玻片上，使其形成厚薄均匀的液体薄膜，晾干后用革兰染液染色，确定有细菌生长的为阳性标本，排除假阳性；

(2)用75％无菌酒精消毒血培养瓶瓶口后，将血培养瓶轻微摇匀，用无菌注射器吸取5mL培养液，并注入到分离胶采血管内，室温下3000r/min离心2min，通过离心将碳粉及大部分红细胞分离到分离胶下层，将细菌离心至分离胶上层沉淀及上清液中，将离心后的上清液转移至EP管；

(3)将EP管以5000r/min的转速离心5min，弃去EP管汇中的上清液，再加入200uL生理盐水于EP管中，混匀，以8000r/min的转速离心5min，最后弃去上清液，得到沉淀物备用。

在本发明实施例中，从临床收集来的血液培养标本在LIS系统中进行登记和入库。在采集标本过程中应当严格按照《全国临床检验操作规程》进行操作；利用BDBactecTMFX400血培养仪进行临床血液标本培养；拟收集吉林大学中日联谊医院2019年1月到2020年12月阳性标本500例用于实验；标本采集已通过医学机构伦理认证，入组患者填写知情同意书。

作为本发明的一种优选实施例，所述步骤S2中，细菌16SrDNA基因序列比对的具体步骤为：

从NCBI上查找细菌16SrDNA基因序列并下载，利用SnapGene软件进行基因序列比对，找到细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域。

在本发明实施例中，优选的，步骤S2中，细菌DNA的提纯的具体步骤为：利用快速DNA提取检测试剂盒进行DNA提取，按照试剂盒说明书严格操作。

作为本发明的一种优选实施例，所述步骤S2中，引物设计与合成的具体步骤为：

在细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域的两端设计引物，利用Oligo6.44软件进行引物分析，在V3引物For5’端加入一个高熔点的40bpGC夹，引物序列为：

V3-357F：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；

V3-518R：ATTACCGCGGCTGCTGG。

在本发明实施例中，优选的，在细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域的两端设计引物，利用Oligo6.44软件进行引物分析。由于DGGE成功依赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移的改变，为避免在高Tm的变性剂浓度位置，一些DNA片段发生全部解链，导致无法检测出存在于高TmDNA片段中的碱基替换，在V3引物For5’端加入一个高熔点的40bpGC夹。

作为本发明的一种优选实施例，所述步骤S2中，PCR扩增目的序列的具体步骤为：

PCR扩增16SrDNAV3片段，引物使用V3-357F，V3-518R，利用Taq酶扩增目的片段。

在本发明实施例中，引物使用V3-357F，V3-518R，利用Taq酶扩增目的片段。

作为本发明的一种优选实施例，所述步骤S2中，回收目的序列的具体步骤为：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，把目的条带切胶回收，利用DNA回收试剂盒进行DNA回收。

在本发明实施例中，优选的，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，把目的条带切胶回收，利用DNA回收试剂盒进行DNA回收，按照试剂盒说明书严格操作。

作为本发明的一种优选实施例，所述步骤S3中，试剂配制包括以下步骤：

(1)50×TAE：称取37.2gEDTA·Na

(2)40％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺：称取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉丙烯酰胺溶于100mLddH

(3)50％尿素溶液：称取10g尿素溶于20mlRO水中，42℃水浴加热至固体完全溶解，即为50％尿素溶液；

(4)DGGE固定液：50mL冰醋酸与450mLddH

(5)DGGE染色液：称取0.4gAgNO

(6)DGGE显色液：称取5gNaOH溶于500mLddH

在本发明实施例中，优选的，50×TAE室温保存待用；DGGE染色液避光保存待用；DGGE显色液室温保存待用。

作为本发明的一种优选实施例，所述步骤S3中，梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳包括以下步骤：

(1)将两块玻璃对齐放入电泳支架上，旋紧固定螺丝并夹好夹子，注入去离子水，检测是否漏水后倒出去离子水；

(2)配制高变性剂浓度凝胶溶液和低变性剂浓度凝胶溶液，在灌胶前加入适量的10％过硫酸铵溶液和TEMED作为聚合引发剂和催化剂并充分混匀，关闭梯度混合仪的两个阀门，将高浓度变性剂凝胶溶液加入梯度混合仪靠近出口的一端，将低浓度变性剂凝胶溶液加入另一端，并打开磁力搅拌器；

(3)先打开梯度混合仪出口端阀门，待液流稳定无气泡时将针头插入两块玻璃缝隙中部，接着打开梯度混合仪中间阀门开始灌胶；

(4)待凝胶灌至距上端1.5cm处时停止灌胶，加入1mL去离子水液封胶面，待凝胶聚合后，配制不含变性剂的0％凝胶，用移液器灌胶，插好梳子，待凝胶完全聚合；

(5)电泳缓冲液为10L1×TAE缓冲液，提前向电泳槽中加入9L缓冲液，提前2h预热至60℃，待上层胶凝固后，将胶板整个放入电泳槽，胶板上层中央补满缓冲液，拔出梳子，以电压100V预电泳30min后，用进样针上样，100V电泳30min后将电压改为80V，电泳15h；

(6)电泳结束后，拿出电泳架取出玻璃，将一侧玻璃揭去取出凝胶，用SuperGelBlue染色30min后，置于凝胶成像仪中拍照。

在本发明实施例中，优选的，步骤S3中，DGGE变性胶的配方包括DGGE变性胶的配置和凝胶浓度与相对应的最佳分离片断长度，具体参见表1和表2：

表1 DGGE变性胶的配置

表2凝胶浓度与相对应的最佳分离片断长度

实验结果：

本实验选取了6种常见的细菌：屎肠球菌(efa)，粪肠球菌(efm)，鲍曼不动杆菌(aba)，阴沟肠杆菌(ecl)，大肠埃希菌(eco)，肺炎克雷伯菌(Kox)。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果参见图1，变性梯度凝胶电泳结果参见图2。

本发明的工作原理是：

该变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，基于DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来；DGGE的凝胶具有变性剂浓度梯度，可以根据DNA片段的退火温度分辨不同片段，分辨率可以达到一个碱基；DGGE有精密控温系统，比一般聚丙烯酰胺凝胶电泳具有更高的可重复性；DGGE可以对样品DNA的PCR产物进行分离进而克隆测序；DGGE几乎可以检出细菌目的片段的所有突变；可将不同菌株突变分子区分开用于进一步的分析；实验过程中无须对引物标记；可检测出象甲基化之类的DNA修饰；本发明应用DGGE对血培养阳性瓶中细菌进行菌种鉴定，可比目前常规使用的细菌鉴定方法提前两天得到结果，节省鉴定时间，降低检测成本，为临床早期治疗提供科学研究。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> V3-357F(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagcag 57

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> V3-518R(Artificial Sequence)

<400> 4

attaccgcgg ctgctgg 17