用于治疗C型尼曼-匹克病的腺相关病毒载体

摘要

本文提供了用于治疗、预防和/或治愈NPC1的基因疗法组合物和方法。更具体地，本公开文本提供了用于递送核酸的腺相关病毒(AAV)载体以及用于治疗、预防和/或治愈NPC1的核酸(包含AAV转移盒)。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年9月24日提交的美国临时申请号63/082,899、2020年9月23日提交的美国临时申请号63/082,425、2019年10月18日提交的美国临时申请号62/923,253和2019年10月17日提交的美国临时申请号62/916,749的优先权，将其每一个通过引用以其整体并入本文。

电子提交的文本文件的说明

将以电子方式随同提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：STRD_021_02WO_SeqList_ST25.txt；记录日期2020年10月14日；文件大小约425千字节)。

技术领域

本申请涉及重组腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，所述重组AAV载体逃避中和抗体而不降低转导效率。

背景技术

C1型尼曼-匹克病(Niemann-Pick Disease)(NPC1)是一种以内溶酶体隔室中胆固醇积聚为特征的神经变性障碍。它是由编码NPC1(一种介导细胞内胆固醇运输的内溶酶体蛋白)的基因的突变引起的。

NPC1可能存在于婴儿、儿童或成人中。新生儿可能出现腹水和由肝脏浸润引起的严重肝脏疾病和/或由肺部浸润引起的呼吸衰竭。没有肝脏或肺部疾病的其他婴儿具有张力减退和发育迟缓。典型表现发生在中晚儿童期，伴有隐匿性共济失调发作、垂直核上凝视麻痹(VSGP)、和痴呆。肌张力障碍和癫痫是常见的。构音障碍和吞咽困难最终变得残疾，使口服喂养成为不可能的；通常在吸入性肺炎的第二或第三个十年的晚期中发生死亡。成人更有可能出现痴呆或精神症状。

在NPC1动物模型中，2-羟丙基-β-环糊精(HPBCD)已显示会减少胆固醇和脂质的积聚并且延长存活期。然而，没有被食品药品监督管理局(FDA)批准用于NPC1的疗法。因此，迫切需要用于治疗、治愈和/或预防NPC1的组合物和方法。

发明内容

本文提供了用于治疗、预防和/或治愈NPC1的基因疗法组合物和方法。更具体地，本公开文本提供了腺相关病毒(AAV)载体和用于治疗、预防和/或治愈NPC1的核酸(包括包含AAV转移盒的核酸)。

在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180；以及(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的核酸；其中所述核酸包含转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。

在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180或相对于SEQ ID NO:180包含约1至约25个氨基酸突变的序列；以及(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的核酸；其中所述核酸包含转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。

在一些实施方案中，所述转移盒包含内含子序列。在一些实施方案中，所述内含子序列包含序列SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，所述内含子序列可以位于启动子与转基因之间。

在一些实施方案中，所述5’ITR包含序列SEQ ID NO:3003。在一些实施方案中，所述3’ITR包含序列SEQ ID NO:3004。

在一些实施方案中，所述启动子是CBA启动子。在一些实施方案中，所述启动子包含序列SEQ ID NO:3005。

在一些实施方案中，所述NPC1蛋白是人NPC1蛋白。在一些实施方案中，所述NPC1蛋白包含序列SEQ ID NO:3001。在一些实施方案中，所述转基因包含序列SEQ ID NO:3002。

在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号包含序列SEQ ID NO:3012。

在一些实施方案中，所述转移盒包含增强子。

在一些实施方案中，所述转移盒包含序列SEQ ID NO:3014。在一些实施方案中，所述转移盒包含序列SEQ ID NO:3015-3019中的任一个。

本文还提供了包含本公开文本AAV载体的组合物。本文还提供了包含本公开文本AAV载体的细胞。

本文还提供了用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开文本的AAV载体、核酸、组合物或细胞。在一些实施方案中，所述受试者患有C型尼曼-匹克病。在一些实施方案中，所述受试者是人类受试者。

下面更详细地描述了这些和其他实施方案。

附图说明

图1A-1C.示出了新抗原足迹的文库多样性、定向进化和富集的分析的气泡图。使用Illumina MiSeq平台对亲本文库(图1A)以及来自第一轮(图1B)和第二轮(图1C)进化的进化文库进行高通量测序。在用自定义Perl脚本进行分析后，绘制富集的氨基酸序列。每个气泡表示不同的衣壳蛋白亚基氨基酸序列，其中气泡的半径与相应文库中变体的读数的数量成比例。y轴表示来自测序运行的总读数的百分比。为了易于可视化，数据沿x轴分布。独特克隆的百分比减少(96.5％)直接证明在第一轮和第二轮进化后去除了许多“不合适的”序列。选择主要分离株用于进一步分析。

图2.与野生型AAV9相比，包含含有衣壳蛋白亚基变体STRD.101和STRD.102的蛋白衣壳的AAV载体的体积产率。条表示平均值+/-95％置信区间。

图3.使用标准TCID50测定确定的AAV-STRD.101和野生型AAV9的感染性值。数据绘制为产生一个感染单位所需的颗粒数量(P:I比)的自然对数。误差条表示标准偏差。

图4A-4D.与类似地包装萤光素酶序列的野生型AAV9载体相比，包含STRD.101衣壳蛋白亚基并包装萤光素酶转基因的重组AAV载体对U87细胞(图4A)、N2A细胞(图4B)、Sy5Y细胞(图4C)和U2OS细胞(图4D)的转导。误差条表示标准误差。

图5.示出了在用4％PFA固定后24小时冠状振动切片机切片中的tdTomato表达的代表性荧光显微术图像。每个切片的厚度为25μm。上图示出了使用4X物镜用天然tdTomato荧光获得的图像。下图示出了使用10X物镜用天然tdTomato荧光获得的图像。

图6.示出了在用4％PFA固定后24小时冠状振动切片机切片中的tdTomato表达的代表性免疫组织化学图像。每个切片的厚度为25μm。

图7.示出了在用4％PFA固定后24小时振动切片机肝脏切片中的TdTomato表达的代表性荧光显微术图像。每个切片的厚度为25μm。图示出了用DAPI复染剂的天然tdTomato荧光。

图8.示出了在用4％PFA固定后24小时振动切片机心脏切片中的TdTomato表达的代表性荧光显微术图像。每个切片的厚度为50μm。图示出了用DAPI复染剂的天然tdTomato荧光。

图9.重组AAV在非人类灵长类动物中的生物分布。水平线示出了检测限。

图10A是示出了溶酶体表型的图，如通过测量野生型U2OS细胞、NPC1缺陷型(NPC1

图10B是示出了胆固醇积聚的图，如在野生型U2OS细胞、NPC1缺陷型(NPC1

图11是卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)存活曲线，示出了经眶后注射盐水或AAV9-hNPC1后NPC1

图12示出了野生型小鼠、盐水处理的NPC1

图13示出了野生型小鼠、盐水处理的NPC1

具体实施方式

本文提供了逃避抗体识别和/或选择性靶向CNS组织的重组AAV载体。这些AAV载体可用于治疗、预防和/或治愈诸如NPC1的疾病。

AAV可用作基因递送剂，并且是用于人基因疗法的有力工具。使用AAV，可以在体内和体外的多种细胞中均实现高频率DNA递送和稳定表达。与其他一些病毒载体系统不同，AAV不需要活跃的细胞分裂来稳定整合到靶细胞中。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文具体描述中所使的术语仅用于描述特定实施方案的目的并且不旨在限制。

出于所有目的将本文提及的所有出版物、专利申请、专利、GenBank或其他登录号和其他参考文献都通过引用以其整体并入。

在本公开文本和所附权利要求中，AAV衣壳蛋白亚基中氨基酸位置的指定是关于VP1编号的。本领域技术人员应理解，如果将本文所述的修饰插入AAV cap基因中，则可能导致VP1、VP2和/或VP3区的修饰。可替代地，VP1、VP2和/或VP3可以独立表达以实现仅在这些区域中的一个或两个(VP1、VP2、VP3、VP1+VP2、VP1+VP3或VP2+VP3)中的修饰。

定义

以下术语用于本文的说明书和所附权利要求中。

单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

此外，如本文所用的术语“约”当指诸如多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等可测量值时意在涵盖指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。

同样如本文所用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关列示项目的任何和所有可能组合，以及在替代方案(“或”)中解释时组合的缺少。

除非上下文另有指示，否则具体地旨在可以以任何组合使用本文所述的各种特征。此外，在一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。为了进一步说明，例如，如果说明书表明特定氨基酸可以选自A、G、I、L和/或V，则这种语言还表明氨基酸可以选自这些氨基酸的任何子集，例如A、G、I或L；A、G、I或V；A或G；仅L；等，就好像每个这样的子组合都在本文中明确阐述一样。此外，这样的语言还表明可以否绝一种或多种特定氨基酸。例如，在一些实施方案中，氨基酸不是A、G或I；不是A；不是G或V；等，就好像每个这样的可能的否绝声明都在本文中明确阐述。

如本文所用，术语“减少(reduce)”、“减少(reduces)”、“减少(reduction)”和类似术语意指减少至少约10％、约15％、约20％、约25％、约35％、约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或更多。

如本文所用，术语“增加(increase)”、“改善(improve)”、“增强(enhance)”、“增强(enhances)”、“增强(enhancement)”和类似术语指示增加至少约10％、约15％、约20％、约25％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或更多。

如本文所用的术语“细小病毒”涵盖细小病毒科(Parvoviridae)，包括自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括原细小病毒属(Protoparvovirus)、红细小病毒属(Erythroparvovirus)、博卡细小病毒属(Bocaparvovirus)和浓核病毒亚科(Densovirus)的成员。示例性自主细小病毒包括但不限于小鼠微小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、H1细小病毒、番鸭细小病毒、B19病毒和现在已知或后来发现的任何其他自主细小病毒。其他自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见例如，BERNARD N.FIELDS等人VIROLOGY,第2卷,第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers；Cotmore等人Archives of Virology DOI 10.1007/s00705-013-1914-I)。

如本文所用，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于1型AAV、2型AAV、3型(包括3A和3B型)AAV、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、rh32.33型AAV、rh8型AAV、rh10型AAV、rh74型AAV、hu.68型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、蛇AAV、松狮蜥AAV、AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAVPHP.B和现在已知或以后发现的任何其他AAV。参见例如，BERNARD N.FIELDS等人VIROLOGY,第2卷,第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers)。已经鉴定出许多AAV血清型和进化枝(参见例如，Gao等人,(2004)J.Virology 78:6381-6388；Moris等人,(2004)Virology33-:375-383；和表2)。AAV1-9、AAVrh.10和AAV11的示例性AAV衣壳蛋白亚基序列提供在SEQID NO:1-11中。

如本文所用，术语“嵌合AAV”是指包含蛋白衣壳的AAV，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基具有源自两种或更多种不同的AAV血清型的区域、结构域、单独氨基酸。在一些实施方案中，嵌合AAV包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基由源自第一AAV血清型的第一区域和源自第二AAV血清型的第二区域构成。在一些实施方案中，嵌合AAV包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基由源自第一AAV血清型的第一区域、源自第二AAV血清型的第二区域和源自第三AAV血清型的第三区域构成。在一些实施方案中，嵌合AAV可以包含源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和/或AAV12的区域、结构域、单独氨基酸。例如，嵌合AAV可以包含来自如下所示的第一和第二AAV血清型的区域、结构域和/或单独氨基酸(表1)，其中AAVX+Y指示包含源自AAVX和AAVY的序列的嵌合AAV：

通过在一个衣壳蛋白亚基中包含来自多种AAV血清型的单独氨基酸或区域，可以获得具有多种希望特性的衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基分别源自多种AAV血清型。

AAV和自主细小病毒的各种血清型的基因组序列以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳蛋白亚基的序列是本领域已知的。此类序列可以在文献或公共数据库诸如GenBank中找到。参见例如，GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579；将其公开内容通过引用并入本文，用于传授细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。还参见例如，Srivistava等人,(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人,(1998)JVirology 71:6823；Chiorini等人,(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人,(1999)J Virology 73:939；Xiao等人,(1999)J Virology 73:3994；Muramatsu等人,(1996)Virology 221:208；Shade等人,(1986)J.Virol.58:921；Gao等人,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等人,(2004)Virology 33:375-383；国际专利申请WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；和美国专利号6,156,303；将其公开内容通过引用并入本文，用于传授细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。还参见图2。自主细小病毒和AAV的蛋白衣壳结构更详细地描述在BERNARD N.FIELDS等人,VIROLOGY,第2卷,第69和70章(第4版,Lippincott-Raven Publishers)中。还参见，AAV2(Xie等人,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405-10)、AAV9(DiMattia等人,(2012)J.Virol.86:6947-6958)、AAV8(Nam等人,(2007)J.Virol.81:12260-12271)、AAV6(Ng等人,(2010)J.Virol.84:12945-12957)、AAV5(Govindasamy等人(2013)J.Virol.87,11187-11199)、AAV4(Govindasamy等人(2006)J.Virol.80:11556-11570)、AAV3B(Lerch等人,(2010)Virology403:26-36),BPV(Kailasan等人,(2015)J.Virol.89:2603-2614)和CPV(Xie等人,(1996)J.Mol.Biol.6:497-520和Tsao等人,(1991)Science 251:1456-64)的晶体结构的描述。

表2：AAV血清型和进化枝

可以使用病毒生产细胞系在培养物中生产重组AAV(rAAV)载体。术语“病毒生产细胞”、“病毒生产细胞系”或“病毒生产细胞”是指用于生产病毒载体的细胞。HEK293和239T细胞是常见的病毒生产细胞系。下表3列出了用于各种病毒载体的示例性病毒生产细胞系。rAAV的产生典型地需要细胞中存在三个要素：1)侧翼是AAV反向末端重复序列(ITR)序列的转基因，2)AAV rep和cap基因，以及3)辅助病毒蛋白序列。这三个要素可以提供在一个或多个质粒上并且转染或转导到细胞中。

表3：示例性病毒生产细胞系

“HEK293”是指最初源自组织培养物中生长的人胚胎肾细胞的细胞系。HEK293细胞系易于在培养基中生长并且通常用于病毒生产。如本文所用，“HEK293”还可以指一种或多种变体HEK293细胞系，即源自原始HEK293细胞系的细胞系，其另外包含一个或多个基因改变。针对一种或多种特定应用，已开发并且优化了许多变体HEK293系。例如，293T细胞系含有SV40大T抗原，所述抗原允许含有SV40复制起点的转染质粒的附加型复制，从而导致所希望的基因产物的表达增加。

“Sf9”是指一种昆虫细胞系，其为源自亲本草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系IPLB-Sf-21-AE的克隆分离株。Sf9细胞可以在不存在血清的情况下生长并且可以贴壁或悬浮培养。

“转染试剂”意指增强核酸转移到细胞中的组合物。本领域常用的一些转染试剂包括一种或多种与核酸和细胞表面结合的脂质(例如，Lipofectamine

如本文所用，术语“感染复数”或“MOI”是指与细胞接触的病毒粒子的数量。例如，可以使培养的细胞与AAV接触，其中MOI的范围为1x10

术语“自互补AAV”或“scAAV”是指包含核酸(即，DNA)的重组AAV载体，所述核酸形成自发退火的二聚体反向重复分子，导致与常规单链(ss)AAV基因组相比更早且更稳健的转基因表达。参见例如，McCarty,D.M.等人,Gene Therapy 8,1248-1254(2001)。与常规ssAAV不同，scAAV可以绕过第二链合成，即基因表达的限速步骤。此外，双链scAAV在病毒转导后不太容易发生DNA降解，从而增加稳定附加体的拷贝数量。值得注意地，scAAV可以典型地只保存约2.4kb的基因组，是常规AAV载体大小的一半。在一些实施方案中，本文所述的AAV载体是自互补AAV。

如本文所用，术语“肽”是指短氨基酸序列。术语肽可以用于指AAV衣壳蛋白亚基氨基酸序列的部分或区域。肽可以是天然存在于天然AAV衣壳蛋白中的肽或非天然存在于天然AAV衣壳蛋白中的肽。AAV衣壳蛋白中天然存在的AAV肽可以被非天然存在的肽取代。例如，可以将非天然存在的肽取代到AAV衣壳蛋白中以提供经修饰的衣壳蛋白，使得天然存在的肽被非天然存在的肽替代。

如本文所用，术语“嗜性”是指病毒优先进入某些细胞或组织，任选地随后表达(例如，转录和任选地翻译)细胞中病毒基因组携带的一个或多个序列，例如，对于重组病毒而言表达目的转基因。

如本文所用，“全身嗜性”和“全身转导”(和等效术语)表明如本文所述的病毒载体或病毒样颗粒分别展现出对遍及全身的组织(例如，脑、肺、骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏和/或胰腺)的嗜性或转导。在一些实施方案中，实现肌肉组织(例如，骨骼肌、膈膜和心肌)的全身转导。在一些实施方案中，实现骨骼肌组织的全身转导。例如，在一些实施方案中，全身基本上所有骨骼肌都被转导(尽管转导的效率可能因肌肉类型而异)。在一些实施方案中，实现肢体肌肉、心肌和膈肌的全身转导。任选地，病毒载体或病毒样颗粒通过全身途径(例如，全身途径，诸如静脉内、关节内或淋巴管内)施用。

可替代地，在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒被局部递送(例如，至足垫、肌肉内、皮内、皮下、局部)。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒被局部递送到中枢神经系统(CNS)的组织，诸如脑或脊髓。在一些实施方案中，病毒载体或病毒样颗粒通过鞘内、脑内或脑室内注射来施用。

除非另有指示，否则“有效转导”或“有效嗜性”或类似术语可以通过参考合适的对照来确定(例如，分别是对照的转导或嗜性的至少约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或更多)。在一些实施方案中，病毒载体(例如，AVV载体)有效地转导骨骼肌、心肌、膈肌、胰腺(包括β-胰岛细胞)、脾脏、胃肠道(例如，上皮和/或平滑肌)、中枢神经系统细胞、肺、关节细胞和/或肾脏或对其具有有效嗜性。合适的控制将取决于多种因素，包括所希望的嗜性谱。例如，AAV8和AAV9高效转导骨骼肌、心肌和膈肌，但具有还高效转导肝脏的缺点。因此，可以鉴定出这样的病毒载体，所述病毒载体展现出AAV8或AAV9的骨骼肌、心肌和/或膈肌的有效转导但对肝脏具有低得多的转导效率。此外，因为感兴趣的嗜性谱可以反映对多种靶组织的嗜性，所以应当理解，合适的病毒载体可能表示一些折衷。为了说明，病毒载体在转导骨骼肌、心肌和/或膈肌方面可能不如AAV8或AAV9有效，但由于肝脏的低水平转导，仍然可能是非常希望的。

类似地，可以通过参考合适的对照来确定病毒是否“不能有效转导”靶组织或类似术语或对其“不具有有效的嗜性”。在一些实施方案中，病毒载体不能有效转导肝脏、肾脏、性腺和/或生殖细胞(即，不具有有效的嗜性)。在一些实施方案中，一种或多种组织(例如，肝脏)的不希望转导是约20％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约1％或更少、约0.1％或更少的一种或多种希望的组织(例如，骨骼肌、膈肌、心肌和/或中枢神经系统细胞)的转导水平。

如本文结合AAV载体(或其蛋白衣壳、衣壳蛋白亚基或肽)所用，术语“选择性结合(selectively binds)”、“选择性结合(selective binding)”和类似术语是指AAV载体(或其蛋白衣壳、衣壳蛋白亚基或肽)以取决于存在特定分子结构的方式结合至靶标。在一些实施方案中，选择性结合是指AAV主要与特定靶标结合，而与其他靶标无实质性或显著结合。在一些实施方案中，AAV载体(或其蛋白衣壳、衣壳蛋白亚基或肽)特异性结合至目的细胞或组织中的受体，但不展现出与其他受体的实质性或显著结合。

“多核苷酸”是核苷酸碱基序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂合序列(包括天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸两者)。在一些实施方案中，多核苷酸是单链或双链DNA序列。

如本文所用，“分离的”多核苷酸(例如，“分离的DNA”或“分离的RNA”)意指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与多核苷酸相关的其他多肽或核酸)至少部分分离的多核苷酸。在一些实施方案中，与起始材料相比，“分离的”核苷酸富集至少约10倍、约100倍、约1000倍、约10,000倍或更多。

同样，“分离的”多核苷酸意指与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与多肽相关的其他多肽或核酸)至少部分分离的多肽。在一些实施方案中，与起始材料相比，“分离的”多肽富集至少约10倍、约100倍、约1000倍、约10,000倍或更多。

如本文所用，“分离”或“纯化”(或语法等价形式)病毒载体意指病毒载体至少部分地与起始材料中的至少一些其他组分分离。在一些实施方案中，与起始材料相比，“分离的”或“纯化的”病毒载体富集至少约10倍、约100倍、约1000倍、约10,000倍或更多。

“治疗性”多肽或蛋白是可以缓解、减轻、预防、延迟和/或稳定由细胞或受试者中蛋白质的缺乏或缺陷引起的症状的多肽或蛋白质和/或以其他方式赋予受试者益处(例如，抗癌作用或移植存活率的改善)的多肽。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“的治疗(treatment of)”(及其语法变体)意指受试者病症的严重程度降低、至少部分改善或稳定和/或实现至少一种临床症状的一些缓解、缓和、降低或稳定和/或存在疾病或障碍的进展的延迟。

术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”(及其语法变体)是指预防和/或延迟受试者的疾病、障碍和/或一种或多种临床症状的发作和/或与不存在本文所述组合物和/或方法的情况相比，疾病、障碍和/或一种或多种临床症状发作的严重程度降低。预防可以是完全的，例如完全没有疾病、障碍和/或一种或多种临床症状。预防也可以是部分的，使得受试者的疾病、障碍和/或一种或多种临床症状的发生和/或发作的严重程度低于不存在本文所述组合物和/或方法时发生的情况。

如本文所用，“有效量”是本文提供的有效治疗或预防受试者的疾病或障碍或改善其体征或症状的AAV载体、核酸或其他试剂的量。“有效量”可以根据例如疾病和/或疾病的症状、疾病的严重程度和/或疾病或障碍的症状、待治疗患者的年龄、体重和/或健康状况以及处方医师的判断而变化。在任何给定的情况下，适当的量可以由本领域技术人员确定或可以能够通过常规实验来确定。

如本文所用，术语“病毒载体”、“载体”是指病毒(例如，AAV)颗粒，所述颗粒具有作为核酸递送载体的功能并且包含包装在病毒粒子或病毒样颗粒内的载体基因组(例如，包含转基因的核酸)。

“腺相关病毒载体”或“AAV载体”典型地包含蛋白衣壳和被蛋白衣壳衣壳化的核酸(例如，包含转基因的核酸)。“蛋白衣壳”是一种近球形的蛋白质壳，其包含以T＝1二十面体对称性关联和排列的单独的“衣壳蛋白亚基”(例如，约60个衣壳蛋白亚基)。本文所述AAV载体的蛋白衣壳包含多个衣壳蛋白亚基。当将AAV载体描述为包含AAV衣壳蛋白亚基时，应理解AAV载体包含蛋白衣壳，其中所述蛋白衣壳包含一个或多个AAV衣壳蛋白亚基。如本文所用，术语“衣壳蛋白”有时用于指衣壳蛋白亚基。术语“病毒样颗粒(viral-like particle)”或“病毒样颗粒(virus-like particle)”是指不包含任何包含转移盒或转基因的载体基因组或核酸的蛋白衣壳。

在一些实施方案中，AAV载体可以包含含有“转移盒”的核酸，即包含可通过AAV递送至细胞的一种或多种序列的核酸。在一些实施方案中，核酸是自互补的(即，双链的)。在一些实施方案中，核酸不是自互补的(即，单链的)。

“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的AAV基因组(即，vDNA)。rAAV载体通常只需要一个或多个顺式的反向末端重复序列(一个或多个ITR)以促进核酸复制。所有其他病毒序列都是非必要的，并且可以以反式提供(Muzyczka,(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158:97)。典型地，rAAV载体基因组将仅保留一个或两个ITR序列，以便使AAV载体可有效包装的转基因的大小最大化。结构和非结构蛋白编码序列可以以反式提供(例如，来自质粒，或通过将序列稳定整合到包装细胞中)。在一些实施方案中，rAAV载体基因组包含至少一个ITR序列(例如，AAV ITR序列)，任选地两个ITR(例如，两个AAV ITR)，所述ITR序列典型地将在载体基因组的5'末端和3'末端(即，5'ITR和3'ITR)并且位于异源核酸的侧翼，但不必与其相继。

本文所述的病毒载体可以进一步是“靶向”病毒载体(例如，具有定向嗜性)和/或“杂合”病毒载体(即，其中病毒ITR和病毒蛋白衣壳来自不同病毒)，如国际专利公开案WO00/28004和Chao等人,(2000)Molecular Therapy 2:619所述。在一些实施方案中，病毒载体靶向CNS的细胞和/或组织。

本文所述的病毒载体可以进一步是双链体病毒颗粒，如国际专利公开案WO 01/92551(将其公开内容通过引用以其整体并入本文)中所述。因此，在一些实施方案中，可以将双链(双链体)基因组包装到本文所述的病毒蛋白衣壳中。此外，蛋白衣壳、蛋白衣壳亚基或基因组元件可以含有其他修饰，包括插入、缺失和/或取代。

如本文所用，术语“氨基酸”涵盖任何天然存在的氨基酸、其修饰形式和合成氨基酸。天然存在的左旋(L-)氨基酸在表4中示出。

表4：氨基酸残基和缩写。

可替代地，氨基酸可以是经修饰的氨基酸残基(非限制性例子在表5中示出)和/或可以是通过翻译后修饰(例如，乙酰化、酰胺化、甲酰化、羟基化、甲基化、磷酸化或硫酸盐化)修饰的。化学修饰氨基酸的方法是本领域已知的(参见例如，Greg T.Hermanson,Bioconjugate Techniques,第1版,Academic Press,1996)。

表5：经修饰的氨基酸残基

此外，非天然存在的氨基酸可以是“非天然”氨基酸(如Wang等人,Annu RevBiophys Biomol Struct.35:225-49(2006)所述)。这些非天然氨基酸可以有利地用于将目的分子化学连接到AAV蛋白衣壳或衣壳蛋白亚基。

经修饰的AAV蛋白衣壳亚基、蛋白衣壳和包含其的AAV载体

本文另外提供了腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含(i)包含重组衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳，和(ii)被所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒。在一些实施方案中，重组衣壳蛋白亚基(包括VP1、VP2和/或VP3区)可以在其氨基酸序列中包含不存在于任何天然AAV衣壳蛋白亚基序列中的肽。包含本文所述肽的衣壳蛋白亚基可以赋予病毒载体一种或多种希望特性，包括但不限于逃避中和抗体的能力。因此，本文所述的AAV载体解决了与常规AAV载体相关的限制。

因此，在一些实施方案中，本公开文本提供了腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含(i)一种或多种重组衣壳蛋白，和(ii)被所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒；其中所述衣壳蛋白包含具有序列SEQ ID NO:12-20中任一个的肽。在一些实施方案中，所述转移盒包含5’和3’AAV反向末端重复序列。在一些实施方案中，所述转移盒包含转基因(例如，NPC1转基因)。在一些实施方案中，所述转移盒是双链的。在一些实施方案中，所述转移盒是单链的。在一些实施方案中，所述转基因编码治疗性蛋白或RNA。在一些实施方案中，重组衣壳蛋白与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽AAV衣壳蛋白的天然序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，重组衣壳蛋白与AAV9衣壳蛋白的天然序列具有至少90％序列同一性。

在一些实施方案中，所述肽位于对应于天然AAV9衣壳蛋白亚基的氨基酸451-458的氨基酸位置，或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽AAV中的等效氨基酸残基，并且所述肽选自SEQ ID NO:12-18中的任一个。在一些实施方案中，所述肽位于对应于天然AAV9衣壳蛋白亚基的氨基酸587-594的氨基酸位置，或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽AAV中的等效氨基酸残基，并且所述肽选自SEQ ID NO:19或20。

在一些实施方案中，重组衣壳蛋白亚基包含a)具有序列SEQ ID NO:12-18中任一个的第一肽；和b)具有序列SEQ ID NO:19-20中任一个的第二肽。在一些实施方案中，第一肽在氨基酸位置451-458，并且第二肽在氨基酸位置587-594，其中氨基酸编号基于天然AAV9衣壳蛋白亚基，或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽AAV中的等效氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述肽抑制至少一种抗体与蛋白衣壳或其衣壳蛋白亚基的结合。在一些实施方案中，所述肽抑制抗体对AAV载体的感染性的中和。

在一些实施方案中，所述肽选择性地与中枢神经系统(CNS)中的细胞的表面上表达的受体结合。在一些实施方案中，所述细胞在运动前区皮层、丘脑、小脑皮层、齿状核、脊髓或背根神经节中。在一些实施方案中，所述肽选择性地与心脏中的细胞的表面上表达的受体结合。

在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包含(i)包含突变AAV9衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳，和(ii)被所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒，其中所述衣壳蛋白亚基包含在天然AAV9衣壳蛋白亚基序列的氨基酸451-458处具有序列X

在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包含(i)包含突变AAV9衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳，和(ii)被所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒，其中所述衣壳蛋白亚基包含在天然AAV9衣壳蛋白亚基序列的氨基酸587-594处具有序列X

在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包含(i)包含重组衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳，和(ii)被所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒，其中所述衣壳蛋白亚基包含与SEQ ID NO:165-187中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:165-187中的任一个。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:175。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:180。

在一些实施方案中，AAV载体选择性地将转移盒递送至中枢神经系统的细胞或组织。在一些实施方案中，中枢神经系统的组织是运动前区皮层、丘脑、小脑皮层、齿状核、脊髓或背根神经节。在一些实施方案中，AAV载体将转移盒递送至脑，但不将AAV载体递送至心脏。在一些实施方案中，AAV载体将转移盒递送至脑和心脏。在一些实施方案中，转移盒向脑的递送大于向心脏的递送。在一些实施方案中，转移盒的递送在脑和心脏中大致相等。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基与天然AAV衣壳蛋白亚基相比包含一个或多个氨基酸修饰(例如，取代和/或缺失)，其中所述一个或多个修饰修饰AAV衣壳蛋白亚基上的一个或多个抗原位点。所述一个或多个抗原位点的修饰导致抗体对所述一个或多个抗原位点的识别降低和/或抑制包含AAV衣壳蛋白亚基的病毒颗粒的感染性的中和。所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代和/或缺失)可以在通过含有AAV衣壳蛋白亚基的AAV-抗体复合体的肽表位作图和/或冷冻电子显微术研究鉴定的一个或多个抗原足迹中。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原位点是常见的抗原基序或CAM，如WO 2017/058892中所述，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，抗原位点在AAV衣壳蛋白亚基的可变区(VR)(诸如VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII、VR-IX)中。在一些实施方案中，一个或多个抗原位点在AAV衣壳蛋白亚基的HI环中。

在一些实施方案中，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh32.22、牛AAV或禽AAV衣壳蛋白亚基在下表6中鉴定的一个或多个区域中包含氨基酸修饰(例如，取代或缺失)。

在一些实施方案中，氨基酸取代会替代来自以下任何一种血清型的AAV衣壳蛋白亚基中的任何八个氨基酸：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh32.22、牛AAV或禽AAV。例如，氨基酸取代可以替代上面列出的任何AAV血清型中的以下氨基酸(VP1编号)：355-362、363-370、371-378、379-386、387-394、395-402、403-410、411-418、419-426、427-434、435-442、443-450、451-458、459-466、467-474、475-482、483-490、491-498、499-506、507-514、515-522、523-530、531-538、539-546、547-554、555-562、563-570、571-578、579-586、587-594、595-602、603-610、611-618、619-626、627-634、635-642、643-650、651-658、659-666、667-674、675-682、683-690、691-698、699-706、707-714、715-722。

在一些实施方案中，氨基酸取代选自SEQ ID NO:19-20中的任一个。在一些实施方案中，氨基酸取代与SEQ ID NO:12-18中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，取代在对应于野生型AAV9衣壳蛋白亚基的氨基酸587-594的氨基酸处。在一些实施方案中，取代在对应于野生型AAV1衣壳蛋白亚基的氨基酸587-594的氨基酸处。在一些实施方案中，取代在对应于野生型AAV6衣壳蛋白亚基的氨基酸587-594的氨基酸处。在一些实施方案中，取代在对应于野生型AAV8衣壳蛋白亚基的氨基酸589-596的氨基酸处。在一些实施方案中，取代在对应于野生型AAVrh8衣壳蛋白亚基的氨基酸587-594的氨基酸处。在一些实施方案中，取代在对应于野生型AAVrh10衣壳蛋白亚基的氨基酸589-596的氨基酸处。

在一些实施方案中，氨基酸取代选自SEQ ID NO:18-20中的任一个。在一些实施方案中，氨基酸取代与SEQ ID NO:18-20中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，取代在对应于野生型AAV9衣壳蛋白亚基的氨基酸451-458的氨基酸处。

在一些实施方案中，氨基酸缺失包括与野生型衣壳蛋白亚基相比至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的缺失。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含一个或多个氨基酸取代和一个或多个氨基酸缺失。在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基包含至少一个氨基酸取代和至少一个氨基酸缺失。在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基包含至少一个氨基酸取代和至少一个氨基酸缺失，其中所述至少一个氨基酸取代和所述至少一个氨基酸缺失在衣壳蛋白亚基氨基酸序列中彼此紧邻。

在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基被修饰以产生AAV衣壳蛋白亚基，当其存在于AAV病毒颗粒或AAV病毒载体中时具有选择性靶向CNS(例如，脑、脊髓)的表型。在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基被修饰以产生AAV衣壳蛋白亚基，当其存在于AAV病毒颗粒或AAV病毒载体中时具有逃避中和抗体的表型。除了逃避中和抗体和/或靶向CNS的表型之外，AAV病毒样颗粒或AAV载体还可以具有增强或维持转导效率的表型。

在一些实施方案中，所述一个或多个取代可以将来自第一AAV血清型的衣壳蛋白亚基的一个或多个序列引入不同于第一AAV血清型的第二AAV血清型的衣壳蛋白亚基中。

其中添加了修饰的基础AAV衣壳蛋白亚基可以是AAV血清型的衣壳蛋白亚基，所述AV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.32.33、AAVrh74、牛AAV、禽AAV或现在已知或以后鉴定的任何其他AAV。在一些实施方案中，基础AAV衣壳蛋白亚基是AAV9血清型的。在一些实施方案中，基础AAV衣壳蛋白亚基是嵌合的。在一些实施方案中，基础AAV衣壳蛋白亚基是AAV8/9嵌合体。

本文提供了经修饰的AAV衣壳蛋白亚基的几个例子。在以下例子中，衣壳蛋白亚基可以包含所描述的特定取代，并且在一些实施方案中，可以包含比所描述的那些更少或更多的取代。如本文所用，“取代”可以指单个氨基酸取代或多于一个相继氨基酸的取代。例如，在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等的单一氨基酸取代。在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基可以包含多个相继氨基酸的一个或多个取代，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个相继氨基酸的一个或多个取代。

此外，在本文所述的一些实施方案中，其中氨基酸残基被除存在于野生型或天然氨基酸序列中的氨基酸残基以外的任何氨基酸残基取代，任何其他氨基酸残基可以是本领域已知的任何天然或非天然氨基酸残基(参见例如，表2和表4)。在一些实施方案中，取代可以是保守取代，并且在一些实施方案中，取代可以是非保守取代。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代各自独立地选自如表7.1中所示的SEQ ID NO:12-18。

表7.1：氨基酸取代

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代各自选自如表7.2中所示的SEQ ID NO:19-20。

表7.2：氨基酸取代

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基可以包含选自表7.1中列出的序列的第一取代和选自表7.2中列出的序列的第二取代。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基可以包含如表7.3和7.4中所示的第一取代、第二取代。

表7.3：氨基酸取代的组合

表7.4：氨基酸取代的组合

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含氨基酸修饰(例如，取代和/或缺失)，其中所述氨基酸修饰修饰AAV衣壳蛋白亚基上的一个或多个表面暴露区域，诸如抗原区。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含一个或多个氨基酸取代，其中至少一个氨基酸取代包含SEQ ID NO:19-20中的一项。在一些实施方案中，取代替代对应于野生型AAV9衣壳蛋白亚基的氨基酸587-594的氨基酸。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含一个或多个氨基酸取代，其中至少一个氨基酸取代包含SEQ ID NO:12-18中的一项。在一些实施方案中，取代替代对应于野生型AAV9衣壳蛋白亚基的氨基酸451-458的氨基酸。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含含有天然衣壳蛋白亚基序列中不存在的八个氨基酸的序列(X

在一些实施方案中，X

在一些实施方案中，AAV亚基蛋白包含一个或多个氨基酸缺失，其中所述氨基酸缺失包含与野生型AAV衣壳蛋白亚基相比至少六个或至少八个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含与天然衣壳蛋白亚基序列相比八个接续的氨基酸的缺失。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含与天然衣壳蛋白亚基序列相比六个接续的氨基酸的缺失。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含序列LSKTQTLK(SEQ ID NO:1374)或序列LSKTDPQTLK(SEQ ID NO:1375)。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1374或1375的AAV衣壳蛋白亚基是选自以下的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV和牛AAV。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含含有选自SEQ ID NO:12-18的序列的第一取代；和含有选自SEQ ID NO:19-20的序列的第二取代。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含氨基酸缺失和取代，其中所述取代包含选自SEQ ID NO:12-20的序列。

在一些实施方案中，重组衣壳蛋白亚基与SEQ ID NO:9(AAV9)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列并且包含以下氨基酸取代中的一个或多个：I451S、I451F、I451Q、I451G、I451K、I451R、N452C、N452G、N452R、N452D、N452T、N452Q、G453Q、G453V、G453Y、G453R、G453F、G453D、S454P、S454Q、S454A、S454R、G455T、G455N、G455A、G455P、G455I、Q456V、Q456A、Q456I、N457M、N457P、N457R、N457Q、Q458N、Q458L、Q458F、Q458E、Q458H、Q458A、A587S、Q588K、Q588T、A589V、Q590E、Q590D、A591S、Q592W、Q592I、T593A、G594E、G594I。

本文所述的任何AAV衣壳蛋白亚基可以进一步包含在HI环中的修饰(例如，取代或缺失)。HI环是AAV衣壳蛋白亚基表面上的突出结构域(在β链βH与βI之间)，所述突出结构域从每个病毒蛋白(VP)亚基延伸，与相邻的五倍VP重叠。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基在HI环中包含一、二、三、四、五、六、七或八个氨基酸取代。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基在HI环中包含以下取代基中的一个或多个：P661R、T662S、Q666G、S667D，其中编号对应于野生型AAV8衣壳蛋白亚基(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基在HI环中包含以下取代基中的一个或多个：P659R、T660S、A661T、K664G，其中编号对应于野生型AAV9衣壳蛋白亚基(SEQ ID NO:9)。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含一、二、三或四个氨基酸取代，其中每个取代修饰AAV衣壳蛋白亚基上的不同抗原位点，并且其中至少一个氨基酸取代修饰衣壳蛋白亚基的HI环。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含第一、第二、第三和第四氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个取代修饰衣壳蛋白亚基的HI环。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基在HI环中包含以下取代基中的一个或多个：P661R、T662S、Q666G、S667D，其中编号对应于野生型AAV8衣壳蛋白亚基(SEQ ID NO:8)；或P659R、T660S、A661T、K664G，其中编号对应于野生型AAV9衣壳蛋白亚基(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:185-187中的任一个。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基包含与SEQ ID NO:165-187中的任一个共享至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

本文还提供了一种编码一种或多种本文所述AAV衣壳蛋白亚基的核酸或包含其的质粒。核苷酸序列可以是DNA序列或RNA序列。在一些实施方案中，细胞包含本文所述的一种或多种核酸或质粒。

在一些实施方案中，AAV蛋白衣壳包含如本文所述的AAV衣壳蛋白亚基。本文进一步提供了包含AAV蛋白衣壳的病毒载体以及包含在药学上可接受的载体中的AAV蛋白衣壳、AAV衣壳蛋白亚基和/或病毒载体的组合物。

在一些实施方案中，一个或多个抗原位点的修饰导致抗体与一个或多个抗原位点的结合减少。在一些实施方案中，所述一个或多个抗原位点的修饰导致抑制包含AAV衣壳蛋白亚基的病毒颗粒的感染性的中和。

如本文所述，来自许多AAV的衣壳蛋白亚基的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。因此，对于任何其他AAV，可以容易地确定“对应”于天然AAV衣壳蛋白亚基的氨基酸位置的氨基酸(例如，通过使用序列比对)。

经修饰的衣壳蛋白亚基可以通过修饰现在已知或以后发现的任何AAV的衣壳蛋白亚基来产生。此外，待修饰的基础AAV衣壳蛋白亚基可以是天然存在的AAV衣壳蛋白亚基(例如，AAV2、AAV3a或3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白亚基或表2中所示的任何AAV)，但不限于此。本领域技术人员应理解，对AAV衣壳蛋白亚基的多种操纵是本领域已知的，并且本公开文本不限于对天然存在的AAV衣壳蛋白亚基的修饰。例如，与天然存在的AAV相比，待修饰的衣壳蛋白可能已经具有改变(例如，源自天然存在的AAV衣壳蛋白亚基，例如，AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或现在已知或以后发现的任何其他AAV)。在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基可以是嵌合衣壳蛋白亚基。在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基可以是工程化的AAV，诸如AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B。

因此，在一些实施方案中，待修饰的AAV衣壳蛋白亚基可以源自天然存在的AAV，但进一步包含一个或多个外来序列(例如，对于天然病毒而言是外源的)，所述外来序列插入和/或取代到衣壳蛋白亚基和/或已因一个或多个氨基酸的缺失而改变。

因此，当本文提及特定的AAV衣壳蛋白亚基(例如，AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白亚基或来自表2中所示的任何AAV的衣壳蛋白亚基等)时，其旨在涵盖天然衣壳蛋白亚基以及具有不同于本文所述修饰的改变的衣壳蛋白亚基。此类改变包括取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，与天然AAV衣壳蛋白亚基序列相比，所述衣壳蛋白亚基包含其中插入的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60、或少于70个氨基酸(除了本文所述的插入)。在一些实施方案中，与天然AAV衣壳蛋白亚基序列相比，衣壳蛋白亚基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60或少于70个氨基酸取代(除了本文所述的氨基酸取代)，在一些实施方案中，与天然AAV衣壳蛋白亚基序列相比，衣壳蛋白亚基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60或少于70个氨基酸的缺失。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基具有与天然AAV衣壳蛋白亚基序列具有至少约90％、约95％、约97％、约98％或约99％相似性或同一性的氨基酸序列。

确定两个或更多个氨基酸序列之间的序列相似性或同一性的方法是本领域已知的。可以确定核酸的全长或核酸的指示部分的序列相似性或同一性。序列相似性或同一性可以使用标准技术确定，包括但不限于Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2,482(1981)的局部序列同一性算法，通过Needleman和Wunsch,J Mol.Biol.48,443(1970)的序列同一性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive,威斯康星州麦迪逊)的计算机化实现，由Devereux等人,Nucl.Acid Res.12,387-395(1984)所述的最佳拟合序列程序，或通过检查。

另一种合适的算法是BLAST算法，描述于Altschul等人,J Mol.Biol.215,403-410,(1990)和Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5787(1993)中。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其获自Altschul等人,Methods in Enzymology,266,460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html。WU-BLAST-2使用多个搜索参数，所述参数任选地设置为默认值。这些参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和针对正在搜索的目的序列的特定数据库的组成来建立；然而，可以调节所述值以增加灵敏度。

此外，另一个有用的算法是gapped BLAST，如Altschul等人,(1997)NucleicAcids Res.25,3389-3402所报道的。

出于本公开文本的目的，除非另有指示，否则同一性百分比是使用可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在线获得的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)计算的。本领域技术人员应理解，其他算法可以适当地取代。

在一些实施方案中，所述蛋白衣壳包含如本文所述的经修饰的AAV衣壳蛋白亚基。在一些实施方案中，所述蛋白衣壳是细小病毒衣壳，所述细小病毒衣壳可以进一步是自主细小病毒衣壳或依赖病毒衣壳。任选地，蛋白衣壳是AAV蛋白衣壳。在一些实施方案中，AAV蛋白衣壳是AAV1、AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV蛋白衣壳、禽AAV蛋白衣壳或现在已知或以后鉴定的任何其他AAV。AAV血清型的非限制性列表在表2中示出。AAV蛋白衣壳可以是表2中列出的或通过一个或多个插入、取代和/或缺失而源自前述项任何AAV血清型。可以被经修饰的病毒蛋白衣壳包装并且转移到细胞中的分子包括转移盒(例如，异源DNA或RNA)、多肽、有机小分子、金属或其组合。

异源分子被定义为在AAV感染中不天然存在的分子，例如，不是由野生型AAV基因组编码的分子。此外，治疗上有用的分子可以与嵌合蛋白衣壳的外部缔合，以将分子转移到宿主靶细胞中。此类相关分子可以包括DNA、RNA、有机小分子、金属、碳水化合物、脂质和/或多肽。在一些实施方案中，治疗有用的分子与蛋白衣壳或其衣壳蛋白共价连接(即，缀合或化学偶联)。共价连接分子的方法是本领域技术人员已知的。

经修饰的蛋白衣壳还可用于产生针对新型蛋白衣壳结构的抗体。作为另一种替代方案，可以将外源氨基酸序列插入经修饰的蛋白衣壳或其衣壳蛋白亚基中，用于将抗原呈递给细胞，例如，用于施用于受试者以产生对外源氨基酸序列的免疫反应。

在一些实施方案中，可以在施用递送编码目的多肽或功能性RNA的核酸的病毒载体之前和/或同时(例如，在彼此的数分钟或数小时内)施用蛋白衣壳以阻断某些细胞位点。例如，可以递送本发明蛋白衣壳以阻断肝细胞上的细胞受体，并且可以随后或同时施用递送载体(例如，AAV载体)，这可以减少肝细胞的转导，并且增强其他靶标(例如，骨骼、心脏和/或膈肌)。

根据一些实施方案，经修饰的蛋白衣壳可以在如本文所述的经修饰的病毒载体之前和/或同时施用于受试者。此外，本公开文本提供了包含本发明的经修饰的蛋白衣壳或其衣壳蛋白亚基的组合物和药物配制品；任选地，所述组合物还包含如本文所述的经修饰的病毒载体。

在一些实施方案中，核酸(任选地，分离的核酸)编码本文所述的经修饰的蛋白衣壳亚基。进一步提供了核酸和包含本文所述核酸和/或病毒载体的细胞(体内或在培养基中)。作为一个例子，病毒载体可以包含：(a)包含如本文所述的经修饰的AAV衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳；和(b)包含至少一个末端重复序列的核酸，其中所述核酸被AAV蛋白衣壳衣壳化。

合适的病毒载体包括例如腺病毒、AAV、疱疹病毒、牛痘、痘病毒、杆状病毒、慢病毒、冠状病毒等。合适的核酸包括但不限于质粒、噬菌体、YAC、BAC等。此类核酸和细胞可以例如用作试剂(例如，辅助包装构建体或包装细胞)，用于产生如本文所述的经修饰的病毒蛋白衣壳、蛋白衣壳亚基或病毒载体。

本文所述的蛋白衣壳和衣壳蛋白亚基可以使用本领域已知的任何方法产生，例如通过使用杆状病毒系统(Brown等人,(1994)Virology 198:477-488)。

如本文所述的对AAV衣壳蛋白亚基的修饰是“选择性”修饰。这种方法与以前在AAV血清型之间进行全亚基或大结构域交换的工作形成对比(参见例如，国际专利公开案WO00/28004和Hauck等人,(2003)J.Virology 77:2768-2774)。在一些实施方案中，“选择性”修饰导致少于或等于约20、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4或3个相继氨基酸的插入和/或取代和/或缺失。

本文所述的经修饰的衣壳蛋白亚基和蛋白衣壳可以进一步包含现在已知或以后鉴定的任何其他修饰。例如，AAV衣壳蛋白亚基和蛋白衣壳可以是嵌合的，因为它们可以包含来自另一种病毒、任选另一种细小病毒或AAV(例如，如国际专利公开案WO00/28004中所述)的衣壳蛋白亚基的全部或部分。

在一些实施方案中，蛋白衣壳或衣壳蛋白亚基可以是靶向蛋白衣壳或衣壳蛋白亚基，其包含靶向序列(例如，取代或插入蛋白衣壳或衣壳蛋白亚基中)，所述靶向序列指导蛋白衣壳或衣壳蛋白亚基与存在于一种或多种希望的靶组织上的细胞表面分子相互作用(参见例如，国际专利公开案WO 00/28004和Hauck等人,(2003)J.Virology 77:2768-2774)；Shi等人,Human Gene Therapy 17:353-361(2006)[描述了在AAV衣壳蛋白亚基的位置520和/或584处插入整合素受体结合基序RGD]；和美国专利号7,314,912[描述了在AAV2衣壳蛋白亚基的氨基酸位置447、534、573和587之后插入含有RGD基序的PI肽])。在AAV衣壳蛋白亚基内耐受插入的其他位置是本领域已知的(例如，由Grifman等人所述的位置449和588,Molecular Therapy 3:964-975(2001))。

例如，如本文所述的蛋白衣壳或衣壳蛋白亚基可以对某些目的靶组织(例如，肝脏、骨骼肌、心脏、膈肌、肾脏、脑、胃、肠、皮肤、内皮细胞和/或肺)具有相对低效的嗜性。可以将靶向序列有利地掺入这些低转导载体中，从而赋予蛋白衣壳(或其衣壳蛋白亚基)所希望的嗜性和任选地对一种或多种特定组织的选择性嗜性。包含靶向序列的AAV衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳和AAV载体描述于例如国际专利公开案WO 00/28004中。作为另一个例子，如由Wang等人,Annu Rev Biophys Biomol Struct.35:225-49(2006)所述的一种或多种非天然存在的氨基酸可以在正交位点处掺入如本文所述的AAV衣壳蛋白亚基，作为将低转导载体重新定向到所希望的一种或多种靶组织的手段。这些非天然氨基酸可以有利地用于将目的分子化学连接至AAV衣壳蛋白亚基，包括但不限于：聚糖(靶向甘露糖-树突状细胞的)；RGD、铃蟾肽或用于靶向递送至特定癌细胞类型的神经肽；RNA适体或选自靶向特定细胞表面受体诸如生长因子受体、整联蛋白等的噬菌体展示的肽。

在一些实施方案中，靶向序列可以是指导感染一种或多种特定细胞类型的衣壳蛋白亚基序列(例如，自主细小病毒衣壳序列、AAV衣壳蛋白亚基序列、或任何其他病毒衣壳序列)。

作为另一个非限制性例子，肝素或硫酸乙酰肝素结合结构域(例如，呼吸道合胞病毒肝素结合结构域)可以插入或取代到衣壳蛋白亚基中，所述衣壳蛋白亚基典型地不结合HS受体(例如，AAV4、AAV5)以赋予肝素和/或硫酸乙酰肝素与所得突变体的结合。

B19使用红细胞糖苷酯为其受体感染原代红系祖细胞(Brown等人,(1993)Science262:114)。B19的结构已确定为

在一些实施方案中，外源靶向序列可以是编码改变包含经修饰的AAV衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳或病毒载体的嗜性的肽的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，靶向肽或蛋白可以是天然存在的，或者是完全或部分合成的。示例性靶向序列包括与细胞表面受体和糖蛋白结合的配体和其他肽，诸如ROD肽序列、缓激肽、激素、肽生长因子(例如，表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子I和II等)、细胞因子、黑素细胞刺激激素(例如，a、β或γ)、神经肽和内啡肽等，以及保留将细胞靶向其同源受体的能力的其片段。其他说明性肽和蛋白质包括物质P、角质形成细胞生长因子、神经肽Y、胃泌素释放肽、白细胞介素2、鸡蛋清溶菌酶、促红细胞生成素、促性腺激素、皮质抑素、β-内啡肽、leu-脑啡肽、强腓肽B(rimorphin)、α-新脑啡肽、血管紧张素、pneumadin、血管活性肠肽、神经降压素、胃动素及其片段，如上所述。作为又另一个替代方案，来自毒素(例如，破伤风毒素或蛇毒素，诸如α-环蛇毒素等)的结合结构域可以作为靶向序列被取代到衣壳蛋白亚基中。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基可以通过将如Cleves(Current Biology 7:R318(1997))所述的“非经典”输入/输出信号肽(例如，成纤维细胞生长因子-1和-2、白细胞介素1、HIV-1Tat蛋白、疱疹病毒VP22蛋白等)取代到AAV衣壳蛋白亚基中而被修饰。还涵盖指导被特定细胞摄取的肽基序，例如，FVFLP(SEQ ID NO:22)肽基序触发被肝细胞摄取。

噬菌体展示技术以及本领域已知的其他技术可以用于鉴定识别任何目的细胞类型的肽。

靶向序列可以编码靶向细胞表面结合位点的任何肽，包括受体(例如，蛋白质、碳水化合物、糖蛋白或蛋白聚糖)。细胞表面结合位点的例子包括但不限于硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和其他糖胺聚糖、在粘蛋白、糖蛋白和神经节苷脂上发现的唾液酸部分、MHC 1糖蛋白、在膜糖蛋白上发现的碳水化合物组分，包括甘露糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、岩藻糖、半乳糖等。

在一些实施方案中，硫酸乙酰肝素(HS)或肝素结合结构域被取代到衣壳蛋白亚基中(例如，不以其他方式与HS或肝素结合的AAV蛋白衣壳亚基中)。本领域已知HS/肝素结合由富含精氨酸和/或赖氨酸的“碱性区块(basic patch)”介导。在一些实施方案中，可以使用在基序BXXB(SEQ ID NO:23)之后的序列，其中“B”是碱性残基并且X是中性和/或疏水残基。作为非限制性例子，BXXB可以是RGNR(SEQ ID NO:24)。作为另一个非限制性例子，BXXB取代天然AAV2衣壳蛋白亚基中的氨基酸位置262至265或另一种AAV血清型的衣壳蛋白亚基中的一个或多个相应位置。

表8示出了合适的靶向序列的其他非限制性例子。

表8：靶向序列

Y*是磷酸-Tyr

在一些实施方案中，靶向序列可以是可用于化学偶联(例如，可以包含精氨酸和/或赖氨酸残基，所述残基可以通过它们的R基团化学偶联)至靶向进入细胞的另一种分子的肽。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白亚基或蛋白衣壳可以包含如WO2006/066066中所述的突变。例如，所述衣壳蛋白亚基可以包含在天然AAV2衣壳蛋白亚基的氨基酸位置263、705、708和/或716处的选择性氨基酸取代，或来自另一种AAV血清型的衣壳蛋白亚基中的一个或多个相应变化。

另外或可替代地，在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体包含直接在AAV2衣壳蛋白亚基的氨基酸位置264之后的选择性氨基酸插入或来自其他AAV的衣壳蛋白亚基中的相应变化。“直接在氨基酸位置X之后”旨在表明，插入紧接在指示的氨基酸位置之后(例如，“在氨基酸位置264之后”指示在位置265的点插入或更大的插入，例如从位置265至268等)。

此外，在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体可以包含氨基酸修饰，诸如PCT公开号WO 2010/093784中所述(例如，2i8)和/或PCT公开号WO 2014/144229中所述(例如，双聚糖)。

在一些实施方案中，相对于衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体起源的AAV血清型的转导效率，衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体可以具有等效或增强的转导效率。在一些实施方案中，相对于衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体起源的AAV血清型的转导效率，衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体可以具有降低的转导效率。在一些实施方案中，相对于衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体起源的AAV血清型的嗜性，衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体可以具有等效或增强的嗜性。在一些实施方案中，相对于衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体起源的AAV血清型的嗜性，衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体可以具有改变或不同的嗜性。在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体可以具有或经工程以具有对脑组织的嗜性。在一些实施方案中，衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳或病毒载体可以具有或经工程以具有对肝组织的嗜性。

本文所述的AAV载体可以用于将异源核酸递送至细胞或受试者。例如，经修饰的载体可以用于治疗溶酶体贮积障碍，诸如粘多糖贮积障碍(例如，Sly综合征[β-葡萄糖醛酸酶]、贺勒氏综合征(Hurler syndrome)[α-L-艾杜糖醛酸酶]、施艾氏综合征(Scheiesyndrome)[α-L-艾杜糖醛酸酶]、贺勒-施艾氏综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏综合征[艾杜糖酸硫酸酯酶]、圣菲利柏氏综合征(Sanfilippo syndrome)(A[乙酰肝素磺胺酶]、B[N-乙酰氨基葡萄糖苷酶]、C[乙酰辅酶A:α-氨基葡糖苷乙酰转移酶]、D[N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶])、莫基奥综合征(Morquio syndrome)(A[半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶]、B[β-半乳糖苷酶])、马洛托-拉米氏综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)[N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等)、法布里病(Fabry disease)(a-半乳糖苷酶)、戈谢病(葡糖脑苷脂酶)、或糖原贮积障碍(例如，庞贝病(Pompe disease)；溶酶体酸α-葡糖苷酶)，如本文所述。

本领域技术人员应理解，对于一些AAV衣壳蛋白亚基，相应的修饰将是插入和/或取代，取决于相应的氨基酸位置是部分或完全存在于病毒中还是可替代地完全不存在。

在一些实施方案中，病毒载体包含本文所述的经修饰的衣壳蛋白亚基和蛋白衣壳。在一些实施方案中，病毒载体是细小病毒载体(例如，包含细小病毒蛋白衣壳和/或载体基因组)，例如，AAV载体(例如，包含AAV蛋白衣壳和/或载体基因组)。在一些实施方案中，病毒载体包含经修饰的AAV蛋白衣壳，其包含如本文所述的经修饰的衣壳蛋白亚基；和载体基因组。

例如，在一些实施方案中，病毒载体包含：(a)经修饰的蛋白衣壳(例如，经修饰的AAV蛋白衣壳)，其包含本文所述的经修饰的衣壳蛋白亚基；和(b)核酸，其包含末端重复序列(例如，AAV TR)，其中所述包含末端重复序列的核酸被经修饰的蛋白衣壳衣壳化。所述核酸可以任选地包含两个末端重复序列(例如，两个AAV TR)。

在一些实施方案中，病毒载体是包含编码目的多肽或功能性RNA的异源核酸的重组病毒载体。重组病毒载体在下面更详细地描述。

在一些实施方案中，病毒载体(i)与被无经修饰的衣壳蛋白亚基的病毒载体的转导水平相比，具有降低的肝脏转导；(ii)与通过无经修饰的衣壳蛋白亚基的病毒载体观察到的水平相比，展现出在动物受试者中增强的被病毒载体的全身转导；(iii)与通过无经修饰的衣壳蛋白亚基的病毒载体的运动水平相比，表现出增强的跨内皮细胞的运动，和/或(iv)展现出肌肉组织(例如，骨骼肌、心肌和/或膈肌)的转导的选择性增强，(v)展现出肝组织转导的选择性增强，和/或(vi)与通过无经修饰的衣壳蛋白亚基的病毒载体的转导水平相比，脑组织(例如，神经元)的转导减少。在一些实施方案中，病毒载体具有向肝脏的全身性转导。

在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180或175；和(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:175。

在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180或175或相对于SEQ ID NO:180或175包含约1至约25个氨基酸突变的序列；和(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:180或175，衣壳蛋白亚基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸突变。

在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR中的至少一个的长度为约110至约160个核苷酸。在一些实施方案中，5’ITR的长度与3’ITR相同。在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR具有不同的长度。在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR中的至少一个分离自或源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV或牛AAV的基因组。在一些实施方案中，所述5’ITR包含序列SEQID NO:3003。在一些实施方案中，所述3’ITR包含序列SEQ ID NO:3004。

在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自CBA启动子、GUSB240启动子、GUSB379启动子、HSVTK启动子、CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、EF-1α启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自CBA启动子、GUSB240启动子、GUSB379启动子和HSVTK启动子。在一些实施方案中，所述启动子包含与SEQ ID NO:3005、SEQ ID NO:3006、SEQ ID NO:3007或SEQ ID NO:3008中任一个具有至少95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述NPC1蛋白是人NPC1蛋白。在一些实施方案中，所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述NPC1蛋白包含序列SEQ ID NO:3001。

在一些实施方案中，所述转基因包含序列SEQ ID NO:3002。

在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号选自猿猴病毒40(SV40)、rBG、α-珠蛋白、β-珠蛋白、人胶原、人生长激素(hGH)、多瘤病毒、人生长激素(hGH)和牛生长激素(bGH)。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号是rBG聚腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:3012或SEQ ID NO:3013具有至少95％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述转移盒进一步包含增强子。在一些实施方案中，所述增强子是CMV增强子。在一些实施方案中，所述增强子包含序列SEQ ID NO:3009或与其具有至少95％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述转移盒进一步包含内含子序列。在一些实施方案中，所述内含子序列是嵌合序列。

在一些实施方案中，所述内含子序列是杂合序列。在一些实施方案中，所述内含子序列包含分离自或源自SV40的序列。在一些实施方案中，所述内含子序列包含序列SEQ IDNO:3010-3011中的任一个。在一些实施方案中，所述AAV转移盒包含序列SEQ ID NO:3014-3019中的任一个。

本领域技术人员应理解，本文所述的经修饰的衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳和病毒载体不包括在其天然状态的特定位置具有指示的氨基酸的那些衣壳蛋白亚基、蛋白衣壳和病毒载体(即，不是突变体)。

AAV转移盒

本文描述了用于生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的AAV转移盒、核酸和质粒。所公开的盒、核酸和质粒包含可用于表达一种或多种转基因的序列，所述转基因在改善、治疗和/或预防一种或多种疾病或障碍方面具有治疗功效。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’反向末端重复序列(ITR)；转基因；和3’ITR。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、启动子、转基因和3’ITR。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、启动子、转基因、聚腺苷酸化序列和3’ITR。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、启动子、转基因、聚腺苷酸化序列和3’ITR；其中所述转移盒包含内含子序列。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、启动子、内含子序列、转基因、聚腺苷酸化序列和3’ITR。在一些实施方案中，其中所述转基因编码NPC1蛋白或其片段或变体。

反向末端重复序列或ITR序列是介导AAV原病毒整合并且将AAV DNA包装成病毒粒子的序列。ITR参与AAV生命周期中的各种活动。例如，可形成发夹结构的ITR序列在转染、载体基因组的复制、和整合后从质粒中切除以及从宿主细胞基因组的拯救中起作用。

本公开文本的AAV转移盒可以包含5'ITR和3'ITR。ITR序列的长度可以是约110至约160个核苷酸，例如长度是110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160个核苷酸。在一些实施方案中，ITR序列的长度可以是约141个核苷酸。在一些实施方案中，5’ITR的长度与3’ITR相同。在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR具有不同的长度。在一些实施方案中，5’ITR长于3’ITR，并且在其他实施方案中，3’ITR长于5’ITR。

ITR可以分离自或源自任何AAV(例如，表1中列出的AAV)的基因组。在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR中的至少一个分离自或源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV或牛AAV的基因组。在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR中的至少一个可以是分离自源自除AAV以外的另一种细小病毒物种的成员的野生型或突变ITR。例如，在一些实施方案中，ITR可以是分离自或源自博卡病毒或细小病毒B19的野生型或突变型ITR。

在一些实施方案中，ITR包括促进scAAV产生的修饰。在一些实施方案中，促进scAAV产生的修饰是从ITR中缺失末端解离序列(TRS)。在一些实施方案中，5’ITR是野生型ITR，并且3’ITR是缺少末端解离序列的突变ITR。在一些实施方案中，3’ITR是野生型ITR，并且5’ITR是缺少末端解离序列的突变ITR。在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR两者都不存在末端解离序列。在其他实施方案中，促进scAAV产生的修饰是将ITR用不同的发夹形成序列诸如shRNA形成序列替代。

在一些实施方案中，5’ITR可以包含序列SEQ ID NO:3003或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，3’ITR可以包含序列SEQ ID NO:3004或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，5’ITR包含序列SEQ ID NO:3003并且3’ITR包含序列SEQID NO:3004。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含一个或多个“代理”ITR，即与ITR功能相同的非ITR序列。参见例如，Xie,J.等人,Mol.Ther.,25(6):1363-1374(2017)。在一些实施方案中，AAV转移盒中的ITR被代理ITR替代。在一些实施方案中，代理ITR包含发夹形成序列。在一些实施方案中，代理ITR是短发夹(sh)RNA形成序列。

基因表达可以由侧翼是给定蛋白质的编码区的被称为启动子和增强子的核苷酸序列控制。

如本文所用，术语“启动子”是指指导可操作连接的核酸转录的一个或多个核酸控制序列。启动子可以包括靠近转录起始位点的核酸序列，诸如TATA元件。启动子也可以包括能够被转录因子结合的顺式作用多核苷酸序列。

“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(诸如启动子或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。

基因表达也可以由一个或多个远端“增强子”或“阻遏子”元件控制，所述元件的位置可以距转录起始位点多达几千个碱基对。增强子或阻遏子元件以类似于转录起始位点附近的顺式作用元件的方式调节转录，不同之处在于增强子元件可以在距转录起始位点一定距离而起作用。

在一些实施方案中，本文所述的AAV转移盒包含启动子。启动子可以是例如组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。

可用于本文所述AAV转移盒的示例性启动子包括CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在一些实施方案中，启动子选自鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、EF-1α启动子、和EF-1α短启动子。在一些实施方案中，启动子包含选自序列SEQ ID NO:3005-3008中的任一个或与其具有至少95％同一性的序列。

在一些实施方案中，本文所述的AAV转移盒包含增强子。所述增强子可以是例如CMV增强子。在一些实施方案中，所述增强子包含序列SEQ ID NO:3009或与其具有至少95％同一性的序列。

可用于本文所述AAV转移盒的示例性组织特异性启动子和增强子的非限制性列表包括：HMG-COA还原酶启动子；胆固醇调节元件1(SRE-1)；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)启动子；人C反应性蛋白(CRP)启动子；人葡萄糖激酶启动子；胆固醇7-α羟化酶(CYP-7)启动子；β-半乳糖苷酶α-2,6唾液酸转移酶启动子；胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-1)启动子；醛缩酶B启动子；人转铁蛋白启动子；I型胶原启动子；前列腺酸性磷酸酶(PAP)启动子；前列腺分泌蛋白94(PSP 94)启动子；前列腺特异性抗原复合物启动子；人腺激肽释放酶基因启动子(hgt-1)；肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2；肌肉肌酸激酶启动子；胰腺炎相关蛋白启动子(PAP)；弹性蛋白酶1转录增强子；胰腺特异性淀粉酶和弹性蛋白酶增强子启动子；胰腺胆固醇酯酶基因启动子；子宫珠蛋白启动子；胆固醇侧链裂解(SCC)启动子；γ-γ烯醇化酶(神经元特异性烯醇化酶，NSE)启动子；神经丝重链(NF-H)启动子；人CGL-1/颗粒酶B启动子；末端脱氧转移酶(TdT)、λ5、VpreB和lck(淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶p561ck)启动子；人CD2启动子及其3'转录增强子；人NK和T细胞特异性激活(NKG5)启动子；pp60c-src酪氨酸激酶启动子；器官特异性新抗原(OSN)，mw 40kDa(p40)启动子；结肠特异性抗原-P启动子；人α-乳白蛋白启动子；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)启动子、HER2/neu启动子、酪蛋白启动子、IgG启动子、绒毛膜胚胎抗原启动子、弹性蛋白酶启动子、胆色素原脱氨酶启动子、胰岛素启动子、生长激素因子启动子、酪氨酸羟化酶启动子、白蛋白启动子、α胎蛋白启动子、乙酰胆碱受体启动子、醇脱氢酶启动子、α或β珠蛋白启动子、T细胞受体启动子、骨钙素启动子、IL-2启动子、IL-2受体启动子、乳清(wap)启动子和MHC II类启动子。

本文所述AAV转移盒包含用于在靶细胞中表达的转基因。

转基因可以是任何一种或多种异源的目的核酸序列。此类核酸可以包括编码多肽的核酸，包括治疗性(例如，用于医学或兽医用途)或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽或RNA。可替代地，所述核酸可以编码反义核酸、核酶、实现剪接体介导的/ram剪接的RNA、介导基因沉默的干扰RNA(RNAi)(包括siRNA、shRNA或miRNA)、以及其他非翻译RNA。在一些实施方案中，所述核酸序列可以指导基因编辑。例如，所述核酸可以编码基因编辑分子，诸如指导RNA或核酸酶。在一些实施方案中，所述核酸可以编码锌指核酸酶、归巢核酸内切酶、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)、NgAgo(agronaute核酸内切酶)、SGN(结构导向核酸内切酶)或RGN(RNA导向核酸酶)，诸如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，所述核酸可以与宿主染色体上的基因座共享同源性并且与其重组。例如，这种方法可以用来纠正宿主细胞中的遗传缺陷。

根据本公开文本的病毒载体提供了将转基因递送到广泛范围的细胞(包括分裂细胞和非分裂细胞)中的手段。病毒载体可以用于在体外将转基因递送至细胞，例如，以在体外产生多肽或用于离体基因疗法。病毒载体另外可用于向有需要的受试者递送转基因例如以表达免疫原性或治疗性多肽或功能性RNA的方法。以这种方式，可以在受试者体内产生多肽或功能性RNA。受试者可能需要所述多肽，因为受试者缺乏所述多肽。此外，可以实践所述方法，因为受试者中多肽或功能性RNA的产生可以赋予一些有益的效果。如本文所用，术语“功能性RNA”是指在细胞中具有一种或多种功能的任何非编码RNA序列，诸如前段中所述那些。

病毒载体也可以用于递送核酸，用于在培养细胞或受试者中生产目的多肽或功能性RNA(例如，使用受试者作为生物反应器来生产多肽或观察功能性RNA对受试者的作用，例如，关于筛选方法)。

通常，本公开文本的病毒载体可以用于递送编码多肽或功能性RNA的转基因，以治疗和/或预防递送治疗性多肽或功能性RNA有益的任何疾病状态。

在一些实施方案中，所述转基因可用于治疗NPC1。在一些实施方案中，所述转基因编码所述NPC1蛋白。NPC1蛋白可以是例如人NPC1蛋白。在一些实施方案中，NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，NPC1蛋白包含表9中列出的一个或多个单核苷酸变化(基于SEQ ID NO:3001或3020编号)。在一些实施方案中，NPC1蛋白是人NPC1蛋白的截短形式。在一些实施方案中，NPC1蛋白包含序列SEQ ID NO:3001或与其具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，NPC1蛋白包含序列SEQ ID NO:3020或与其具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，NPC1蛋白包含序列SEQ ID NO:3001或3020，其具有表9中列出的一个或多个单核苷酸变化。在一些实施方案中，NPC1蛋白具有如UniProt登录号O15118所示的序列，将其通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，转基因包含序列SEQ ID NO:3002或与其具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，转基因包含序列SEQ ID NO:3002或具有相对于其1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核酸变化的序列。在一些实施方案中，转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3001。在一些实施方案中，转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3020。

表9：NPC1变体序列

基于SEQ ID NO:3001或SEQ ID NO:3020的位置编号

聚腺苷酸化信号是在几乎所有哺乳动物基因中发现的核苷酸序列并且控制一串大约200个腺苷残基(聚(A)尾)向基因转录物的3’端的添加。聚(A)尾有助于mRNA稳定性，并且缺少聚(A)尾的mRNA迅速降解。还有证据表明，聚(A)尾的存在通过影响翻译的起始而积极地有助于mRNA的可翻译性。

在一些实施方案中，本公开文本的AAV转移盒包含聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可以选自猿猴病毒40(SV40)、α-珠蛋白、β-珠蛋白、人胶原、人生长激素(hGH)、多瘤病毒、人生长激素(hGH)和牛生长激素(bGH)的聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号是rBG聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号包含序列SEQ ID NO:3012或SEQ ID NO:3013。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号包含与序列SEQ ID NO:3012或SEQ ID NO:3013具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。

AAV载体典型地接受具有确定的大小范围的DNA插入片段，所述范围通常约4kb至约5.2kb或稍大。因此，对于较短的转基因序列，可能需要在插入片段中包括另外的核酸以便达到对于AAV载体可接受的所需长度。因此，在一些实施方案中，本公开文本的AAV转移盒可以包含填充序列。填充序列可以是例如长度在1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、至4,500-5,000个核苷酸之间的序列。填充序列可以位于盒中的任何所希望的位置，使得它不妨碍载体的功能或活性。

在一些实施方案中，本公开文本的AAV转移盒可以包含内含子序列。与不存在内含子序列时的表达相比，包含内含子序列可以增强表达。在一些中，内含子序列可以增加基因表达，并且不作为转录因子的结合位点。例如，内含子序列可以通过影响转录速率、核输出、和转录物稳定性来提高转录物水平。在一些实施方案中，内含子序列增加mRNA翻译的效率。

在一些实施方案中，内含子序列是杂合序列或嵌合序列。在一些实施方案中，内含子序列分离自或源自SV40、β-珠蛋白、鸡β肌动蛋白、小鼠微小病毒(MVM)、因子IX、和/或人IgG(重链或轻链)中的一种或多种的内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列分离自或源自SV40。在一些实施方案中，内含子序列是嵌合的。在一些实施方案中，内含子序列包含序列SEQ ID NO:3010或SEQ ID NO:3011或者与其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。

内含子序列可以位于转移盒中不干扰AAV载体产生的任何位置。例如，在一些实施方案中，内含子序列可以位于启动子与转基因之间。

在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)转移盒包含5’反向末端重复序列(ITR)、启动子、转基因、聚腺苷酸化信号、和3’ITR。在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)转移盒包含5’反向末端重复序列(ITR)、启动子、内含子序列、转基因、聚腺苷酸化信号、和3’ITR。在一些实施方案中，所述转基因编码所述NPC1蛋白。在一些实施方案中，所述AAV转移盒进一步包含增强子。在一些实施方案中，所述AAV转移盒进一步包含内含子序列。

在一些实施方案中，5’ITR包含序列SEQ ID NO:3003并且3’ITR包含序列SEQ IDNO:3004。在一些实施方案中，所述增强子包含序列SEQ ID NO:3009。在一些实施方案中，所述启动子序列包含序列SEQ ID NO:3005-3008中的任一个。在一些实施方案中，所述内含子序列包含序列SEQ ID NO:3010或3011。在一些实施方案中，所述转基因包含序列SEQ IDNO:3002。在一些实施方案中，所述聚A信号包含序列SEQ ID NO:3012或3013。在一些实施方案中，所述AAV转移盒包含序列SEQ ID NO:3014-3019中的任一个。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、CBA启动子、SV40内含子、编码NPC1蛋白的转基因、SV40聚腺苷酸化信号、和3’ITR。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、GUSB240启动子、嵌合内含子、编码NPC1蛋白的转基因、rBG聚腺苷酸化信号、和3’ITR。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、GUSB379启动子、SV40内含子、编码NPC1蛋白的转基因、rBG聚腺苷酸化信号、和3’ITR。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、GUSB240启动子、嵌合内含子、编码NPC1蛋白的转基因、SV40聚腺苷酸化信号、和3’ITR。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、GUSB240启动子、SV40内含子、编码NPC1蛋白的转基因、SV40聚腺苷酸化信号、和3’ITR。在一些实施方案中，AAV转移盒包含5’ITR、CMV增强子、HSVTK启动子、编码NPC1蛋白的转基因、rBG聚腺苷酸化信号、和3’ITR。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含：包含序列SEQ ID NO:3003的5’ITR、包含序列SEQ ID NO:3005的CBA启动子、包含序列SEQ ID NO:3010的SV40内含子、编码NPC1蛋白(SEQID NO:3001)的转基因、包含SEQ ID NO:3012的SV40聚腺苷酸化信号、和包含序列SEQ IDNO:3004的3’ITR。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含：包含序列SEQ ID NO:3003的5’ITR、包含序列SEQ ID NO:3006的GUSB240启动子、包含SEQ ID NO:3011的嵌合内含子、编码NPC1蛋白(SEQID NO:3001)的转基因、包含SEQ ID NO:3013的rBG聚腺苷酸化信号、和包含序列SEQ IDNO:3004的3’ITR。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含：包含序列SEQ ID NO:3003的5’ITR、包含SEQID NO:3006的GUSB379启动子、包含序列SEQ ID NO:3010的SV40内含子、编码NPC1蛋白(SEQID NO:3001)的转基因、包含SEQ ID NO:3013的rBG聚腺苷酸化信号、和包含序列SEQ IDNO:3004的3’ITR。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含：包含序列SEQ ID NO:3003的5’ITR、包含SEQID NO:3007的GUSB240启动子、包含序列SEQ ID NO:3011的嵌合内含子、编码NPC1蛋白(SEQID NO:3001)的转基因、包含SEQ ID NO:3012的SV40聚腺苷酸化信号、和包含序列SEQ IDNO:3004的3’ITR。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含：包含序列SEQ ID NO:3003的5’ITR、包含SEQID NO:3006的GUSB240启动子、包含序列SEQ ID NO:3010的SV40内含子、编码NPC1蛋白(SEQID NO:3001)的转基因、包含SEQ ID NO:3012的SV40聚腺苷酸化信号、和包含序列SEQ IDNO:3004的3’ITR。

在一些实施方案中，AAV转移盒包含：包含序列SEQ ID NO:3003的5’ITR、CMV增强子、包含SEQ ID NO:3008的HSVTK启动子、编码NPC1蛋白(SEQ ID NO:3001)的转基因、包含SEQ ID NO:3013的rBG聚腺苷酸化信号、和包含序列SEQ ID NO:3004的3’ITR。

在一些实施方案中，核酸包含AAV转移盒。在一些实施方案中，核酸包含转基因，其中所述转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3001。在一些实施方案中，核酸包含转基因，其中所述转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3020。在一些实施方案中，核酸从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR；其中所述转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3001或SEQ ID NO:3020。在一些实施方案中，核酸从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR；其中所述核酸包含内含子序列；其中所述转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3001或SEQ ID NO:3020。在一些实施方案中，核酸从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；鸡β-肌动蛋白启动子；转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR；其中所述转移盒包含内含子序列；其中所述转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3001或SEQ ID NO:3020。在一些实施方案中，核酸从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；内含子序列；转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR；其中所述转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3001或SEQ ID NO:3020。在一些实施方案中，核酸从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；鸡β-肌动蛋白启动子；内含子序列；转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR；其中所述转基因编码氨基酸序列SEQ ID NO:3001或SEQ ID NO:3020。可以使用标准分子生物学技术将本文所述的AAV转移盒掺入载体(例如，质粒或杆粒)中。所述载体(例如，质粒或杆粒)可以进一步包含一种或多种在AAV生产过程中使用的遗传元件，包括例如AAV rep和cap基因，以及辅助病毒蛋白序列。

用于生产病毒载体的方法

本文还提供了生产病毒载体的方法。在一些实施方案中，生产逃避中和抗体的AAV载体的方法包括：a)鉴定接触氨基酸残基，其在AAV衣壳蛋白亚基或蛋白衣壳上形成三维抗原足迹；b)生成AAV衣壳蛋白亚基文库，其包含(a)中鉴定的接触氨基酸残基的氨基酸取代；c)从(b)的AAV衣壳蛋白亚基文库中产生包含衣壳蛋白亚基的AAV颗粒；d)在可以发生感染和复制的条件下使(c)的AAV颗粒与细胞接触；e)选择AAV颗粒，所述AAV颗粒可以完成至少一个感染周期并且复制到与对照AAV颗粒相似的滴度：1)在可以发生感染和复制的条件下使(e)中选择的AAV颗粒与中和抗体和细胞接触；以及g)选择未被(f)的中和抗体中和的AAV颗粒。用于鉴定接触氨基酸残基的方法的非限制性例子包括肽表位作图和/或冷冻电子显微术。

三维抗原足迹内的抗体接触残基的分辨率和鉴定允许通过随机、合理和/或简并诱变对其进行后续修饰，以产生可通过进一步选择和筛选鉴定的逃避抗体的AAV蛋白衣壳和/或衣壳蛋白亚基。

因此，在一些实施方案中，生产逃避中和抗体的AAV载体的方法包括：a)鉴定接触氨基酸残基，其在AAV衣壳蛋白亚基和/或蛋白衣壳上形成三维抗原足迹；b)通过随机、合理和/或简并诱变生成AAV衣壳蛋白亚基，其包含(a)中鉴定的接触氨基酸残基的氨基酸取代；c)从(b)的AAV衣壳蛋白亚基中产生包含衣壳蛋白亚基的AAV颗粒；d)在可以发生感染和复制的条件下使(c)的AAV颗粒与细胞接触；e)选择AAV颗粒，所述AAV颗粒可以完成至少一个感染周期并且复制到与对照AAV颗粒相似的滴度；f)在可以发生感染和复制的条件下使(e)中选择的AAV颗粒与中和抗体和细胞接触；以及g)选择未被(f)的中和抗体中和的AAV颗粒。

用于鉴定接触氨基酸残基的方法的非限制性例子包括肽表位作图和/或冷冻电子显微术。通过随机、合理和/或简并诱变生成包含接触氨基酸残基的氨基酸取代的AAV衣壳蛋白亚基的方法是本领域已知的。

这种综合方法呈现了一种平台技术，所述平台技术可以应用于修饰任何AAV蛋白衣壳和/或衣壳蛋白亚基。这种平台技术的应用产生源自原始AAV衣壳蛋白亚基模板而不损失转导效率的AAV抗原变体。作为一个优点和益处，这种技术的应用将扩大有资格接受AAV载体基因疗法的患者群体。

在一些实施方案中，产生病毒载体的方法包括向细胞提供：(a)包含至少一个TR序列(例如，AAV TR序列)的核酸模板，以及(b)足以复制核酸模板并且衣壳化到AAV蛋白衣壳中的AAV序列(例如，编码AAV衣壳亚基的AAV rep序列和AAV cap序列)。任选地，所述核酸模板进一步包含至少一种异源核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸模板包含两个AAV ITR序列，其位于异源核酸序列(如果存在)的5'和3'，尽管它们不需要直接与其相继。

核酸模板以及AAV rep和cap序列在细胞中产生包含包装在AAV蛋白衣壳内的核酸模板的病毒载体的条件下提供。所述方法可以进一步包括以下步骤：从细胞中收集病毒载体。可以从培养基和/或通过裂解细胞来收集病毒载体。

所述细胞可以是允许AAV病毒复制的细胞。可以使用本领域已知的任何合适细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。作为另一种选择，所述细胞可以是提供复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能的反式互补包装细胞系，例如，293细胞或其他E1a反式互补细胞。

AAV复制和衣壳蛋白亚基序列可以通过本领域已知的任何方法提供。目前的方案典型地在单一质粒上表达AAV rep/cap基因。AAV复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能很方便。AAV rep和/或cap序列可以由任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以由杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入缺失的腺病毒载体的E1a或E3区)。EBV载体也可以用于表达AAV cap和rep基因。这种方法的一个优点是EBV载体是附加型的，但在接连的细胞分裂过程中将维持高拷贝数量(即，作为染色体外元件稳定整合到细胞中，称为“基于EBV的核附加体”，参见Margolski,(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67)。

作为进一步的替代方案，rep/cap序列可以稳定地掺入细胞中。

典型地，AAV rep/cap序列将没有TR侧翼，以防止这些序列的拯救和/或包装。

可以使用本领域已知的任何方法将核酸模板提供给细胞。例如，模板可以由质粒或病毒载体提供。在一些实施方案中，核酸模板由疱疹病毒或腺病毒载体提供(例如，插入缺失的腺病毒的E1a或E3区中)。作为另一个说明，Palombo等人,(1998)J.Virology72:5025描述了携带报告基因的杆状病毒载体，所述报告基因的侧翼是AAV TR。如上文关于rep/cap基因所述，EBV载体也可以用于递送模板。

在一些实施方案中，核酸模板由复制型rAAV病毒提供。在一些实施方案中，包含核酸模板的AAV前病毒被稳定整合到细胞核中。

为了增强病毒滴度，可以向细胞提供促进生产性AAV感染的辅助病毒功能(例如，腺病毒或疱疹病毒)。AAV复制所必需的辅助病毒序列是本领域已知的。典型地，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。可替代地，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一种非病毒或病毒载体提供，例如，作为非感染性腺病毒微型质粒，所述微型质粒携带促进有效AAV生产的所有辅助基因，如Ferrari等人,(1997)Nature Med.3:1295和美国专利号6,040,183和6,093,570所述。

此外，辅助病毒功能可以由具有嵌入染色体中或作为稳定的染色体外元件维持的辅助序列的包装细胞提供。通常，辅助病毒序列不能被包装到AAV病毒粒子中，例如，侧翼没有ITR。

本领域技术人员应当理解，在单一辅助构建体上提供AAV复制和衣壳蛋白亚基序列以及辅助病毒序列(例如，腺病毒序列)可能是有利的。这种辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性说明，辅助构建体可以是包含AAV rep/cap基因的杂合腺病毒或杂合疱疹病毒。

在一些实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体提供。此外，这种载体可以进一步包含核酸模板。AAV rep/cap序列和/或rAAV模板可以插入腺病毒的缺失区域(例如，E1a或E3区)中。

在一些实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体提供。根据此实施方案，可以提供rAAV模板作为质粒模板。

在一些实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体提供，并且rAAV模板作为前病毒整合到细胞中。可替代地，rAAV模板由作为染色体外元件(例如，作为基于EBV的核附加体)维持在细胞内的EBV载体提供。

在一些实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助物提供。rAAV模板可以作为单独的复制型病毒载体提供。例如，rAAV模板可以由rAAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。

根据前述方法，杂合腺病毒载体典型地包含足以进行腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'顺式序列(即，腺病毒末端重复序列和PAC序列)。AAV rep/cap序列和(如果存在)rAAV模板嵌入腺病毒骨架中，并且侧翼是5'和3’顺式序列，使得这些序列可以包装到腺病毒蛋白衣壳中。如上所述，腺病毒辅助序列和AAV rep/cap序列的侧翼通常没有ITR，使得这些序列不被包装到AAV病毒粒子。Zhang等人,((2001)Gene Ther.18:704-12)描述了包含腺病毒以及AAV rep和cap基因两者的嵌合辅助物。

疱疹病毒也可以用作AAV包装方法中的辅助病毒。编码一种或多种AAV Rep蛋白的杂合疱疹病毒可以有利地促进可扩展的AAV载体生产方案。已经描述了表达AAV-2rep和cap基因的I型杂合单纯疱疹病毒(HSV-1)载体(Conway等人,(1999)Gene Therapy 6:986和WO00/17377。

作为进一步的替代方案，可以使用杆状病毒载体在昆虫细胞中产生病毒载体以递送rep/cap基因和rAAV模板，如例如，由Urabe等人,(2002)Human Gene Therapy 13:1935-43所述。

不含污染性辅助病毒的AAV载体原种可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，AAV和辅助病毒可以很容易地基于大小进行区分。基于对肝素底物的亲和力，AAV也可以与辅助病毒分离(Zolotukhin等人(1999)Gene Therapy 6:973)。可以使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，使得任何污染性辅助病毒是无法复制的。作为进一步的替代方案，可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助物，因为只需要腺病毒早期基因表达来介导AAV病毒的包装。晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如，ts100K和ts149腺病毒突变体)。

重组病毒载体

本文所述的病毒载体可用于在体外、离体和体内将核酸递送至细胞。特别地，病毒载体可以有利地用于将核酸递送或转移至动物，包括哺乳动物细胞。因此，在一些实施方案中，所述核酸可以被本文所述蛋白衣壳衣壳化。在一些实施方案中，所述核酸是转移盒。在一些实施方案中，所述转移盒包含载体基因组(例如，5’ITR、转基因、和3’ITR)。在一些实施方案中，所述核酸是AAV转移盒。

由病毒载体递送的转移盒序列可以是任何一种或多种目的异源核酸序列。目的核酸包括编码多肽的核酸，包括治疗性(例如，用于医学或兽医用途)或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽或RNA。在一些实施方案中，所述转移盒包含5’ITR和3’ITR。在一些实施方案中，所述转移盒包含5’ITR、转基因、和3’ITR。在一些实施方案中，所述转基因编码治疗性蛋白或RNA。

治疗性多肽包括但不限囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌营养不良蛋白(包括微型肌营养不良蛋白和微小肌营养不良蛋白，参见例如，Vincent等人,(1993)NatureGenetics 5:130；美国专利公开号2003/017131；国际公开案WO/2008/088895，Wang等人、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:1 3714-13719(2000)；和Gregorevic等人、Mol.Ther.16:657-64(2008))、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、11型激活素可溶性受体、IGF-1、阿朴脂蛋白(诸如apoA(apoA1、apoA2、apoA4、apoA-V)、apoB(apoB100、ApoB48)、apoC(apoCI、apoCII、apoCIII、apoCIV)、apoD、apoE、apoH、apoL、apo(a))、抗炎多肽诸如IκB显性突变体、β-淀粉样蛋白、tau、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)(Tinsley等人、(1996)Nature384:349)、微型抗肌萎缩蛋白相关蛋白、凝血因子(例如，因子VIII、因子IX、因子X等)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、颗粒蛋白前体、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-葡糖脑苷脂酶、battenin、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶A、支链酮酸脱氢酶、弗里德赖希共济失调蛋白(frataxin)、RP65蛋白、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-4、α突触核蛋白、parkin、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子、神经营养因子和激素(例如，促生长素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑衍生的神经营养因子、骨形态发生蛋白[包括RANKL和VEGF]、神经胶质衍生生长因子、转化生长因子-α和-β等)、huntingin、溶酶体酸α-葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-磺基葡糖胺磺基水解酶、α-半乳糖苷酶A、受体(例如，肿瘤坏死生长因子可溶性受体)、S100A1、泛素蛋白连接酶E3、小白蛋白、6型腺苷酸环化酶、调节钙处理的分子(例如，SERCA

任选地，异源核酸编码分泌的多肽(例如，在其天然状态下为分泌多肽或经工程化而被分泌的多肽，例如，通过与本领域已知的分泌信号序列可操作地相关)。

可替代地，在一些实施方案中，异源核酸可以编码反义核酸、核酶(例如，如美国专利号5,877,022中所述)、影响剪接体介导/ram剪接的RNA(参见，Puttaraju等人,(1999)Nature Biotech.17:246；美国专利号6,013,487；美国专利号6,083,702)、干扰RNA(RNAi)(包括介导基因沉默的siRNA、shRNA或miRNA(参见，Sharp等人,(2000)Science 287:2431))、以及其他非翻译RNA，诸如“指导”RNA(Gorman等人,(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:4929；Yuan等人的美国专利号5,869,248)等。示例性非翻译RNA包括针对多药耐药性(MDR)基因产物的RNAi(例如，以治疗和/或预防肿瘤和/或用于施用于心脏以防止被化学疗法造成的损害)、针对肌肉生长抑制素的RNAi(例如，用于杜氏肌营养不良)、针对VEGF的RNAi(例如，以治疗和/或预防肿瘤)、针对受磷蛋白的RNAi(例如，以治疗心血管疾病，参见例如，Andino等人,J.Gene Med.10:132-142(2008)和Li等人,Acta Pharmacol Sin.26:51-55(2005))；受磷蛋白抑制或显性负性分子诸如受磷蛋白S16E(例如，以治疗心血管疾病，参见例如，Hoshijima等人Nat.Med.8:864-871(2002))、针对腺苷激酶的RNAi(例如，用于癫痫)、和针对病原生物体和病毒的RNAi(例如，乙型和/或丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、CMV、单纯疱疹病毒、人类乳突病毒等)。

此外，可以递送指导可变剪接的核酸序列。为了说明，与肌营养不良蛋白外显子51的5'和/或3'剪接位点互补的反义序列(或其他抑制序列)可以与U1或U7小核(sn)RNA启动子结合递送以诱导跳过此外显子。例如，可以将包含位于一个或多个反义/抑制序列的5'的U1或U7 snRNA启动子的DNA序列包装在经修饰的蛋白质衣壳中并且递送。

在一些实施方案中，可以递送指导基因编辑的核酸序列。例如，核酸可以编码指导RNA。在一些实施方案中，指导RNA是包含crRNA序列和tracrRNA序列的单一指导RNA(sgRNA)。在一些实施方案中，核酸可以编码核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是锌指核酸酶、归巢核酸内切酶、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)、NgAgo(agronaute核酸内切酶)、SGN(结构导向核酸内切酶)、RGN(RNA导向核酸酶)，或其经修饰或截短的变体。在一些实施方案中，RNA导向核酸酶是Cas9核酸酶、Cas12(a)核酸酶(Cpf1)、Cas12b核酸酶、Cas12c核酸酶、TrpB样核酸酶、Cas13a核酸酶(C2c2)、Cas13b核酸酶、或其经修饰或截短的变体。在一些实施方案中，Cas9核酸酶分离自或源自化脓性链球菌(S.pyogenes)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)。

在一些实施方案中，可以递送指导基因敲低的核酸序列。例如，核酸序列可以编码siRNA、shRNA、微小RNA或反义核酸。病毒载体还可以包含与宿主染色体上的基因座具有同源性并且与其重组的异源核酸。例如，这种方法可以用来纠正宿主细胞中的遗传缺陷。

还提供了表达免疫原性多肽的病毒载体，例如用于疫苗接种。核酸可以编码本领域已知的任何目的免疫原，包括但不限于来自以下的免疫原：人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、流感病毒、HIV或SIV gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等。

使用细小病毒作为疫苗载体是本领域已知的(参见例如，Miyamura el al,(1994)Proc.Nat.Acad.Sci USA 91:8507；Young等人的美国专利号5,916,563、Mazzara等人的美国专利号5,905,040、美国专利号5,882,652、Samulski等人的美国专利号5,863,541)。抗原可以呈递在细小病毒衣壳中。

可替代地，抗原可以由导入重组载体基因组中的异源核酸表达。在一些实施方案中，如本文所述和/或如本领域已知的任何目的免疫原可以由本文所述的病毒载体提供。

免疫原性多肽可以是适用于引发免疫反应和/或保护受试者免受感染和/或疾病(包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和/或病毒感染和疾病)的任何多肽。例如，免疫原性多肽可以是正粘病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原，诸如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白、或马流感病毒免疫原)或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒免疫原、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)免疫原或人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫原，诸如HIV或SIV包膜GP 160蛋白、HIV或SIV基质/衣壳蛋白、和HIV或SIV gag、pol和env基因产物)。免疫原性多肽也可以是沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒免疫原，诸如拉沙热病毒核衣壳蛋白和拉沙热包膜糖蛋白)、痘病毒免疫原(例如，牛痘病毒免疫原，诸如牛痘LI或L8基因产物)、黄病毒免疫原(例如，黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如，埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒免疫原，诸如NP和GP基因产物)、布尼亚病毒免疫原(例如，RVFV、CCHF和/或SFS病毒免疫原)、或冠状病毒免疫原(例如，传染性人类冠状病毒免疫原，诸如人类冠状病毒包膜糖蛋白、或猪传染性胃肠炎病毒免疫原、或禽类传染性支气管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽还可以是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原(例如，CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等)免疫原、和/或本领域现在已知或以后鉴定为免疫原的任何其他疫苗免疫原。

可替代地，免疫原性多肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌抗原在癌细胞表面上表达。

示例性癌症和肿瘤细胞抗原描述于S.A.Rosenberg(Immunity 10:281(1991))中。其他示例性癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、半胱氨酸蛋白酶-8、KΙΑA0205、HPVE、SART-1、FRAME、p15、黑素瘤肿瘤抗原(Kawakami等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515；Kawakami等人,(1994)J.Exp.Med.,180:347；Kawakami等人,(1994)Cancer Res.54:3124)、MART-1、gp100、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、酪氨酸酶(Brichard等人,(1993)J Exp.Med.178:489)；HER-2/neu基因产物(美国专利号4.968.603)、CA 125、LK26、FB5(内唾液酸)、TAG 72、AFP、CA 19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN(唾液酸Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受体、乳脂球蛋白、p53肿瘤抑制蛋白(Levine,(1993)Ann.Rev.Biochem.62:623)；粘蛋白抗原(国际专利公开号WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头状瘤病毒抗原；和/或现在已知或以后发现与以下癌症相关的抗原：黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌和现在已知或以后鉴定的任何其他癌症或其恶性病症或转移(参见例如，Rosenberg,(1996)Ann.Rev.Med.47:481-91)。

作为进一步的替代方案，异源核酸可以编码在体外、离体或体内在细胞中理想地产生的任何多肽。例如，可以将病毒载体引入培养的细胞并且从其中分离出表达的基因产物。

本领域技术人员应理解，一种或多种目的异源核酸可以与适当的控制序列可操作地关联。例如，异源核酸可以与表达控制元件可操作地关联，所述表达控制元件诸如转录/翻译控制信号、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等。

此外，一种或多种目的异源核酸的调节表达可以实现转录后水平，例如，通过经由选择性阻断在特定位点的剪接活性的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物的存在或不存在来调节不同内含子的选择性剪接(例如，如WO 2006/119137中所述)。

本领域技术人员应当理解，可以使用多种启动子/增强子元件，这取决于所希望的水平和组织特异性表达。启动子/增强子可以是组成型的或诱导型的，这取决于所希望的表达模式。启动子/增强子可以是天然的或外来的，并且可以是天然或合成序列。外来旨在表示在引入转录起始区的野生型宿主中未发现转录起始区。

在一些实施方案中，启动子/增强子元件可以对于靶细胞或待治疗的受试者而言是天然的。在一些实施方案中，启动子/增强子元件可以对于异源核酸序列而言是天然的。通常选择启动子/增强子元件，使得其在一种或多种目的靶细胞中起作用。此外，在一些实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型的或诱导型的。

诱导型表达控制元件典型地在希望提供对一个或多个异源核酸序列的表达的调节的那些应用中是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心脏、骨骼和/或平滑肌特异性或优选的)、神经组织特异性或优选的(包括脑特异性或优选的)、眼特异性或优选的(包括视网膜特异性和角膜特异性)、肝脏特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾特异性或优选的、和肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。

在其中一个或多个异源核酸序列被转录并且然后在靶细胞中翻译的一些实施方案中，通常包括特异性起始信号以有效翻译插入的蛋白质编码序列。可包括ATG起始密码子和相邻序列的这些外源翻译控制序列可以是多种来源的，包括天然的和合成的。

本文所述的病毒载体提供了一种用于将异源核酸递送到大范围细胞(包括分裂细胞和非分裂细胞)中的手段。病毒载体可以用于在体外将目的核酸递送至细胞，例如，以在体外产生多肽或用于离体基因疗法。病毒载体另外可用于向有需要的受试者递送核酸例如以表达免疫原性或治疗性多肽或功能性RNA的方法。以这种方式，可以在受试者体内产生多肽或功能性RNA。受试者可能需要所述多肽，因为受试者缺乏所述多肽。此外，可以实践所述方法，因为受试者中多肽或功能性RNA的产生可以赋予一些有益的效果。

病毒载体也可以用于在培养细胞或受试者中生产目的多肽或功能性RNA(例如，使用受试者作为生物反应器来生产多肽或观察功能性RNA对受试者的作用，例如，关于筛选方法)。

通常，本文所述的病毒载体可以用于递送编码多肽或功能性RNA的异源核酸，以治疗和/或预防递送治疗性多肽或功能性RNA有益的任何疾病状态。说明性疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和其他肺部疾病、血友病A(因子VIII)、血友病B(因子IX)、地中海贫血(β-珠蛋白)、贫血(促红细胞生成素)和其他血液障碍。阿尔茨海默病(GDF；脑啡肽酶)、多发性硬化症(β-干扰素)、帕金森病(神经胶质细胞系衍生的神经营养因子[GDNF])、亨廷顿病(用于去除重复的RNAi)、卡纳万病、肌萎缩侧索硬化症、癫痫(甘丙肽、神经营养因子)和其他神经系统障碍、癌症(内皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS-配体、包括干扰素在内的细胞因子；RNAi(包括针对VEGF的RNAi)或多药耐药性基因产物、mir-26a[例如，用于肝细胞癌])、糖尿病(胰岛素)、肌营养不良，包括杜氏(肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、胰岛素样生长因子I、肌聚糖[例如，α、β、γ]、针对肌肉抑制性肌肉生长抑制素前肽的RNAi、卵泡抑素、II型激活素可溶性受体、抗炎多肽诸如IκB显性突变体、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白、微型抗肌萎缩蛋白相关蛋白、针对肌营养不良蛋白基因中的剪接点的反义或RNAi以诱导跳过外显子[参见例如，WO/2003/095647]、针对U7snRNA的反义以诱导跳过外显子[参见例如，WO/2006/021724]、和针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段)以及贝克肌营养不良1或2、面肩胛肱型肌营养不良(FSHD)、戈谢病(葡糖脑苷脂酶)、贺勒氏病(a-L-艾杜糖醛酸酶)、腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)、糖原贮积病(例如，法布里病[a-半乳糖苷酶]和庞贝病[溶酶体酸α-葡糖苷酶])和其他代谢障碍、先天性肺气肿(α-1-抗胰蛋白酶)、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhansyndrome)(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)、尼曼-皮克病(鞘磷脂酶)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)(溶酶体氨基己糖苷酶A)、额颞叶痴呆、枫糖尿症(支链酮酸脱氢酶)、视网膜变性疾病(以及其他眼睛和视网膜疾病；例如，黄斑变性的PDGF和/或血管生成抑制蛋白或其他VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂来治疗/预防视网膜障碍，例如在I型糖尿病中)、实体器官诸如脑的疾病(包括帕金森病[GDNF]、星形细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi]、肝脏、肾脏、心脏，包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(PAD)(例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂I(I-1)及其片段(例如，IlC)、serca2a、调节受磷蛋白基因的锌指蛋白、Barkct、[32-肾上腺素能受体、2-肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1、小白蛋白、6型腺苷酸环化酶、影响2型G蛋白偶联受体激酶敲低的分子诸如截短的组成型活性bARKct；calsarcin、针对受磷蛋白的RNAi；受磷蛋白抑制或显性负性分子诸如受磷蛋白S16E等)、关节炎(胰岛素样生长因子)、关节障碍(胰岛素样生长因子1和/或2)、内膜增生(例如，通过递送enos、inos)、改善心脏移植的存活(超氧化物歧化酶)、AIDS(可溶性CD4)、肌肉虚耗(胰岛素样生长因子I)、肾虚(促红细胞生成素)、贫血(促红细胞生成素)、关节炎(抗炎因子，诸如I RAP和TNFa可溶性受体)、肝炎(a-干扰素)、LDL受体缺乏(LDL受体)、高氨血症(鸟氨酸转氨甲酰酶)、克拉伯病(半乳糖脑苷脂酶)、巴腾病、脊髓脑性共济失调(包括SCA1、SCA2和SCA3)、苯丙酮尿(苯丙氨酸羟化酶)、自身免疫性疾病等。本文公开的组合物和方法可以进一步用于器官移植后以增加移植的成功率和/或减少器官移植或辅助疗法的负面副作用(例如，通过施用免疫抑制剂或抑制性核酸来阻断细胞因子的产生)。作为另一个例子，骨形态发生蛋白(包括BNP 2、7等，RANKL和/或VEGF)可以与骨同种异体移植物一起施用，例如，在癌症患者的中断期或手术切除之后。

在一些实施方案中，本文所述的病毒载体可以用于递送编码多肽或功能性RNA的异源核酸，以治疗和/或预防肝脏疾病或障碍。肝脏疾病或障碍可以是例如原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、自身免疫性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、纤维化、黄疸、原发性硬化胆管炎(PSC)、布加综合征、血色素沉着症、威尔逊氏病、酒精性纤维化、非酒精性纤维化、肝脂肪变性、吉尔伯特综合征、胆道闭锁、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、阿拉吉尔综合征(alagille syndrome)、进行性家族性肝内胆汁淤积症、血友病B、遗传性血管性水肿(HAE)、纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)、冯吉尔克氏病(Von Gierke's Disease)(GSD I)、血友病A、甲基丙二酸血症、丙酸血症、高胱胺酸尿症、苯丙酮尿(PKU)、1型酪氨酸血症、精氨酸酶1缺乏症、精氨酸琥珀酸裂解酶缺乏症、氨基甲酰磷酸合成酶1缺乏症、1型瓜氨酸血症、希特林蛋白(citrin)缺乏症、1型克里格勒-纳贾尔综合征(Crigler-Najjar syndrome)、胱氨酸病、法布里病、糖原贮积病1b、LPL缺乏症、N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症、鸟氨酸移位酶缺乏症、1型原发性高草酸尿症、或ADA SCID。

本文所述的组合物和方法也可以用于生产诱导多能干细胞(iPS)。例如，本文所述的病毒载体可以用于将一种或多种干细胞相关核酸递送至非多能细胞，诸如成体成纤维细胞、皮肤细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、脂肪细胞、心脏细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞等。

编码与干细胞相关的因子的核酸是本领域已知的。与干细胞和多能性相关的此类因子的非限制性例子包括Oct-3/4、SOX家族(例如，SOX 1、SOX2、SOX3和/或SOX 15)、Klf家族(例如，Klfl、KHZ Klf4和/或Klf5)、Myc家族(例如，C-myc、L-myc和/或N-myc)、NANOG和/或LIN28。

本文所述的方法还可以被实践以治疗和/或预防代谢障碍，诸如糖尿病(例如，胰岛素)、血友病(例如，因子IX或因子VIII)、溶酶体贮积障碍诸如粘多糖贮积障碍(例如，Sly综合征[β-葡萄糖醛酸酶]、贺勒氏综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、施艾氏综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、贺勒-施艾氏综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏综合征[艾杜糖酸硫酸酯酶]、圣菲利柏氏综合征A[乙酰肝素磺胺酶]、B[N-乙酰氨基葡萄糖苷酶]、C[乙酰辅酶A:α-氨基葡糖苷乙酰转移酶]、D[N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶]、莫基奥综合征A[半乳糖-硫酸硫酸酯酶]、B[β-半乳糖苷酶]、马洛托-拉米氏综合征[N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等)、法布里病(α-半乳糖苷酶等)、戈谢病(葡糖脑苷脂酶等)、或糖原贮积障碍(例如，庞贝病；溶酶体酸α-葡糖苷酶)。

基因转移对于理解疾病状态和提供疗法具有潜在的用途。有许多遗传性疾病，其中有缺陷的基因是已知的并且被克隆。通常，上述疾病状态分为两类：通常是酶的缺乏状态，其通常以隐性方式遗传；不平衡状态，其可能涉及调节或结构蛋白，并且典型地以显性方式遗传。对于缺乏状态疾病，基因转移可以用于将正常基因带入受影响的组织以进行替代疗法，以及使用反义突变创建疾病的动物模型。对于不平衡的疾病状态，基因转移可以用于在模型系统中创建疾病状态，其然后可以致力于用于对抗疾病状态。因此，本文所述的病毒载体允许治疗和/或预防遗传疾病。

本文所述的病毒载体还可以用于在体外或体内向细胞提供功能性RNA。功能性RNA可以是例如非编码RNA。在一些实施方案中，细胞中功能性RNA的表达可以降低细胞对特定靶蛋白的表达。因此，可以施用功能性RNA以降低有需要的受试者中特定蛋白的表达。在一些实施方案中，细胞中功能性RNA的表达可以增加细胞对特定靶蛋白的表达。因此，可以施用功能性RNA以增加有需要的受试者中特定蛋白的表达。在一些实施方案中，功能性RNA的表达可以调节细胞中特定靶RNA的剪接。因此，可以施用功能性RNA来调节有需要的受试者中特定RNA的剪接。在一些实施方案中，细胞中功能性RNA的表达可以调节细胞对特定靶蛋白的功能。因此，可以施用功能性RNA以调节有需要的受试者中特定蛋白的功能。功能性RNA也可以在体外施用于细胞以调节基因表达和/或细胞生理学，例如，以优化细胞或组织培养系统或筛选方法。

另外，如本文所述的病毒载体可用于诊断和筛选方法，由此目的核酸在细胞培养系统或可替代地转基因动物模型中瞬时或稳定表达。

病毒载体也可以用于各种非治疗目的，包括但不限于用于评估基因靶向、清除、转录、翻译等的方案，这对本领域技术人员来说是显而易见的。病毒载体也可以用于评估安全性目的(传播、毒性、免疫原性等)。例如，美国食品和药物管理局(United States Food andDrug Administration)在评估临床功效之前将此类数据视为监管批准过程的一部分。

在一些实施方案中，病毒载体可以用于在受试者中产生免疫反应。根据此实施方案，可以将包含编码免疫原性多肽的异源核酸序列的病毒载体施用于受试者，并且受试者产生针对免疫原性多肽的主动免疫反应。免疫原性多肽如上文所述。在一些实施方案中，引发保护性免疫反应。

可替代地，可以将病毒载体离体施用于细胞，并且将改变的细胞施用于受试者。将包含异源核酸的病毒载体引入细胞中，并且将细胞施用于受试者，其中可以表达编码免疫原的异源核酸并且在受试者中诱导针对免疫原的免疫反应。在一些实施方案中，细胞是抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)。

“主动免疫反应”或“主动免疫”的特征是“在遇到免疫原后参与宿主组织和细胞。它涉及淋巴网状组织中免疫活性细胞的分化和增殖，这会导致抗体的合成或细胞介导的反应性的发展，或两者兼而有之”。Herbert B.Herscowitz,Immunophysiology:CellFunction and Cellular Interactions in Antibody Formation,IMMUNOLOGY:BASICPROCESSES 117(Joseph A.Bellanti编辑,1985)。可替代地说，宿主在通过感染或疫苗接种暴露于免疫原后引发主动免疫反应。主动免疫可以与被动免疫形成对比，被动免疫是通过将预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白细胞介素-2)从主动免疫的宿主转移到非免疫宿主而获得的。

如本文所用，“保护性”免疫反应或“保护性”免疫表明免疫反应赋予受试者一些益处，因为它预防或降低疾病的发生率。可替代地，保护性免疫反应或保护性免疫可用于治疗和/或预防疾病，特别是癌症或肿瘤(例如，通过预防癌症或肿瘤形成，通过引起癌症或肿瘤的消退和/或通过预防转移和/或通过防止转移性结节的生长)。保护作用可以是完全的或部分的，只要治疗的益处大于其任何缺点。

在一些实施方案中，包含异源核酸的病毒载体或细胞可以以免疫原有效量施用，如下所述。

在一些实施方案中，病毒载体可以通过施用表达一种或多种癌细胞抗原(或免疫学上相似的分子)或产生针对癌细胞的免疫反应的任何其他免疫原的病毒载体来施用，用于癌症免疫疗法。为了说明，可以通过施用包含编码癌细胞抗原的异源核酸的病毒载体在受试者中产生针对癌细胞抗原的免疫反应，例如以治疗患有癌症的患者和/或预防受试者发展癌症。病毒载体可以在体内或通过使用离体方法施用于受试者，如本文所述。

可替代地，癌抗原可以表达为衣壳蛋白亚基的一部分，或以其他方式关联蛋白衣壳(例如，如上所述)。

作为另一个替代方案，可以施用本领域已知的任何其他治疗性核酸(例如，RNAi)或多肽(例如，细胞因子)以治疗和/或预防癌症。

如本文所用，术语“癌症”涵盖形成肿瘤的癌症。同样，术语“癌组织”涵盖肿瘤。“癌细胞抗原”涵盖肿瘤抗原。

术语“癌症”在本领域具有其理解的含义，例如，具有扩散到身体远处部位(即，转移)的潜力的不受控制的组织生长。示例性癌症包括但不限于黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌和现在已知或以后鉴定的任何其他癌症或恶性病症。在一些实施方案中，提供了一种治疗和/或预防形成肿瘤的癌症的方法。

术语“肿瘤”在本领域也被理解为，例如，在多细胞生物体中的未分化细胞的异常团块。肿瘤可以是恶性的或良性的。在一些实施方案中，本文公开的方法用于预防和治疗恶性肿瘤。

术语“治疗癌症”、“癌症的治疗”和等同术语旨在表示降低或至少部分消除癌症的严重程度和/或减缓和/或控制疾病的进展和/或使疾病稳定。在一些实施方案中，这些术语表明癌症的转移被阻止或减少或被至少部分地消除和/或转移结节的生长被阻止或减少或被至少部分地消除。

通过术语“癌症的预防”或“预防癌症”和等效术语旨在表明方法至少部分地消除或减少和/或延迟癌症发作的发生率和/或严重程度。可替代地说，受试者的癌症发作可以降低可能性或概率和/或延迟。

在一些实施方案中，可以从患有癌症的受试者中取得细胞并且与如本文所述的表达癌细胞抗原的病毒载体接触。然后将经修饰的细胞施用于受试者，由此引发针对癌细胞抗原的免疫反应。这种方法可以有利地用于免疫功能低下的受试者，所述受试者无法在体内产生足够的免疫反应(即，无法产生足够量的增强抗体)。

本领域已知免疫反应可以通过免疫调节细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白细胞介素-1-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、和淋巴毒素)来增强。因此，免疫调节细胞因子(优选地，CTL诱导细胞因子)可以与病毒载体结合施用于受试者。可以通过本领域已知的任何方法施用细胞因子。可以将外源细胞因子施用于受试者，或者可替代地，可以使用合适的载体将编码细胞因子的核酸递送给受试者，并且在体内产生细胞因子。

受试者、药物配制品和施用方式

如本文所述的病毒载体和病毒样颗粒可用于兽医应用和医学应用两者。合适的受试者包括禽类和哺乳动物两者。如本文所用，术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、野鸡、鹦鹉、长尾小鹦鹉等。如本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人类、非人类灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬类、兔形动物等。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年、成人和老年受试者。

在一些实施方案中，受试者“需要”本文所述的方法。

在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含在药学上可接受的载体中的病毒载体和/或病毒样颗粒，以及任选地其他药剂、药学药剂、稳定剂、缓冲剂、载体、佐剂、稀释剂等。对于注射，载体将典型地是液体。对于其他施用方法，载体可以是固体或液体。对于吸入施用，载体将是可吸入的，并且任选地可以呈固体或液体微粒形式。

“药学上可接受的”意指非毒性或在其他方面不希望的材料，即所述材料可以施用于受试者，而不引起任何不希望的生物效应。

本文还提供了将核酸体外转移至细胞的方法。根据适用于特定靶细胞的标准转导方法，可以将病毒载体以适当的感染复数引入细胞。待施用的病毒载体的滴度可以根据靶细胞类型和数量以及特定的病毒载体而变化，并且可以由本领域技术人员在没有过度实验的情况下确定。在一些实施方案中，至少约10

引入病毒载体的一种或多种细胞可以是任何类型的，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞，诸如神经元和少突胶质细胞)、肺细胞、眼细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞、和角膜细胞)、上皮细胞(例如，肠道和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或膈肌细胞)、树突状细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如，骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等。在一些实施方案中，所述细胞可以是任何祖细胞。作为进一步的可能性，所述细胞可以是干细胞(例如，神经干细胞、肝干细胞)。作为再又一个替代方案，所述细胞可以是癌症或肿瘤细胞。此外，所述细胞可以来自任何来源的物种，如上所指示。

可以将病毒载体在体外引入细胞中，用于将经修饰的细胞施用于受试者的目的。在一些实施方案中，从受试者体内取得细胞，将病毒载体引入回其中，并且然后将细胞重新施用于受试者。从受试者取得细胞以进行离体操纵，然后引入回受试者的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利号5,399,346)。可替代地，可以将重组病毒载体引入来自供体受试者的细胞、培养的细胞、或来自任何其他合适来源的细胞中，并且将细胞施用于有需要的受试者(即，“受体”受试者)。

用于离体核酸递送的合适细胞如上所述。施用于受试者的细胞的剂量将根据受试者的年龄、状况和物种、细胞类型、细胞表达的核酸、施用方式等而变化。典型地，每剂将施用在药学上可接受的载体中至少约10

在一些实施方案中，将病毒载体引入细胞中，并且可以将细胞施用于受试者以引发针对所递送的多肽(例如，表达为转基因或在蛋白质衣壳中)的免疫原性反应。典型地，与药学上可接受的载体组合施用一定量的表达免疫原有效量的多肽的细胞。“免疫原有效量”是表达的多肽的量，其足以在施用药物配制品的受试者中引起针对多肽的主动免疫反应。在一些实施方案中，剂量足以产生保护性免疫反应(如上定义)。所赋予的保护程度不需要是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处超过其任何缺点即可。

因此，在一些实施方案中，向细胞施用核酸的方法包括使细胞与如本文所述的病毒载体、病毒颗粒和/或组合物接触。

本文还提供了将如本文所述的病毒载体、病毒颗粒和/或病毒样颗粒施用于受试者的方法。在一些实施方案中，向受试者递送核酸的方法包括向受试者施用本文所述的病毒颗粒、病毒载体和/或组合物。可以通过本领域已知的任何手段将病毒载体、病毒颗粒和/或病毒样颗粒施用于有需要的人类受试者或动物。任选地，病毒载体、病毒颗粒和/或病毒样颗粒以有效剂量在药学上可接受的载体中递送。在一些实施方案中，递送有效量的病毒载体、病毒颗粒和/或病毒样颗粒。

可以进一步施用本文所述的病毒载体和/或病毒样颗粒以引发免疫原性反应(例如，作为疫苗)。典型地，免疫原性组合物包含与药学上可接受的载体组合的免疫原有效量的病毒载体和/或病毒样颗粒。任选地，剂量足以产生保护性免疫反应(如上定义)。所赋予的保护程度不需要是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处超过其任何缺点即可。受试者和免疫原如上所述。

待施用于受试者的病毒载体和/或病毒样颗粒的剂量取决于施用方式、待治疗和/或预防的疾病或病症、个体受试者的状况、特定的病毒载体或蛋白质粒以及待递送的核酸等，并且可以以常规方式确定。在一些实施方案中，重组AAV的剂量是有效剂量。示例性有效剂量可以是例如至少约10

在一些实施方案中，多于一次施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)可以用于在不同间隔(例如，每天、每周、每月、每年等)的时间段内达到所希望的基因表达水平。

示例性施用方式包括口服、直肠、透粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、经颊(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内[包括对骨骼、膈肌和/或心肌的施用]、皮内、胸膜内、大脑内和关节内)、外用(例如，对皮肤和粘膜表面，包括气道表面，以及透皮施用)、淋巴内等，以及直接组织或器官注射(例如，对肝脏、骨骼肌、心肌、膈肌或脑)。也可以施用于肿瘤(例如，在肿瘤或淋巴结中或附近)。在任何给定的情况下，最合适的途径将取决于所治疗和/或预防的病症的性质和严重程度以及所使用的特定载体的性质。

施用于骨骼肌包括但不限于施用于四肢(例如，上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如，舌头)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或手指(脚趾)中的骨骼肌。合适的骨骼肌包括但不限于小指外展肌(手部)、小趾外展肌(足部)、拇外展肌、第五跖骨外展肌、拇短外展肌、拇长外展肌、短收肌、内收拇趾肌(adductor hallucis)、长收肌、大收肌、内收拇指肌(adductor pollicis)、肘肌、前斜角肌、膝关节肌、肱二头肌、股二头肌、肱肌、肱桡肌、颊肌、喙肱肌、皱眉肌、三角肌、降口角肌、降下唇肌、二腹肌、背侧骨间肌(手部)、背侧骨间肌(足部)、桡侧腕短伸肌、桡侧腕长伸肌、尺侧腕伸肌、小指伸肌、指伸肌、趾短伸肌、趾长伸肌、拇短伸肌、拇长伸肌、示指伸肌、拇短伸肌、拇长伸肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、小指短屈肌(手部)、小指短屈肌(足部)、趾短屈肌、指长屈肌、指深屈肌、指浅屈肌、拇短屈肌、拇长屈肌、拇长屈肌、拇短屈肌(flexor pollicis brevis)、拇长屈肌(flexor pollicislongus)、前额肌、腓肠肌、颏舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、股薄肌、颈髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、髂肌、下孖肌、下斜肌、下直肌、冈下肌、棘间肌、横突间肌、翼外侧肌、外直肌、背阔肌、口角提肌、上唇提肌、上唇鼻翼提肌、上睑提肌、肩胛提肌、长回旋肌、头长肌、颈长肌、蚓状肌(手部的颈最长肌)、蚓状肌(足部)、咬肌、翼内肌、内直肌、中斜角肌、多裂肌、下颌舌骨肌、头斜下肌、头斜上肌、闭孔外肌、闭孔内肌、枕肌、肩胛舌骨肌、小指(趾)对向肌、拇对面肌、眼轮匝肌、口轮匝肌、骨间掌侧肌、掌短肌、掌长肌、耻骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨长肌、第三腓骨肌、梨状肌、足底骨间肌、跖肌、颈阔肌、腘肌、后斜角肌、旋前方肌、旋前圆肌、腰大肌、股方肌、跖方肌、头前直肌、头侧直肌、头后大直肌、头后小直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、缝匠肌、小斜角肌、半膜肌、头半棘肌、颈半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、前锯肌、短回旋肌、比目鱼肌、头棘肌、颈棘肌、胸棘肌、头夹肌、颈夹肌、胸锁乳突肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、茎突舌骨肌、锁骨下肌、肩胛下肌、上孖肌、上斜肌、上直肌、旋后肌、冈上肌、颞肌、阔筋膜张肌、大圆肌、小圆肌、胸肌、甲状舌骨肌、胫骨前肌、胫骨后肌、斜方肌、肱三头肌、股中间肌、股外侧肌、股内侧肌、颧大肌和颧小肌以及如本领域已知的任何其他合适的骨骼肌。

病毒载体和/或病毒样颗粒可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的分离的肢体灌注；参见例如，Arruda等人,(2005)Blood 105:3458-3464)和/或直接肌内注射递送至骨骼肌。在一些实施方案中，通过肢体灌注，任选地分离的肢体灌注(例如，通过静脉内或关节内施用)，将病毒载体和/或病毒样颗粒施用于受试者(例如，患有肌营养不良诸如杜氏肌营养不良(DMD)或肢带型肌营养不良(LGMD)的受试者)的肢体(手臂和/或腿)。在一些实施方案中，可以在不使用“流体动力学”技术的情况下有利地施用病毒载体和/或病毒样颗粒。现有技术载体的组织递送(例如，到肌肉)通常通过流体动力学技术(例如，静脉内/大体积的静脉内施用)来增强，这增加了脉管系统中的压力并且促进了载体穿过内皮细胞屏障的能力。在一些实施方案中，病毒载体和/或病毒样颗粒可以在不存在流体动力学技术诸如大体积输注和/或升高的血管内压(例如，大于正常收缩压，例如，相对于正常收缩压血管内压的增加小于或等于5％、10％、15％、20％、25％)的情况下施用。这样的方法可以减少或避免与流体动力学技术相关的副作用，诸如水肿、神经损害和/或隔室综合征。施用于心肌包括施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。病毒载体和/或病毒样颗粒可以通过静脉内施用、动脉内施用诸如主动脉内施用、直接心脏注射(例如，注射到左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注递送至心肌。

可以通过任何合适的方法施用于膈肌，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。

向靶组织的递送也可以通过递送包含病毒载体和/或病毒样颗粒的贮库来实现。如本文所述,“贮库”的递送是指施用持续作用配制品，所述持续作用配制品允许病毒缓慢释放和/或逐渐传播的，使得病毒可以比标准注射的可能情况作用更长的时间段。在一些实施方案中，将包含病毒载体和/或病毒样颗粒的贮库植入骨骼、心脏和/或膈肌组织中，或者可以使组织与包含病毒载体和/或病毒样颗粒的膜或其他基质接触。此类可植入基质或基底描述在美国专利号7,201,898中。

在一些实施方案中，病毒载体和/或病毒样颗粒根据施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如，以治疗和/或预防肌营养不良、心脏病[例如，PAD或充血性心力衰竭])。

在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或膈肌的疾病或障碍。肌肉的疾病或障碍可以是例如肌营养不良、肌病、运动神经元病和心肌病。肌肉的疾病或障碍可以是，例如，肌营养不良病、杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、肌强直性营养不良(例如，肌强直性营养不良1和2)、面肩胛肱型肌营养不良(FDHD)、埃默里-德赖弗斯肌营养不良(Eimery-Dreifuss muscular dystrophy)、肢带型疾病、面肩胛肱型肌营养不良、眼咽肌营养不良、远端肌营养不良、先天性肌营养不良、青少年黄斑营养不良、中央核性肌病、中央核心肌病和包涵体肌炎。

在一些实施方案中，提供了一种治疗和/或预防有需要的受试者的肌营养不良的方法，所述方法包括：其中所述病毒载体包含异源核酸，所述异源核酸编码肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、微小肌营养不良蛋白、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、II型激活素可溶性受体、IGF-1、抗炎多肽诸如IκB显性突变体、sarcospan、抗肌萎缩蛋白相关蛋白、微小肌营养不良蛋白、层粘连蛋白-a2、α-肌聚糖、β-肌聚糖、γ-肌聚糖、δ-肌聚糖、IGF-1、针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段、和/或针对肌肉生长抑制素的RNAi。在一些实施方案中，可以将病毒载体施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌，如本文别处所述。

可替代地，可以实践本文所述的方法以将核酸递送至骨骼肌、心肌或膈肌，所述骨骼肌、心肌或膈肌用作产生多肽(例如，酶)或功能性RNA(例如，RNAi、微小RNA、反义RNA)的平台，所述多肽或功能性RNA通常在血液中循环或用于全身递送至其他组织以治疗和/或预防疾病(例如，代谢障碍，诸如糖尿病[例如，胰岛素]、血友病[例如，因子IX或因子VIII]、粘多糖[例如，Sly综合征、贺勒氏综合征(Hurler Syndrome)、施艾氏综合征、贺勒-施艾氏综合征、亨特氏综合征、圣菲利柏氏综合征A、B、C、D、莫基奥综合征、马洛托-拉米氏综合征等]或溶酶体贮积障碍诸如戈谢病[葡糖脑苷脂酶]或法布里病[a-半乳糖苷酶A]或糖原贮积障碍诸如庞贝病[溶酶体酸α葡糖苷酶])。本文描述了用于治疗和/或预防代谢障碍的其他合适的蛋白质。在美国专利公开案US 2002/0192189中描述了使用肌肉作为平台来表达目的核酸。

在一些实施方案中，治疗和/或预防有需要的受试者的代谢障碍的方法包括向受试者的骨骼肌施用治疗或预防有效量的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码多肽的异源核酸，其中所述代谢障碍是多肽缺乏和/或缺陷的结果。本文描述了示例性代谢障碍和编码多肽的异源核酸。任选地，分泌多肽(例如，在其天然状态下为分泌多肽或经工程化而被分泌的多肽，例如，通过与本领域已知的分泌信号序列可操作地相关)。不受任何特定理论的限制，根据此实施方案，施用于骨骼肌可以导致多肽分泌到全身循环中并且递送至一种或多种靶组织。本文更详细地描述了将病毒载体递送至骨骼肌的方法。

本文所述的方法还可以被实践用于产生非编码RNA，诸如反义RNA、RNAi或其他功能性RNA(例如，核酶)，用于全身递送。

在一些实施方案中，用于治疗和/或预防有需要的受试者的先天性心力衰竭或PAD的方法包括向哺乳动物受试者施用治疗或预防有效量的病毒载体，其中所述病毒载体包含异源核酸，所述异源核酸编码例如，肌浆内网膜Ca

注射剂可以制备呈常规形式(作为液体溶液或混悬剂)、在注射前适用于液体溶液或混悬剂的固体形式、或作为乳剂。可替代地，可以以局部而非全身方式(例如，以贮库或缓释配制品)施用病毒载体和/或病毒样颗粒。此外，病毒载体和/或病毒样颗粒可以递送粘附到可手术植入的基质上(例如，如美国专利公开号US-2004-0013645-A1中所述)。

本文公开的病毒载体和/或病毒样颗粒可以通过任何合适的手段施用于受试者的肺，任选地通过施用受试者吸入的由病毒载体和/或病毒样颗粒构成的可吸入颗粒的气雾剂混悬剂。可吸入颗粒可以是液体或固体。包含病毒载体和/或病毒样颗粒的液体颗粒气雾剂可以通过任何合适的手段产生，诸如用如本领域技术人员已知的压力驱动气雾剂雾化器或超声雾化器。参见例如，美国专利号4,501,729。包含病毒载体和/或病毒样颗粒的固体颗粒气雾剂同样可以通过制药领域已知的技术用任何固体微粒药剂气雾剂发生器产生。

可以将病毒载体和病毒样颗粒施用于CNS组织(例如，脑、眼)，并且可以有利地导致与在不存在本文所述组合物和方法的情况下观察到的情况相比更宽的病毒载体或病毒样颗粒分布。

在一些实施方案中，可以施用本文所述的病毒载体以治疗CNS疾病，包括遗传障碍、神经变性障碍、精神障碍和肿瘤。说明性的CNS疾病包括但不限于肾上腺髓质神经病(AMN)、阿尔茨海默病、安格尔曼综合征(Angelman syndrome)、额颞叶痴呆、帕金森病、亨廷顿病、脆性X综合征、卡纳万病、利氏病(Leigh's disease)、雷夫叙姆病、抽动秽语综合征(Tourette syndrome)、原发性侧脑硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、进行性肌萎缩症、皮克病、肌营养不良、多发性硬化症、重症肌无力、宾斯旺格病(Binswanger’s disease)、由脊髓或头部损伤引起的创伤、泰-萨二氏病(GM2神经节苷脂沉积症)、莱施-奈恩综合征、MC4R肥胖症、异染性脑白质营养不良(MLD)、MPS I(贺勒/施艾氏)、MPS IIIA(圣菲利柏氏A)、尼曼匹克C1、雷特氏综合征、脊髓性肌肉萎缩症(SMA)、AADC缺乏症、单基因性肌萎缩侧索硬化症(ALS)、α甘露糖苷过多症、天冬氨酰氨基葡萄糖尿症、Dravet综合征、巨轴突神经病变、球状细胞白质营养不良(Krabbe)、Glut 1缺乏症、GM1神经节苷脂沉积症、婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症(INCL，Batten)、青少年神经元蜡样脂褐质沉积症(JNCL、Batten)、幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症(JNCL、Batten)、晚期婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症(LINCL，Batten)、MPS II(Hunter)、MPS IIIB(圣菲利柏氏B)、MPS IIIC(圣菲利柏氏C)、MPS IVA(莫基奥综合征)、MPS VI(马洛托-拉米氏综合征)、过氧化物酶体生物发生障碍(泽尔韦格氏综合征(Zellweger syndrome)谱)、桑德霍夫病(Sandhoff Disease)(GM2神经节苷脂沉积症)、癫痫、脑梗塞、包括情绪障碍在内的精神障碍(例如，抑郁症、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性情绪障碍)、精神分裂症、药物依赖(例如，酗酒和其他物质依赖)、神经官能症(例如，焦虑、强迫障碍、躯体形式障碍、解离性障碍、悲伤、产后抑郁)、精神病(例如，幻觉和妄想)、痴呆、偏执、注意力缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、进食或体重障碍(例如，肥胖症、恶病质、神经性厌食症和暴食症)以及CNS的癌症和肿瘤(例如，垂体肿瘤)。

CNS障碍包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科障碍(例如，色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病和其他视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼)。

大多数(如果不是全部)眼科疾病和障碍与以下三种适应症中的一种或多种有关：(1)血管生成，(2)炎症，和(3)变性。本文所述的病毒载体可以用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞变性、促进细胞保留或促进细胞生长的因子以及上述因素的组合。

例如，糖尿病性视网膜病的特征是血管生成。糖尿病性视网膜病可以通过眼内(例如，在玻璃体内)或眼周(例如，在特农氏膜下(sub-Tenon)区域)递送一种或多种抗血管生成因子来治疗。一种或多种神经营养因子也可以通过眼内(例如，玻璃体内)或眼周共同递送。

葡萄膜炎涉及炎症。一种或多种抗炎因子可以通过病毒载体的眼内(例如，玻璃体或前房)施用来施用。

通过比较，色素性视网膜炎的特征是视网膜变性。在一些实施方案中，可以通过眼内施用(例如，玻璃体施用)编码一种或多种神经营养因子的病毒载体来治疗色素性视网膜炎。

年龄相关性黄斑变性涉及血管生成和视网膜变性两者。可以通过眼内(例如，玻璃体)施用编码一种或多种神经营养因子的本发明病毒载体和/或眼内或眼周(例如，在特农氏膜下区域)施用一种或多种抗血管生成因子来治疗这种障碍。

青光眼的特征是眼压升高和视网膜神经节细胞的损失。青光眼的治疗包括使用本发明的病毒载体施用一种或多种保护细胞免受兴奋性毒性损害的神经保护剂。此类的药剂包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、细胞因子、和神经营养因子，眼内递送，任选地玻璃体内递送。

在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可以用于治疗癫痫发作，例如以减少癫痫发作的发作、发病率或严重程度。癫痫发作的治疗性治疗的功效可以通过行为(例如，颤动、眼睛或嘴的抽搐)和/或电图手段(大多数癫痫发作具有特征性的电图异常)来评估。因此，也可以治疗以随着时间的推移多次癫痫发作为特征的癫痫。

在一些实施方案中，治疗有需要的受试者的方法包括向受试者施用包含含有衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳的AAV载体，其中所述衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:165-187中的任一个。在一些实施方案中，所述AAV载体包含含有衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳，所述衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:175或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述AAV载体包含含有衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳，所述衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:175或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，受试者患有Dravet综合征。在一些实施方案中，受试者患有雷特氏综合征。在一些实施方案中，受试者患有安格尔曼综合征。在一些实施方案中，受试者患有尼曼-匹克病。在一些实施方案中，受试者患有脆性X综合征。在一些实施方案中，受试者患有阿尔茨海默病。在一些实施方案中，受试者患有戈谢病。在一些实施方案中，受试者患有亨廷顿病。在一些实施方案中，受试者患有帕金森病。在一些实施方案中，受试者患有弗里德赖希共济失调。在一些实施方案中，通过脑室内(ICV)注射将AAV载体施用于受试者。在一些实施方案中，通过鞘内(IT)注射将AAV载体施用于受试者。在一些实施方案中，通过静脉内(IV)注射将AAV载体施用于受试者。

在一些实施方案中，治疗有需要的受试者的方法包括向受试者施用包含含有衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳的AAV载体，其中所述衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:175或180，其中受试者患有Dravet综合征、雷特氏综合征、安格尔曼综合征、尼曼-匹克病、或脆性X综合征，并且其中通过ICV或IT注射将AAV载体施用于受试者。

在一些实施方案中，治疗有需要的受试者的方法包括向受试者施用包含含有衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳的AAV载体，其中所述衣壳蛋白亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:175或180，其中受试者患有戈谢病、亨廷顿病、帕金森病、或弗里德赖希共济失调，并且其中通过ICV或IT注射将AAV载体施用于受试者。

在一些实施方案中，使用病毒载体将生长抑素(或其活性片段)施用于脑以治疗垂体肿瘤。根据此实施方案，编码生长抑素(或其活性片段)的病毒载体通过微量输注施用于垂体中。同样，这种治疗可以用于治疗肢端肥大症(从垂体分泌的生长激素异常)。生长抑素的核酸(例如，GenBank登录号J00306)和氨基酸(例如，GenBank登录号P01166；含有经加工的活性肽生长抑素-28和生长抑素-14)序列是本领域已知的。

在一些实施方案中，病毒载体可以包含如美国专利号7,071,172中所述的分泌信号。

在一些实施方案中，将病毒载体和/或病毒样颗粒施用于CNS(例如，施用于脑或眼)。可以将病毒载体和/或病毒样颗粒引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、大脑(包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶)、皮质、基底神经节、海马和杏仁核门(portaamygdala))、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。病毒载体和/或病毒样颗粒也可以施用于眼的不同区域，诸如视网膜、角膜和/或视神经。

病毒载体和/或病毒样颗粒可以递送到脑脊液中(例如，通过腰椎穿刺)以更分散地施用载体。在血脑屏障受到干扰(例如，脑肿瘤或脑梗塞)的情况下，病毒载体和/或病毒样颗粒可以进一步血管内施用至CNS。

病毒载体和/或病毒样颗粒可以通过本领域已知的任何途径施用于CNS的所希望的一个或多个区域，所述途径包括但不限于鞘内、眼内、脑内、心室内、静脉内(例如，在糖诸如甘露醇的存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如，特农氏膜下区域)递送，以及肌肉内递送与逆行递送至运动神经元。在一些实施方案中，将病毒载体和/或病毒样颗粒通过直接注射(例如，立体定向注射)以液体配制品施用至CNS中的所希望的区域或隔室。在一些实施方案中，病毒载体和/或病毒样颗粒可以通过外用应用于所希望的区域或通过气雾剂配制品的鼻内施用来提供。施用于眼睛可以通过液滴的外用应用。作为进一步的替代方案，病毒载体和/或病毒样颗粒可以作为固体缓释配制品来施用(参见例如，美国专利号7,201,898)。

在一些实施方案中，病毒载体可以用于逆行运输以治疗和/或预防涉及运动神经元的疾病和障碍(例如，肌萎缩侧索硬化症(ALS)；脊髓性肌萎缩症(SMA)等)。例如，病毒载体可以递送至肌肉组织，它可以从肌肉组织迁移到神经元中。

实施例

本文包含的仅处于说明目的的以下实施例不旨在限制。如本文所用，术语STRD.101和STRD.102用于描述衣壳蛋白亚基序列，并且AAV-STRD.101和AAV-STRD.102用于描述包含重组或经修饰的衣壳蛋白亚基序列的AAV载体。然而，术语STRD.101和STRD.102可以在一些上下文中用于描述包含含有命名的衣壳蛋白亚基的蛋白衣壳的AAV载体，这对技术人员来说是显而易见的。

实施例1.逃避抗体的AAV载体的组合工程化和选择

根据以下方法制备抗体逃避AAV突变体。第一步骤涉及鉴定AAV衣壳蛋白衣壳表面上的构象3D抗原表位，例如使用冷冻电子显微术。然后使用简并引物使抗原基序内的选定残基经受诱变，其中每个密码子被核苷酸NNK取代并且基因片段通过Gibson组装和/或多步PCR组合在一起。将含有突变抗原基序简并文库的编码衣壳蛋白亚基的基因克隆到野生型AAV基因组中，以替代原始的Cap编码DNA序列，从而产生质粒文库。然后将质粒文库用腺病毒辅助质粒转染到293个生产细胞系中以生成AAV衣壳蛋白亚基文库，然后使所述AAV衣壳蛋白亚基文库经受选择。通过DNA测序确认AAV文库的成功生成。

为了选择可以逃避中和抗体(NAb)和/或靶向中枢神经系统(CNS)的新AAV毒株，使AAV文库在非人类灵长类动物中经受多轮感染。在每个阶段，从动物受试者中分离出目的组织。将从目的组织中收获的细胞裂解物测序以鉴定逃脱抗体中和的AAV分离株。在非人类灵长类动物中进行多轮感染后，将来自每个诱变区域的分离序列以所有排列和组合方式组合。

作为具体例子，使AAV衣壳蛋白亚基(VP1)上的常见抗原基序经受如上所述的诱变。然后使简并文库(图1A)在非人类灵长类动物中经受第一轮感染(静脉内注射)。在感染后第7天收集组织并且测序以鉴定单一AAV分离株。

在组织样品中鉴定出各种重组AAV分离株，所述组织样品包括脊髓、背根神经节、额叶、颞叶、枕叶、壳核、苍白球、丘脑、杏仁核、海马、黑质、脑桥、小脑、髓质。此第一轮进化的结果在图1B中示出。

然后将在第一轮进化过程中分离出的重组AAV(图1B)重新引入第二非人类灵长类动物中。在感染后第7天收集组织并且测序以鉴定单一AAV分离株。此第二轮进化的结果在图1C中示出。

对频率最高的重组AAV进行测序。这些AAV中存在的取代在表7.1和表7.2中示出。这些数据证明，具有包含表7.1和表7.2中列出的取代的衣壳蛋白亚基的重组AAV病毒粒子在非人类灵长类动物体内逃避中和抗体，并且具有对所希望的靶组织的嗜性。

实施例2：重组AAV载体的可制造性

为了确定实施例1中鉴定的各种重组AAV是否可以在大规模系统中制造，根据标准方法生产AAV，并且将产率与野生型AAV载体的产率进行比较。

根据标准三重转染方案在HEK293细胞中产生AAV。简而言之，用(i)包含野生型AAV9衣壳蛋白亚基序列STRD.101衣壳蛋白亚基变体序列(SEQ ID NO:180)或STRD.102衣壳蛋白亚基变体序列(SEQ ID NO:175)的质粒，(ii)包含5’ITR、转基因和3’ITR序列的质粒，和(ii)包含AAV产生所必需的辅助基因的质粒转染细胞。在自互补构建体中，每个衣壳蛋白亚基使用两种不同的转基因。随后裂解细胞并且使用亲和柱、CsCl密度超速离心和透析纯化病毒粒子。随后，使用基于PCR的定量方法测量各AAV的产率。

如图2所示，包含STRD.101和STRD.102衣壳蛋白亚基的重组AAV载体的产率与野生型AAV9的产率相似。此数据证实包含重组衣壳蛋白亚基的重组AAV适用于商业制造。

实施例3：使用重组AAV病毒载体进行体外转导

为了确认实施例1的重组AAV载体是否通常具有感染性并且能够转导培养中的细胞，根据标准方案制备了各种AAV载体。

使用标准TCID50测定测试重组AAV的感染性。简而言之，用重组AAV颗粒在腺病毒(Ad5)的存在下以5个数量级跨度的剂量感染HeLaRC32细胞。72小时后，提取DNA并且通过qPCR对载体基因组复制进行定量。

计算颗粒与感染性的比率以确定感染性。如图3所示，与野生型AAV9的感染性相比，AAV-STRD.101载体的感染性比率更低。因为更低的感染性比率转化为更高的效力，所以AAV-STRD.101比野生型AAV9更具感染性。

单独地，还在各种细胞系中确定感染性。产生包装萤光素酶转基因的重组AAV，并且以10,000个载体基因组(vg)/个细胞的剂量与培养中的细胞接触。感染后48小时，将细胞裂解。将裂解物与生物发光底物接触，并且测量相对荧光单位(RFU)。如图4A-4D所示，AAV-STRD.101载体以与野生型AAV9可比较的水平感染U87细胞(人胶质母细胞瘤细胞系，图4A)、N2A细胞(小鼠神经嵴衍生细胞系，图4B)、SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞系，图4C)和U2OS细胞(人骨肉瘤细胞系，图4D)。

因此，此数据证明，实施例1的重组AAV载体可以有效地转导培养中的细胞。

实施例4：靶向中枢神经系统的重组AAV的体内表征

选择重组衣壳蛋白亚基STRD.101和STRD.102用于体内表征。产生包含这些衣壳蛋白亚基并且包装天然tdTomato荧光转基因的重组AAV。在第0天通过脑室内注射将重组AAV施用于新生小鼠。在注射后三周，收获脑组织并且固定以通过视觉评估tdTomato荧光来评价表达。图5提供了示出了在用4％PFA固定后24小时后冠状振动切片机切片中的tdTomato表达的代表性图像。还使用免疫组织化学使这些相同的切片可视化(图6)。如图5和图6的图像所示，AAV9、AAV-STRD.102和AAV-STRD.101载体在脑组织中的分布各不相同，并且最高的转基因表达位于注射部位附近。总之，这些数据显示，在脑室内注射后，测试的重组AAV成功地将转基因体内递送到靶细胞。

还通过以5.5x10

图7中提供了示出了一只小鼠的在用4％PFA固定后24小时后振动切片机肝脏切片中的TdTomato表达的代表性图像。值得注意地，与野生型AAV9相比，AAV-STRD.102和AAV-STRD.101载体靶向肝脏。这种希望的特性是出乎意料的，因为在进化过程中没有在肝脏中进行反筛选。

图8中提供了示出了一只小鼠的在用4％PFA固定后24小时后振动切片机心脏切片中的TdTomato表达的代表性图像。值得注意地，测试的载体对心脏具有不同的嗜性。具体地，与AAV-STRD.101相比，AAV-STRD.102载体在心脏中的感染性较低。因为在进化过程中没有进行心脏筛选，所以这种差异转导完全出乎意料。

总之，此数据表明，AAV-STRD.102和AAV-STRD.101载体可以成功用于体内靶向CNS组织，避免被肝脏清除，并且是基因疗法的有力工具。鉴于它们不同的嗜性(即，AAV-STRD.101在心脏中的感染性比AAV-STRD.102更强)，这些载体将成为用于将基因疗法治疗靶向特定希望的组织的有力工具。

实施例5：重组AAV在非人类灵长类动物中的生物分布

将重组AAV施用于非人类灵长类动物，以便确定生物分布。通过静脉内(IV)和脑血管内(ICV)注射施用重组AAV(图9)。通过IV注射以2.9x10

如图9所示，AAV-STRD.102和AAV-STRD.101都感染了各种CNS组织。另外，由于AAV显示出高水平的转导，所以此数据表明这些AAV可能避免体内中和抗体。

实施例6：用于治疗有需要的受试者的细胞疗法方法

使用AAV载体离体转导细胞。出于一些目的，细胞可以是自体的(即，源自待治疗的受试者)或同种异体的(即，源自不同的受试者/供体)。在使用AAV转导细胞后并且在验证转基因表达后，使用标准临床方法将细胞施用于受试者。

可以向受试者一次施用细胞，或者可以多次重复施用。施用的细胞数量根据例如待治疗的疾病或病症、受试者疾病/病症的严重程度以及受试者的身高和体重而变化。

实施例7：用于治疗有需要的受试者的基因疗法方法

将本文所述的AAV载体(例如，包含具有序列SEQ ID NO:175或180的衣壳蛋白亚基的AAV载体)施用于有需要的受试者，其中受试者患有CNS的疾病或障碍。向受试者一次施用AAV载体，或者可以多次重复施用。通过一种或多种途径诸如静脉内(IV)、脑室内(ICV)或鞘内(IT)注射来施用。AAV载体剂量根据例如待治疗的疾病或病症、受试者疾病/病症的严重程度以及受试者的身高和体重而变化。例如，当AAV载体通过IV注射施用时，施用于受试者的AAV剂量可以是2.8x10

实施例8：在哺乳动物细胞中制备重组AAV载体

提供三种质粒。第一质粒包含转移盒，所述转移盒包含侧翼是两个ITR(SEQ IDNO:3003和3004)的编码NPC1的转基因(SEQ ID NO:3002)。第一质粒包含序列SEQ ID NO:3014-3019中的任一个。第二质粒包含编码Rep和Cap基因的序列。第三质粒包含AAV产生所需的各种“辅助”序列(E4、E2a和VA)。

使用适当的转染试剂(例如，Lipofectamine

实施例9：在昆虫细胞中制备重组AAV载体

提供第一重组杆状病毒载体。第一重组杆状病毒载体包含转移盒序列，所述转移盒序列包含侧翼是两个ITR(SEQ ID NO:3003和3004)的编码NPC1的转基因(SEQ ID NO:3002)。转移盒包含序列SEQ ID NO:3014-3019中的任一个。

将昆虫细胞(例如，Sf9)在悬浮培养物中用第一重组杆状病毒载体和至少一种另外的包含编码AAV Rep和Cap蛋白(例如，STRD.101或STRD.012衣壳蛋白亚基)的序列的重组杆状病毒载体共感染。在28℃下孵育预定时间段后，从培养基中收集AAV颗粒，或将细胞裂解以释放AAV颗粒。然后根据标准方法，使用定量PCR(qPCR)或液滴数字PCR(ddPCR)纯化和滴定AAV颗粒。AAV颗粒可以储存在-80℃下以备后用。

实施例10：体外效力测定

为了确定本文所述AAV转移盒是否能够拯救培养细胞中的NPC1溶酶体表型，使用三重转染方案(参见例如，实施例1)在HEK293细胞中制备包装hNPC1转移盒(SEQ ID NO:3014)的重组AAV2载体。然后将AAV2-hNPC1载体用于野生型U2OS细胞(骨肉瘤)以及在体外以5x10

NPC1细胞展现出在溶酶体中胆固醇的特征性积聚，这可以通过观察细胞中溶酶体的大小和数量来监测。在此测定中，通过测量细胞中荧光细胞器染料

结果示出在图10A中。如所预期，野生型U2OS细胞在溶酶体中没有显示出显著的

在单独的测定中，将用hNPC1转导的细胞固定并且使用菲律宾菌素染色，菲律宾菌素是一种用于胆固醇的组织化学染色剂。源自菲律宾链霉菌(Streptomycesfilipinensis)的菲律宾菌素染色剂购自Polysciences，并且以50μg/mL的终浓度使用。将细胞使用Pico自动细胞成像系统

总之，这些数据显示使用AAV2-hNPC转导细胞成功拯救了NPC1缺陷型U2OS细胞中的溶酶体表型。

实施例11：体内效力测定

为了确定本文所述AAV转移盒是否能够在体内拯救NPC1表型，使用三重转染方案(参见例如，实施例1)在HEK293细胞中制备包装hNPC1转移盒(SEQ ID NO:3014)的重组AAV9载体。在大约24-28日龄时，通过眶后注射，以3.0x10

小鼠也在平衡木行走测试中受到挑战，其中当小鼠走过平衡木时测量滑倒的次数。测试在约8周(56天)龄时进行。如图13所示，野生型小鼠没有从平衡木上滑落。虽然在用AAV9-hNPC1处理的NPC1

小鼠的行为表型得分也在约10周(70天)龄时进行评估。行为表型得分是衡量各种疾病症状的综合得分，包括梳毛、步态、驼背、窄平台(ledge)测试、后肢扣紧、和震颤。(参见Alam等人,Sci Transl Med,2016；Guyenet等人,J Vis Exp,2010)。如图12所示，与盐水处理的NPC1

总之，这些数据证明AAV9-hNPC1可以至少部分地拯救NPC1缺陷型小鼠的疾病表型。

实施例12：在体外和体内测试包装编码NPC1的盒的STRD.101载体

根据实施例8或9的方法制备AAV-STRD.101载体，所述载体包含含有编码人NPC1的转移盒(例如，SEQ ID NO:14的转移盒)的核酸。此载体在本文中称为AAV-STRD.101-hNPC1。

为了确定AAV-STRD.101载体是否能够拯救培养细胞中的NPC1溶酶体表型，然后将AAV-STRD.101-hNPC1载体用于野生型U2OS细胞(骨肉瘤)以及在体外以5x10

NPC1细胞展现出在溶酶体中胆固醇的特征性积聚，这可以通过观察细胞中溶酶体的大小和数量来监测。因此，通过测量细胞中荧光细胞器染料

在单独的测定中，将用AAV-STRD.101-hNPC1载体转导的细胞固定并且使用菲律宾菌素染色，菲律宾菌素是一种用于胆固醇的组织化学染色剂。源自菲律宾链霉菌的菲律宾菌素染色剂以50μg/mL的终浓度使用。将细胞使用Pico自动细胞成像系统

还测试AAV-STRD.101-hNPC1载体以确定它是否可以在体内拯救NPC1表型。在大约24-28日龄时，通过眶后注射，以3.0x10

小鼠也在平衡木行走测试中受到挑战，其中当小鼠走过平衡木时测量滑倒的次数。测试在约8周(56天)龄时进行。

小鼠的行为表型得分也在约10周(70天)龄时进行评估。行为表型得分是衡量各种疾病症状的综合得分，包括梳毛、步态、驼背、窄平台(ledge)测试、后肢扣紧、和震颤。(参见Alam等人,Sci Transl Med,2016；Guyenet等人,J Vis Exp,2010)。

前述内容是对本发明的说明并且不应被解释为对本发明的限制。本发明由以下权利要求限定，并且权利要求的等同方案包括在其中。

编号的实施方案

尽管有所附权利要求，本公开文本阐述了以下编号的实施方案：

1.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180或175；和(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的核酸；其中所述核酸包含转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因序列；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。

2.根据实施方案1所述的AAV载体，其中所述5’ITR和所述3’ITR中的至少一个的长度是约110至约160个核苷酸。

3.根据实施方案1或2所述的AAV载体，其中所述5’ITR的长度与所述3’ITR相同。

4.根据实施方案1或2所述的AAV载体，其中所述5’ITR和所述3’ITR具有不同的长度。

5.根据实施方案1-4中任一项所述的AAV载体，其中所述5’ITR和所述3’ITR中的至少一个分离自或源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV或牛AAV的基因组。

6.根据实施方案1所述的AAV载体，其中所述5’ITR包含序列SEQ ID NO:3003。

7.根据实施方案1所述的AAV载体，其中所述3’ITR包含序列SEQ ID NO:3004。

8.根据实施方案1-7中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子是组成型启动子。

9.根据实施方案1-7中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子是诱导型启动子。

10.根据实施方案1-9中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子是组织特异性启动子。

11.根据实施方案1-7中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子选自CBA启动子、GUSB240启动子、GUSB379启动子、HSVTK启动子、CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、EF-1α启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。

12.根据实施方案11所述的AAV载体，其中所述启动子选自CBA启动子、GUSB240启动子、GUSB379启动子和HSVTK启动子。

13.根据实施方案1-7中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包含与SEQ IDNO:3005、SEQ ID NO:3006、SEQ ID NO:3007或SEQ ID NO:3008中任一个具有至少95％或100％同一性的序列。

14.根据实施方案1-13中任一项所述的AAV载体，其中所述NPC1蛋白是人NPC1蛋白。

15.根据实施方案1-13中任一项所述的AAV载体，其中所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少90％同一性的序列。

16.根据实施方案15所述的AAV载体，其中所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少95％同一性的序列。

17.根据实施方案16所述的AAV载体，其中所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少98％同一性的序列。

18.根据实施方案1-13中任一项所述的AAV载体，其中所述NPC1蛋白包含序列SEQID NO:3001。

19.根据实施方案1-13中任一项所述的AAV载体，其中所述转基因包含序列SEQ IDNO:3002。

20.根据实施方案1-18中任一项所述的AAV载体，其中所述聚腺苷酸化信号选自猿猴病毒40(SV40)、rBG、α-珠蛋白、β-珠蛋白、人胶原、人生长激素(hGH)、多瘤病毒、人生长激素(hGH)和牛生长激素(bGH)。

21.根据实施方案20所述的AAV载体，其中所述聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信号。

22.根据实施方案20所述的AAV载体，其中所述聚腺苷酸化信号是rBG聚腺苷酸化信号。

23.根据实施方案1-19中任一项所述的AAV载体，其中所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:3012或SEQ ID NO:3013具有至少95％或100％同一性的序列。

24.根据实施方案1-23中任一项所述的AAV载体，其中所述盒进一步包含增强子。

25.根据实施方案24所述的AAV载体，其中所述增强子是CMV增强子。

26.根据实施方案24所述的AAV载体，其中所述增强子包含序列SEQ ID NO:3009或与其具有至少95％同一性的序列。

27.根据实施方案1-26中任一项所述的AAV载体，其中所述盒进一步包含内含子序列。

28.根据实施方案27所述的AAV载体，其中所述内含子序列是嵌合序列。

29.根据实施方案27所述的AAV载体，其中所述内含子序列是杂合序列。

30.根据实施方案27所述的AAV载体，其中所述内含子序列包含分离自或源自SV40的序列。

31.根据实施方案27所述的AAV载体，其中所述内含子序列包含序列SEQ ID NO:3010-3011中的任一个。

32.根据实施方案1所述的AAV载体，其中所述AAV转移盒包含序列SEQ ID NO:3014-3019中的任一个。

33.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180或175或相对于SEQID NO:180或175包含约1至约25个氨基酸突变的序列；和(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因序列；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。

34.一种组合物，所述组合物包含根据实施方案1-33中任一项所述的AAV载体。

35.根据实施方案34所述的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。

36.一种用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-33中任一项所述的AAV载体或根据实施方案34-35中任一项所述的组合物。

37.根据实施方案36所述的方法，其中所述受试者患有C型尼曼-匹克病。

38.根据实施方案36或37所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。

39.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180或175；和(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；包含序列SEQ ID NO:3002的转基因序列；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。

40.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:180或175；和(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的核酸；其中所述核酸包含转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因序列，其中所述NPC1蛋白包含序列SEQ IDNO:3001；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。

41.根据实施方案1-33、39和40中任一项所述的AAV载体，其中所述AAV载体选择性地将所述转移盒递送至中枢神经系统的细胞或组织。

42.根据实施方案41所述的AAV载体，其中所述中枢神经系统的组织是运动前区皮层、丘脑、小脑皮层、齿状核、脊髓或背根神经节。

43.根据实施方案1-33、39和40中任一项所述的AAV载体，其中所述AAV载体将所述转移盒递送至脑，但不将所述AAV载体递送至心脏。

44.根据实施方案1-33、39和40中任一项所述的AAV载体，其中所述AAV载体将所述转移盒递送至脑和心脏。

45.根据实施方案44所述的AAV载体，其中所述转移盒向脑的递送大于向心脏的递送。

46.根据实施方案44所述的AAV载体，其中所述转移盒的递送在脑和心脏中大致相等。

47.一种细胞，所述细胞包含根据实施方案1-33至39-46中任一项所述的AAV载体。

48.一种将转移盒引入细胞中的体外方法，所述方法包括使所述细胞与根据实施方案1-33和39-46中任一项所述的AAV载体接触。

49.根据实施方案1-33至39-46中任一项所述的AAV载体，所述AAV载体用作药剂。

50.根据实施方案1-33和39-46中任一项所述的AAV载体，所述AAV载体用于治疗或预防有需要的受试者的C型尼曼-匹克病的方法。

51.根据实施方案1-33和39-46中任一项所述的AAV载体，其中所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180。

52.根据实施方案1-33和39-46中任一项所述的AAV载体，其中所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:175。

53.一种腺相关病毒(AAV)转移盒，所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR；其中所述转基因编码所述NPC1蛋白。

54.根据实施方案53所述的AAV转移盒，其中5’ITR和3’ITR中的至少一个的长度为约110至约160个核苷酸。

55.根据实施方案53或54所述的AAV转移盒，其中所述5’ITR的长度与所述3’ITR相同。

56.根据实施方案53或54所述的AAV转移盒，其中所述5’ITR和所述3’ITR具有不同的长度。

57.根据实施方案53-56中任一项所述的AAV转移盒，其中所述5’ITR和所述3’ITR中的至少一个分离自或源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV或牛AAV的基因组。

58.根据实施方案53所述的AAV转移盒，其中所述5’ITR包含序列SEQ ID NO:3003。

59.根据实施方案53所述的AAV转移盒，其中所述3’ITR包含序列SEQ ID NO:3004。

60.根据实施方案53-59中任一项所述的AAV转移盒，其中所述启动子是组成型启动子。

61.根据实施方案53-59中任一项所述的AAV转移盒，其中所述启动子是诱导型启动子。

62.根据实施方案53-59中任一项所述的AAV转移盒，其中所述启动子是组织特异性启动子。

63.根据实施方案53-59中任一项所述的AAV转移盒，其中所述启动子选自CBA启动子、GUSB240启动子、GUSB379启动子、HSVTK启动子、CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、EF-1α启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。

64.根据实施方案63所述的AAV转移盒，其中所述启动子选自CBA启动子、GUSB240启动子、GUSB379启动子和HSVTK启动子。

65.根据实施方案53-59中任一项所述的AAV转移盒，其中所述启动子包含与SEQID NO:3005、SEQ ID NO:3006、SEQ ID NO:3007或SEQ ID NO:3008中任一个具有至少95％或100％同一性的序列。

66.根据实施方案53-65中任一项所述的AAV转移盒，其中所述NPC1蛋白是人NPC1蛋白。

67.根据实施方案53-65中任一项所述的AAV转移盒，其中所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少90％同一性的序列。

68.根据实施方案67所述的AAV转移盒，其中所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少95％同一性的序列。

69.根据实施方案68所述的AAV转移盒，其中所述NPC1蛋白具有与人NPC1蛋白的序列具有至少98％同一性的序列。

70.根据实施方案53-65中任一项所述的AAV转移盒，其中所述NPC1蛋白包含序列SEQ ID NO:3001。

71.根据实施方案53-65中任一项所述的AAV转移盒，其中所述转基因包含序列SEQID NO:3002。

72.根据实施方案53-71中任一项所述的AAV转移盒，其中所述聚腺苷酸化信号选自猿猴病毒40(SV40)、rBG、α-珠蛋白、β-珠蛋白、人胶原、人生长激素(hGH)、多瘤病毒、人生长激素(hGH)和牛生长激素(bGH)。

73.根据实施方案72所述的AAV转移盒，其中所述聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信号。

74.根据实施方案72所述的AAV转移盒，其中所述聚腺苷酸化信号是rBG聚腺苷酸化信号。

75.根据实施方案53-71中任一项所述的AAV转移盒，其中所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:3012或SEQ ID NO:3013具有至少95％或100％同一性的序列。

76.根据实施方案53-75中任一项所述的AAV转移盒，其中所述盒进一步包含增强子。

77.根据实施方案76所述的AAV转移盒，其中所述增强子是CMV增强子。

78.根据实施方案76所述的AAV转移盒，其中所述增强子包含序列SEQ ID NO:3009或与其具有至少95％同一性的序列。

79.根据实施方案53-78中任一项所述的AAV转移盒，其中所述盒进一步包含内含子序列。

80.根据实施方案79所述的AAV转移盒，其中所述内含子序列是嵌合序列。

81.根据实施方案79所述的AAV转移盒，其中所述内含子序列是杂合序列。

82.根据实施方案79所述的AAV转移盒，其中所述内含子序列包含分离自或源自SV40的序列。

83.根据实施方案79所述的AAV转移盒，其中所述内含子序列包含序列SEQ ID NO:3010-3011中的任一个。

84.根据实施方案53所述的AAV转移盒，其中所述AAV转移盒包含序列SEQ ID NO:3014-3019中的任一个。

85.一种质粒，所述质粒包含根据实施方案53-84中任一项所述的AAV转移盒。

86.一种细胞，所述细胞包含根据实施方案53-84中任一项所述的AAV转移盒或根据实施方案85所述的质粒。

87.一种生产重组AAV载体的方法，所述方法包括使AAV生产细胞与根据实施方案53-84中任一项所述的AAV转移盒或根据实施方案85所述的质粒接触。

88.一种通过根据实施方案87所述的方法生产的重组AAV载体。

89.根据实施方案88所述重组AAV载体，其中所述载体是选自以下的血清型的：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV和牛AAV。

90.一种组合物，所述组合物包含根据实施方案53-84中任一项所述的AAV转移盒、根据实施方案85所述的质粒、根据实施方案86所述的细胞、或根据实施方案88或89所述的重组AAV载体。

91.一种用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案53-84中任一项所述的AAV转移盒、根据实施方案85所述的质粒、根据实施方案86所述的细胞、或根据实施方案88或89所述的重组AAV载体。

92.根据实施方案91所述的方法，其中所述受试者患有NPC1疾病。

93.根据实施方案91或92所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。

94.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180；以及(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的核酸；其中所述核酸包含转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。

95.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含：(i)蛋白衣壳，所述蛋白衣壳包含衣壳蛋白亚基，所述衣壳蛋白亚基包含序列SEQ ID NO:180或相对于SEQ IDNO:180包含约1至约25个氨基酸突变的序列；以及(ii)由所述蛋白衣壳衣壳化的核酸；其中所述核酸包含转移盒；其中所述转移盒从5’至3’包含：5’反向末端重复序列(ITR)；启动子；编码NPC1蛋白的转基因；聚腺苷酸化信号；和3’ITR。

96.根据实施方案94或95所述的AAV载体，其中所述转移盒包含内含子序列。

97.根据实施方案94-96中任一项所述的AAV载体，其中所述内含子序列包含序列SEQ ID NO:10。

98.根据实施方案94-97中任一项所述的AAV载体，其中所述5’ITR包含序列SEQ IDNO:3003。

99.根据实施方案94-98中任一项所述的AAV载体，其中所述3’ITR包含序列SEQ IDNO:3004。

100.根据实施方案94-99中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子是CBA启动子。

101.根据实施方案94-99中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包含序列SEQID NO:3005。

102.根据实施方案94-101中任一项所述的AAV载体，其中所述NPC1蛋白是人NPC1蛋白。

103.根据实施方案94-101中任一项所述的AAV载体，其中所述NPC1蛋白包含序列SEQ ID NO:3001。

104.根据实施方案94-101中任一项所述的AAV载体，其中所述转基因包含序列SEQID NO:3002。

105.根据实施方案94-104中任一项所述的AAV载体，其中所述聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信号。

106.根据实施方案94-104中任一项所述的AAV载体，其中所述聚腺苷酸化信号包含序列SEQ ID NO:3012。

107.根据实施方案94-106中任一项所述的AAV载体，其中所述盒包含增强子。

108.根据实施方案94所述的AAV载体，其中所述AAV转移盒包含序列SEQ ID NO:3014。

109.根据实施方案94所述的AAV载体，其中所述AAV转移盒包含序列SEQ ID NO:3015-3019中的任一个。

110.一种组合物，所述组合物包含根据实施方案94-109中任一项所述的AAV载体。

111.一种细胞，所述细胞包含根据实施方案94-109中任一项所述的AAV载体。

112.一种用于治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案94-109中任一项所述的AAV载体、根据实施方案110所述的组合物或根据实施方案111所述的细胞。

113.根据实施方案112所述的方法，其中所述受试者患有C型尼曼-匹克病。

114.根据实施方案112或113所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。

序列表

<110> 斯特里迪比奥公司

<120> 用于治疗C型尼曼-匹克病的腺相关病毒载体

<130> STRD-021/02WO

<150> US 63/082,899

<151> 2020-09-24

<150> US 63/082,425

<151> 2020-09-23

<150> US 62/923,253

<151> 2019-10-18

<150> US 62/916,749

<151> 2019-10-17

<160> 3020

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 736

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒1

<400> 1

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

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210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn

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Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln

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Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn

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Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro

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Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala

355 360 365

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Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn

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Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys

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Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly

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<210> 2

<211> 735

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒2

<400> 2

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

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Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

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Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

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Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro

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<210> 3

<211> 736

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒3

<400> 3

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1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro

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Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro

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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

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Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

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Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

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Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly

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Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

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Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

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Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

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260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

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545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala

580 585 590

Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 9

<211> 736

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒9

<400> 9

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 10

<211> 738

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒rh.10

<400> 10

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Gln Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala

580 585 590

Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Asp

705 710 715 720

Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 11

<211> 733

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒11

<400> 11

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Leu Glu Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly Lys

145 150 155 160

Lys Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Glu Glu Asp Thr

165 170 175

Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Asp Thr Ser Ala Met Ser

180 185 190

Ser Asp Ile Glu Met Arg Ala Ala Pro Gly Gly Asn Ala Val Asp Ala

195 200 205

Gly Gln Gly Ser Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys

210 215 220

Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly Lys Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr

225 230 235 240

Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Leu Arg Leu Gly Thr

245 250 255

Thr Ser Ser Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr

260 265 270

Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln

275 280 285

Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Leu Arg Pro Lys Ala Met Arg Val

290 295 300

Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu

305 310 315 320

Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp

325 330 335

Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser

340 345 350

Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr

355 360 365

Cys Gly Ile Val Thr Gly Glu Asn Gln Asn Gln Thr Asp Arg Asn Ala

370 375 380

Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn

385 390 395 400

Asn Phe Glu Met Ala Tyr Asn Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Met

405 410 415

Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Leu Asp

420 425 430

Gln Tyr Leu Trp His Leu Gln Ser Thr Thr Ser Gly Glu Thr Leu Asn

435 440 445

Gln Gly Asn Ala Ala Thr Thr Phe Gly Lys Ile Arg Ser Gly Asp Phe

450 455 460

Ala Phe Tyr Arg Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Val Lys Gln Gln

465 470 475 480

Arg Phe Ser Lys Thr Ala Ser Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Ser Gly

485 490 495

Gly Asn Ala Leu Leu Lys Tyr Asp Thr His Tyr Thr Leu Asn Asn Arg

500 505 510

Trp Ser Asn Ile Ala Pro Gly Pro Pro Met Ala Thr Ala Gly Pro Ser

515 520 525

Asp Gly Asp Phe Ser Asn Ala Gln Leu Ile Phe Pro Gly Pro Ser Val

530 535 540

Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ser Ala Asn Asn Leu Leu Phe Thr Ser Glu

545 550 555 560

Glu Glu Ile Ala Ala Thr Asn Pro Arg Asp Thr Asp Met Phe Gly Gln

565 570 575

Ile Ala Asp Asn Asn Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Ile Thr Gly Asn

580 585 590

Val Thr Ala Met Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp

595 600 605

Ile Tyr Tyr Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Ala Asp Gly

610 615 620

His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro

625 630 635 640

Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ala

645 650 655

Thr Thr Phe Thr Ala Ala Arg Val Asp Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser

660 665 670

Thr Gly Gln Val Ala Val Gln Ile Glu Trp Glu Ile Glu Lys Glu Arg

675 680 685

Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Tyr Gly Asn

690 695 700

Gln Ser Ser Met Leu Trp Ala Pro Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Thr Glu

705 710 715 720

Pro Arg Val Ile Gly Ser Arg Tyr Leu Thr Asn His Leu

725 730

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 12

Ser Cys Gln Pro Thr Val Met Asn

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 13

Phe Gly Val Pro Asn Gln Pro Leu

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 14

Gln Arg Gly Gln Ala Ala Pro Phe

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 15

Gly Asp Tyr Ala Pro Ile Arg Glu

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 16

Lys Thr Arg Arg Ile Val Gln His

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 17

Phe Gly Phe Pro Asn Gln Pro Leu

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 18

Arg Gln Asp Gln Pro Ile Asn Ala

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 19

Ser Lys Val Glu Ser Trp Thr Glu

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<400> 20

Ser Thr Val Asp Ser Ile Ala Ile

1 5

<210> 21

<400> 21

000

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽基序

<400> 22

Phe Val Phe Leu Pro

1 5

<210> 23

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽基序

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是碱性残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(3)

<223> Xaa是中性和/或疏水性残基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是碱性残基

<400> 23

Xaa Xaa Xaa Xaa

1

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽基序

<400> 24

Arg Gly Asn Arg

1

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Gly或Ser

<400> 25

Asn Ser Val Arg Asp Leu Xaa

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 26

Pro Arg Ser Val Thr Val Pro

1 5

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Ser或Ala

<400> 27

Asn Ser Val Ser Ser Xaa Xaa

1 5

<210> 28

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 28

Asn Gly Arg Ala His Ala

1 5

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 29

Gln Pro Glu His Ser Ser Thr

1 5

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 30

Val Asn Thr Ala Asn Ser Thr

1 5

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 31

His Gly Pro Met Gln Ser

1 5

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 32

Pro His Lys Pro Pro Leu Ala

1 5

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 33

Ile Lys Asn Asn Glu Met Trp

1 5

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 34

Arg Asn Leu Asp Thr Pro Met

1 5

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 35

Val Asp Ser His Arg Gln Ser

1 5

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 36

Tyr Asp Ser Lys Thr Lys Thr

1 5

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 37

Ser Gln Leu Pro His Gln Lys

1 5

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 38

Ser Thr Met Gln Gln Asn Thr

1 5

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 39

Thr Glu Arg Tyr Met Thr Gln

1 5

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 40

Gln Pro Glu His Ser Ser Thr

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 41

Asp Ala Ser Leu Ser Thr Ser

1 5

<210> 42

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 42

Asp Leu Pro Asn Lys Thr

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 43

Asp Leu Thr Ala Ala Arg Leu

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 44

Glu Pro His Gln Phe Asn Tyr

1 5

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 45

Glu Pro Gln Ser Asn His Thr

1 5

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 46

Met Ser Ser Trp Pro Ser Gln

1 5

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 47

Asn Pro Lys His Asn Ala Thr

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 48

Pro Asp Gly Met Arg Thr Thr

1 5

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 49

Pro Asn Asn Asn Lys Thr Thr

1 5

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 50

Gln Ser Thr Thr His Asp Ser

1 5

<210> 51

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 51

Thr Gly Ser Lys Gln Lys Gln

1 5

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 52

Ser Leu Lys His Gln Ala Leu

1 5

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 53

Ser Pro Ile Asp Gly Glu Gln

1 5

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 54

Trp Ile Phe Pro Trp Ile Gln Leu

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 55

Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys

1 5

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 56

Cys Asn Gly Arg Cys

1 5

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 57

Cys Pro Arg Glu Cys Glu Ser

1 5

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 58

Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys

1 5 10

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 59

Cys Gly Arg Arg Ala Gly Gly Ser Cys

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 60

Cys Lys Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 61

Cys Val Pro Glu Leu Gly His Glu Cys

1 5

<210> 62

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 62

Cys Arg Arg Glu Thr Ala Trp Ala Lys

1 5

<210> 63

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 63

Val Ser Trp Phe Ser His Arg Tyr Ser Pro Phe Ala Val Ser

1 5 10

<210> 64

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 64

Gly Tyr Arg Asp Gly Tyr Ala Gly Pro Ile Leu Tyr Asn

1 5 10

<210> 65

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> 磷酸化

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(7)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 65

Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 66

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 磷酸化

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Glu或Met

<400> 66

Tyr Xaa Asn Trp

1

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 67

Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro

1 5

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 68

Ala Pro Pro Leu Pro Pro Arg

1 5

<210> 69

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 69

Asp Val Phe Tyr Pro Tyr Pro Tyr Ala Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 70

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 70

Met Tyr Trp Tyr Pro Tyr

1 5

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 71

Asp Ile Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys

1 5 10

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Gly或Leu

<400> 72

Cys Trp Asp Asp Xaa Trp Leu Cys

1 5

<210> 73

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 73

Glu Trp Cys Glu Tyr Leu Gly Gly Tyr Leu Arg Cys Tyr Ala

1 5 10

<210> 74

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(5)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (13)..(13)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 74

Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro

1 5 10

<210> 75

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 75

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala

1 5 10

<210> 76

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(4)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Tyr、Trp、Phe或His

<400> 76

Leu Trp Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 77

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(4)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 77

Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Leu Trp

1 5

<210> 78

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 78

Arg Trp Gly Leu Cys Asp

1 5

<210> 79

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 79

Met Ser Arg Pro Ala Cys Pro Pro Asn Asp Lys Tyr Glu

1 5 10

<210> 80

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 80

Cys Leu Arg Ser Gly Arg Gly Cys

1 5

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 81

Cys His Trp Met Phe Ser Pro Trp Cys

1 5

<210> 82

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(3)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 82

Trp Xaa Xaa Phe

1

<210> 83

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 83

Cys Ser Ser Arg Leu Asp Ala Cys

1 5

<210> 84

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 84

Cys Leu Pro Val Ala Ser Cys

1 5

<210> 85

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 85

Cys Gly Phe Glu Cys Val Arg Gln Cys Pro Glu Arg Cys

1 5 10

<210> 86

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 86

Cys Val Ala Leu Cys Arg Glu Ala Cys Gly Glu Gly Cys

1 5 10

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 87

Ser Trp Cys Glu Pro Gly Trp Cys Arg

1 5

<210> 88

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 88

Tyr Ser Gly Trp Gly Trp

1 5

<210> 89

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 89

Gly Leu Ser Gly Gly Arg Ser

1 5

<210> 90

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 90

Leu Met Leu Pro Arg Ala Asp

1 5

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 91

Cys Ser Cys Phe Arg Asp Val Cys Cys

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 92

Cys Arg Asp Val Val Ser Val Ile Cys

1 5

<210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 93

Cys Asn Gly Arg Cys

1 5

<210> 94

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 94

Met Ala Arg Ser Gly Leu

1 5

<210> 95

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 95

Met Ala Arg Ala Lys Glu

1 5

<210> 96

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 96

Met Ser Arg Thr Met Ser

1 5

<210> 97

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 97

Lys Cys Cys Tyr Ser Leu

1 5

<210> 98

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 98

Met Tyr Trp Gly Asp Ser His Trp Leu Gln Tyr Trp Tyr Glu

1 5 10

<210> 99

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 99

Met Gln Leu Pro Leu Ala Thr

1 5

<210> 100

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 100

Glu Trp Leu Ser

1

<210> 101

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 101

Ser Asn Glu Trp

1

<210> 102

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 102

Thr Asn Tyr Leu

1

<210> 103

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 103

Trp Ile Phe Pro Trp Ile Gln Leu

1 5

<210> 104

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 104

Trp Asp Leu Ala Trp Met Phe Arg Leu Pro Val Gly

1 5 10

<210> 105

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 105

Cys Thr Val Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Val Arg Val Cys

1 5 10

<210> 106

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 106

Cys Val Pro Glu Leu Gly His Glu Cys

1 5

<210> 107

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 107

Cys Gly Arg Arg Ala Gly Gly Ser Cys

1 5

<210> 108

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 108

Cys Val Ala Tyr Cys Ile Glu His His Cys Trp Thr Cys

1 5 10

<210> 109

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 109

Cys Val Phe Ala His Asn Tyr Asp Tyr Leu Val Cys

1 5 10

<210> 110

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 110

Cys Val Phe Thr Ser Asn Tyr Ala Phe Cys

1 5 10

<210> 111

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 111

Val His Ser Pro Asn Lys Lys

1 5

<210> 112

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 112

Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys

1 5

<210> 113

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 113

Cys Arg Gly Asp Gly Trp Cys

1 5

<210> 114

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 114

Xaa Arg Gly Cys Asp Xaa

1 5

<210> 115

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(3)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Ser或Thr

<400> 115

Pro Xaa Xaa Xaa

1

<210> 116

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 116

Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys

1 5 10

<210> 117

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 117

Ser Gly Lys Gly Pro Arg Gln Ile Thr Ala Leu

1 5 10

<210> 118

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Ala或Gln

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是Asn或Ala

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Leu或Tyr

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Thr、Val、Met或Arg

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Arg或Lys

<400> 118

Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 119

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 119

Val Tyr Met Ser Pro Phe

1 5

<210> 120

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 120

Met Gln Leu Pro Leu Ala Thr

1 5

<210> 121

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 121

Ala Thr Trp Leu Pro Pro Arg

1 5

<210> 122

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 122

His Thr Met Tyr Tyr His His Tyr Gln His His Leu

1 5 10

<210> 123

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 123

Ser Glu Val Gly Cys Arg Ala Gly Pro Leu Gln Trp Leu Cys Glu Lys

1 5 10 15

Tyr Phe Gly

<210> 124

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 124

Cys Gly Leu Leu Pro Val Gly Arg Pro Asp Arg Asn Val Trp Arg Trp

1 5 10 15

Leu Cys

<210> 125

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 125

Cys Lys Gly Gln Cys Asp Arg Phe Lys Gly Leu Pro Trp Glu Cys

1 5 10 15

<210> 126

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 126

Ser Gly Arg Ser Ala

1 5

<210> 127

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 127

Trp Gly Phe Pro

1

<210> 128

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(4)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 128

Leu Trp Xaa Xaa Ala Arg

1 5

<210> 129

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(4)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 129

Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Leu Trp

1 5

<210> 130

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 130

Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Trp Tyr

1 5 10 15

Thr

<210> 131

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Trp或Phe

<400> 131

Trp Ala Tyr Xaa Ser Pro

1 5

<210> 132

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 132

Ile Glu Leu Leu Gln Ala Arg

1 5

<210> 133

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 133

Asp Ile Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys

1 5 10

<210> 134

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 134

Ala Tyr Thr Lys Cys Ser Arg Gln Trp Arg Thr Cys Met Thr Thr His

1 5 10 15

<210> 135

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 135

Pro Gln Asn Ser Lys Ile Pro Gly Pro Thr Phe Leu Asp Pro His

1 5 10 15

<210> 136

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 136

Ser Met Glu Pro Ala Leu Pro Asp Trp Trp Trp Lys Met Phe Lys

1 5 10 15

<210> 137

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 137

Ala Asn Thr Pro Cys Gly Pro Tyr Thr His Asp Cys Pro Val Lys Arg

1 5 10 15

<210> 138

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 138

Thr Ala Cys His Gln His Val Arg Met Val Arg Pro

1 5 10

<210> 139

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 139

Val Pro Trp Met Glu Pro Ala Tyr Gln Arg Phe Leu

1 5 10

<210> 140

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 140

Asp Pro Arg Ala Thr Pro Gly Ser

1 5

<210> 141

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 141

Phe Arg Pro Asn Arg Ala Gln Asp Tyr Asn Thr Asn

1 5 10

<210> 142

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 142

Cys Thr Lys Asn Ser Tyr Leu Met Cys

1 5

<210> 143

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Arg或Gln

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是Leu或Arg

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Gly或Asn

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(7)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是Ala或Val

<400> 143

Cys Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gly Cys

1 5 10

<210> 144

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 144

Cys Pro Ile Glu Asp Arg Pro Met Cys

1 5

<210> 145

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 145

His Glu Trp Ser Tyr Leu Ala Pro Tyr Pro Trp Phe

1 5 10

<210> 146

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 146

Met Cys Pro Lys His Pro Leu Gly Cys

1 5

<210> 147

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 147

Arg Met Trp Pro Ser Ser Thr Val Asn Leu Ser Ala Gly Arg Arg

1 5 10 15

<210> 148

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 148

Ser Ala Lys Thr Ala Val Ser Gln Arg Val Trp Leu Pro Ser His Arg

1 5 10 15

Gly Gly Glu Pro

20

<210> 149

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 149

Lys Ser Arg Glu His Val Asn Asn Ser Ala Cys Pro Ser Lys Arg Ile

1 5 10 15

Thr Ala Ala Leu

20

<210> 150

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 150

Glu Gly Phe Arg

1

<210> 151

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 151

Ala Gly Leu Gly Val Arg

1 5

<210> 152

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 152

Gly Thr Arg Gln Gly His Thr Met Arg Leu Gly Val Ser Asp Gly

1 5 10 15

<210> 153

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 153

Ile Ala Gly Leu Ala Thr Pro Gly Trp Ser His Trp Leu Ala Leu

1 5 10 15

<210> 154

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 154

Ser Met Ser Ile Ala Arg Leu

1 5

<210> 155

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 155

His Thr Phe Glu Pro Gly Val

1 5

<210> 156

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 156

Asn Thr Ser Leu Lys Arg Ile Ser Asn Lys Arg Arg Arg Lys

1 5 10

<210> 157

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向序列

<400> 157

Leu Arg Ile Lys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Thr Arg Lys

1 5 10 15

<210> 158

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸取代

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(8)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 158

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 159

<400> 159

000

<210> 160

<400> 160

000

<210> 161

<400> 161

000

<210> 162

<400> 162

000

<210> 163

<400> 163

000

<210> 164

<400> 164

000

<210> 165

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV衣壳变体

<400> 165

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ser Cys Gln Pro Thr Val Met Asn Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 166

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV衣壳变体

<400> 166

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Phe Gly Val Pro Asn Gln Pro Leu Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 167

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV衣壳变体

<400> 167

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Gln Arg Gly Gln Ala Ala Pro Phe Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 168

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV衣壳变体

<400> 168

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV肽序列

<400> 1375

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1 5 10

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2622

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2628

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2629

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2631

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<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2632

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2633

Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2634

Ala Asn

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2635

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2636

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2637

Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2638

Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2639

Gln Phe

1

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2640

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2641

Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser

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<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2642

Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu

1 5 10

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2643

Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys

1 5

<210> 2644

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2644

Ser Val

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2645

Lys Thr Asp Asn Asn Asn Ser Asn

1 5

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2646

Lys Asp Asp Lys Asp Lys Phe

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2647

Ser Ala Gly Ala Ser Asn

1 5

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2648

Ser Thr Asp Pro Ala Thr Gly Asp Val His

1 5 10

<210> 2649

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2649

Ala Asn

1

<210> 2650

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2650

Asp Asn Asn Gly Leu Tyr Thr

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<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2651

Ser Glu Thr Ala Gly Ser Thr

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<210> 2652

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2652

Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu

1 5 10

<210> 2653

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2653

Asn Pro Gly Gly Thr Ala Gly Asn Arg

1 5

<210> 2654

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2654

Ala Asn

1

<210> 2655

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2655

Leu Asp Gln Asn Asn Asn Ser Asn

1 5

<210> 2656

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2656

Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe

1 5

<210> 2657

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2657

Gly Ala Thr Asn Lys Thr

1 5

<210> 2658

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2658

Asn Thr Ala Ala Gln Thr Gln Val Val Asn

1 5 10

<210> 2659

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2659

Thr Gly

1

<210> 2660

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2660

Asp Ser Gln Gly Val Tyr Ser

1 5

<210> 2661

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2661

Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr

1 5

<210> 2662

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2662

Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu

1 5 10

<210> 2663

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2663

Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln

1 5

<210> 2664

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2664

Ala Asn

1

<210> 2665

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2665

Thr Gly Gln Asn Asn Asn Ser Asn

1 5

<210> 2666

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2666

Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe

1 5

<210> 2667

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2667

Asn Ala Ala Arg Asp Asn

1 5

<210> 2668

<211> 11

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2668

Asn Thr Ala Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser

1 5 10

<210> 2669

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2669

Thr Ser

1

<210> 2670

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2670

Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser

1 5

<210> 2671

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2671

Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser

1 5

<210> 2672

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2672

Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu

1 5 10

<210> 2673

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2673

Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln

1 5

<210> 2674

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2674

Ala Val

1

<210> 2675

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2675

Val Thr Gln Asn Asn Asn Ser Glu

1 5

<210> 2676

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2676

Lys Glu Gly Glu Asp Arg Phe

1 5

<210> 2677

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2677

Gly Thr Gly Arg Asp Asn

1 5

<210> 2678

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2678

Gln Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln

1 5 10

<210> 2679

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2679

Asn Asn

1

<210> 2680

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2680

Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser

1 5

<210> 2681

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2681

Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 2682

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2682

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu

1 5 10

<210> 2683

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2683

Gln Thr Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gln

1 5

<210> 2684

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2684

Ala Asn

1

<210> 2685

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2685

Thr Asn Gln Asn Asn Asn Ser Asn

1 5

<210> 2686

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2686

Lys Asp Asp Asp Asp Arg Phe

1 5

<210> 2687

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2687

Gly Ala Gly Asn Asp Gly

1 5

<210> 2688

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2688

Asn Thr Gln Ala Gln Thr Gly Leu Val His

1 5 10

<210> 2689

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2689

Thr Asn

1

<210> 2690

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2690

Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser

1 5

<210> 2691

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2691

Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 2692

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2692

Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu

1 5 10

<210> 2693

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2693

Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln

1 5

<210> 2694

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2694

Ser Ala

1

<210> 2695

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2695

Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn

1 5

<210> 2696

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2696

Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe

1 5

<210> 2697

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2697

Gly Ala Gly Lys Asp Asn

1 5

<210> 2698

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2698

Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn

1 5 10

<210> 2699

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2699

Thr Asn

1

<210> 2700

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2700

Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Ser

1 5

<210> 2701

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2701

Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 2702

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2702

Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu

1 5 10

<210> 2703

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2703

Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln

1 5

<210> 2704

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2704

Ser Ala

1

<210> 2705

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2705

Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn

1 5

<210> 2706

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2706

Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe

1 5

<210> 2707

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2707

Gly Ala Gly Arg Asp Asn

1 5

<210> 2708

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2708

Asn Thr Gly Pro Ile Val Gly Asn Val Asn

1 5 10

<210> 2709

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2709

Thr Asn

1

<210> 2710

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2710

Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser

1 5

<210> 2711

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2711

Arg Leu Gly Thr Thr Ser Ser Ser

1 5

<210> 2712

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2712

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys

1 5 10

<210> 2713

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2713

Gly Glu Thr Leu Asn Gln Gly Asn Ala

1 5

<210> 2714

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2714

Ala Phe

1

<210> 2715

<211> 12

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2715

Ala Ser Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 2716

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2716

Gly Pro Ser Asp Gly Asp Phe

1 5

<210> 2717

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2717

Val Thr Gly Asn Thr Thr

1 5

<210> 2718

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2718

Thr Thr Ala Pro Ile Thr Gly Asn Val Thr

1 5 10

<210> 2719

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2719

Ser Ser

1

<210> 2720

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2720

Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Thr

1 5

<210> 2721

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2721

Arg Ile Gly Thr Thr Ala Asn Ser

1 5

<210> 2722

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2722

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys

1 5 10

<210> 2723

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2723

Gly Asn Ser Leu Asn Gln Gly Thr Ala

1 5

<210> 2724

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2724

Ala Tyr

1

<210> 2725

<211> 12

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2725

Ala Asn Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 2726

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2726

Gly Ala Gly Asp Ser Asp Phe

1 5

<210> 2727

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2727

Pro Ser Gly Asn Thr Thr

1 5

<210> 2728

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2728

Thr Thr Ala Pro His Ile Ala Asn Leu Asp

1 5 10

<210> 2729

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2729

Asn Ser

1

<210> 2730

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2730

Asp Asn Ala Gly Asn Tyr His

1 5

<210> 2731

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2731

Arg Leu Gly Thr Thr Ser Asn Ser

1 5

<210> 2732

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2732

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys

1 5 10

<210> 2733

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2733

Gly Glu Thr Leu Asn Gln Gly Asn Ala

1 5

<210> 2734

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2734

Ala Phe

1

<210> 2735

<211> 12

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2735

Ala Ser Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 2736

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2736

Gly Pro Ser Asp Gly Asp Phe

1 5

<210> 2737

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2737

Val Thr Gly Asn Thr Thr

1 5

<210> 2738

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2738

Thr Thr Ala Pro Ile Thr Gly Asn Val Thr

1 5 10

<210> 2739

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2739

Ser Ser

1

<210> 2740

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2740

Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Thr

1 5

<210> 2741

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2741

Arg Leu Gly Ser Ser Asn Ala Ser

1 5

<210> 2742

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2742

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys

1 5 10

<210> 2743

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2743

Gly Gly Thr Leu Asn Gln Gly Asn Ser

1 5

<210> 2744

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2744

Ser Gly

1

<210> 2745

<211> 12

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2745

Ala Ser Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Gln Gly Arg Asn

1 5 10

<210> 2746

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2746

Ala Asn Asp Ala Thr Asp Phe

1 5

<210> 2747

<211> 6

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2747

Ile Thr Gly Asn Thr Thr

1 5

<210> 2748

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2748

Thr Thr Val Pro Thr Val Asp Asp Val Asp

1 5 10

<210> 2749

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2749

Asp Ser

1

<210> 2750

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2750

Asp Asn Ala Gly Ala Tyr Lys

1 5

<210> 2751

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2751

Arg Ile Gln Gly Pro Ser Gly Gly

1 5

<210> 2752

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2752

Ile Tyr Thr Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys

1 5 10

<210> 2753

<211> 9

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2753

Val Ser Gln Ala Gly Ser Ser Gly Arg

1 5

<210> 2754

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2754

Ala Ala

1

<210> 2755

<211> 12

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2755

Ala Ser Asn Ile Thr Lys Asn Asn Val Phe Ser Val

1 5 10

<210> 2756

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2756

Phe Ser Gly Glu Pro Asp Arg

1 5

<210> 2757

<211> 8

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2757

Val Tyr Asp Gln Thr Thr Ala Thr

1 5

<210> 2758

<211> 10

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2758

Val Thr Pro Gly Thr Arg Ala Ala Val Asn

1 5 10

<210> 2759

<211> 2

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2759

Ala Asp

1

<210> 2760

<211> 7

<212> PRT

<213> 依赖病毒属(Dependovirus)腺相关病毒

<400> 2760

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<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3001

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Pro Ala Gln Val Phe Ser Gln Ser Cys Val Trp Tyr Gly Glu Cys Gly

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Ile Ala Tyr Gly Asp Lys Arg Tyr Asn Cys Glu Tyr Ser Gly Pro Pro

35 40 45

Lys Pro Leu Pro Lys Asp Gly Tyr Asp Leu Val Gln Glu Leu Cys Pro

50 55 60

Gly Phe Phe Phe Gly Asn Val Ser Leu Cys Cys Asp Val Arg Gln Leu

65 70 75 80

Gln Thr Leu Lys Asp Asn Leu Gln Leu Pro Leu Gln Phe Leu Ser Arg

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Cys Ser Pro Arg Gln Ser Gln Phe Leu Asn Val Thr Ala Thr Glu Asp

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130 135 140

Gln Tyr Tyr Val Gly Gln Ser Phe Ala Asn Ala Met Tyr Asn Ala Cys

145 150 155 160

Arg Asp Val Glu Ala Pro Ser Ser Asn Asp Lys Ala Leu Gly Leu Leu

165 170 175

Cys Gly Lys Asp Ala Asp Ala Cys Asn Ala Thr Asn Trp Ile Glu Tyr

180 185 190

Met Phe Asn Lys Asp Asn Gly Gln Ala Pro Phe Thr Ile Thr Pro Val

195 200 205

Phe Ser Asp Phe Pro Val His Gly Met Glu Pro Met Asn Asn Ala Thr

210 215 220

Lys Gly Cys Asp Glu Ser Val Asp Glu Val Thr Ala Pro Cys Ser Cys

225 230 235 240

Gln Asp Cys Ser Ile Val Cys Gly Pro Lys Pro Gln Pro Pro Pro Pro

245 250 255

Pro Ala Pro Trp Thr Ile Leu Gly Leu Asp Ala Met Tyr Val Ile Met

260 265 270

Trp Ile Thr Tyr Met Ala Phe Leu Leu Val Phe Phe Gly Ala Phe Phe

275 280 285

Ala Val Trp Cys Tyr Arg Lys Arg Tyr Phe Val Ser Glu Tyr Thr Pro

290 295 300

Ile Asp Ser Asn Ile Ala Phe Ser Val Asn Ala Ser Asp Lys Gly Glu

305 310 315 320

Ala Ser Cys Cys Asp Pro Val Ser Ala Ala Phe Glu Gly Cys Leu Arg

325 330 335

Arg Leu Phe Thr Arg Trp Gly Ser Phe Cys Val Arg Asn Pro Gly Cys

340 345 350

Val Ile Phe Phe Ser Leu Val Phe Ile Thr Ala Cys Ser Ser Gly Leu

355 360 365

Val Phe Val Arg Val Thr Thr Asn Pro Val Asp Leu Trp Ser Ala Pro

370 375 380

Ser Ser Gln Ala Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Phe Asp Gln His Phe Gly

385 390 395 400

Pro Phe Phe Arg Thr Glu Gln Leu Ile Ile Arg Ala Pro Leu Thr Asp

405 410 415

Lys His Ile Tyr Gln Pro Tyr Pro Ser Gly Ala Asp Val Pro Phe Gly

420 425 430

Pro Pro Leu Asp Ile Gln Ile Leu His Gln Val Leu Asp Leu Gln Ile

435 440 445

Ala Ile Glu Asn Ile Thr Ala Ser Tyr Asp Asn Glu Thr Val Thr Leu

450 455 460

Gln Asp Ile Cys Leu Ala Pro Leu Ser Pro Tyr Asn Thr Asn Cys Thr

465 470 475 480

Ile Leu Ser Val Leu Asn Tyr Phe Gln Asn Ser His Ser Val Leu Asp

485 490 495

His Lys Lys Gly Asp Asp Phe Phe Val Tyr Ala Asp Tyr His Thr His

500 505 510

Phe Leu Tyr Cys Val Arg Ala Pro Ala Ser Leu Asn Asp Thr Ser Leu

515 520 525

Leu His Asp Pro Cys Leu Gly Thr Phe Gly Gly Pro Val Phe Pro Trp

530 535 540

Leu Val Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Gln Asn Tyr Asn Asn Ala Thr Ala

545 550 555 560

Leu Val Ile Thr Phe Pro Val Asn Asn Tyr Tyr Asn Asp Thr Glu Lys

565 570 575

Leu Gln Arg Ala Gln Ala Trp Glu Lys Glu Phe Ile Asn Phe Val Lys

580 585 590

Asn Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Thr Ile Ser Phe Thr Ala Glu Arg Ser

595 600 605

Ile Glu Asp Glu Leu Asn Arg Glu Ser Asp Ser Asp Val Phe Thr Val

610 615 620

Val Ile Ser Tyr Ala Ile Met Phe Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Leu Gly

625 630 635 640

His Ile Lys Ser Cys Arg Arg Leu Leu Val Asp Ser Lys Val Ser Leu

645 650 655

Gly Ile Ala Gly Ile Leu Ile Val Leu Ser Ser Val Ala Cys Ser Leu

660 665 670

Gly Val Phe Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Leu Thr Leu Ile Val Ile Glu

675 680 685

Val Ile Pro Phe Leu Val Leu Ala Val Gly Val Asp Asn Ile Phe Ile

690 695 700

Leu Val Gln Ala Tyr Gln Arg Asp Glu Arg Leu Gln Gly Glu Thr Leu

705 710 715 720

Asp Gln Gln Leu Gly Arg Val Leu Gly Glu Val Ala Pro Ser Met Phe

725 730 735

Leu Ser Ser Phe Ser Glu Thr Val Ala Phe Phe Leu Gly Ala Leu Ser

740 745 750

Val Met Pro Ala Val His Thr Phe Ser Leu Phe Ala Gly Leu Ala Val

755 760 765

Phe Ile Asp Phe Leu Leu Gln Ile Thr Cys Phe Val Ser Leu Leu Gly

770 775 780

Leu Asp Ile Lys Arg Gln Glu Lys Asn Arg Leu Asp Ile Phe Cys Cys

785 790 795 800

Val Arg Gly Ala Glu Asp Gly Thr Ser Val Gln Ala Ser Glu Ser Cys

805 810 815

Leu Phe Arg Phe Phe Lys Asn Ser Tyr Ser Pro Leu Leu Leu Lys Asp

820 825 830

Trp Met Arg Pro Ile Val Ile Ala Ile Phe Val Gly Val Leu Ser Phe

835 840 845

Ser Ile Ala Val Leu Asn Lys Val Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Leu

850 855 860

Ser Met Pro Asp Asp Ser Tyr Met Val Asp Tyr Phe Lys Ser Ile Ser

865 870 875 880

Gln Tyr Leu His Ala Gly Pro Pro Val Tyr Phe Val Leu Glu Glu Gly

885 890 895

His Asp Tyr Thr Ser Ser Lys Gly Gln Asn Met Val Cys Gly Gly Met

900 905 910

Gly Cys Asn Asn Asp Ser Leu Val Gln Gln Ile Phe Asn Ala Ala Gln

915 920 925

Leu Asp Asn Tyr Thr Arg Ile Gly Phe Ala Pro Ser Ser Trp Ile Asp

930 935 940

Asp Tyr Phe Asp Trp Val Lys Pro Gln Ser Ser Cys Cys Arg Val Asp

945 950 955 960

Asn Ile Thr Asp Gln Phe Cys Asn Ala Ser Val Val Asp Pro Ala Cys

965 970 975

Val Arg Cys Arg Pro Leu Thr Pro Glu Gly Lys Gln Arg Pro Gln Gly

980 985 990

Gly Asp Phe Met Arg Phe Leu Pro Met Phe Leu Ser Asp Asn Pro Asn

995 1000 1005

Pro Lys Cys Gly Lys Gly Gly His Ala Ala Tyr Ser Ser Ala Val

1010 1015 1020

Asn Ile Leu Leu Gly His Gly Thr Arg Val Gly Ala Thr Tyr Phe

1025 1030 1035

Met Thr Tyr His Thr Val Leu Gln Thr Ser Ala Asp Phe Ile Asp

1040 1045 1050

Ala Leu Lys Lys Ala Arg Leu Ile Ala Ser Asn Val Thr Glu Thr

1055 1060 1065

Met Gly Ile Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Ser Val

1070 1075 1080

Phe Tyr Val Phe Tyr Glu Gln Tyr Leu Thr Ile Ile Asp Asp Thr

1085 1090 1095

Ile Phe Asn Leu Gly Val Ser Leu Gly Ala Ile Phe Leu Val Thr

1100 1105 1110

Met Val Leu Leu Gly Cys Glu Leu Trp Ser Ala Val Ile Met Cys

1115 1120 1125

Ala Thr Ile Ala Met Val Leu Val Asn Met Phe Gly Val Met Trp

1130 1135 1140

Leu Trp Gly Ile Ser Leu Asn Ala Val Ser Leu Val Asn Leu Val

1145 1150 1155

Met Ser Cys Gly Ile Ser Val Glu Phe Cys Ser His Ile Thr Arg

1160 1165 1170

Ala Phe Thr Val Ser Met Lys Gly Ser Arg Val Glu Arg Ala Glu

1175 1180 1185

Glu Ala Leu Ala His Met Gly Ser Ser Val Phe Ser Gly Ile Thr

1190 1195 1200

Leu Thr Lys Phe Gly Gly Ile Val Val Leu Ala Phe Ala Lys Ser

1205 1210 1215

Gln Ile Phe Gln Ile Phe Tyr Phe Arg Met Tyr Leu Ala Met Val

1220 1225 1230

Leu Leu Gly Ala Thr His Gly Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu

1235 1240 1245

Ser Tyr Ile Gly Pro Ser Val Asn Lys Ala Lys Ser Cys Ala Thr

1250 1255 1260

Glu Glu Arg Tyr Lys Gly Thr Glu Arg Glu Arg Leu Leu Asn Phe

1265 1270 1275

<210> 3002

<211> 3834

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3002

atgaccgctc gcggcctggc ccttggcctc ctcctgctgc tactgtgtcc agcgcaggtg 60

ttttcacagt cctgtgtttg gtatggagag tgtggaattg catatgggga caagaggtac 120

aattgcgaat attctggccc accaaaacca ttgccaaagg atggatatga cttagtgcag 180

gaactctgtc caggattctt ctttggcaat gtcagtctct gttgtgatgt tcggcagctt 240

cagacactaa aagacaacct gcagctgcct ctacagtttc tgtccagatg tccatcctgt 300

ttttataacc tactgaacct gttttgtgag ctgacatgta gccctcgaca gagtcagttt 360

ttgaatgtta cagctactga agattatgtt gatcctgtta caaaccagac gaaaacaaat 420

gtgaaagagt tacaatacta cgtcggacag agttttgcca atgcaatgta caatgcctgc 480

cgggatgtgg aggccccctc aagtaatgac aaggccctgg gactcctgtg tgggaaggac 540

gctgacgcct gtaatgccac caactggatt gaatacatgt tcaataagga caatggacag 600

gcacctttta ccatcactcc tgtgttttca gattttccag tccatgggat ggagcccatg 660

aacaatgcca ccaaaggctg tgacgagtct gtggatgagg tcacagcacc atgtagctgc 720

caagactgct ctattgtctg tggccccaag ccccagcccc cacctcctcc tgctccctgg 780

acgatccttg gcttggacgc catgtatgtc atcatgtgga tcacctacat ggcgtttttg 840

cttgtgtttt ttggagcatt ttttgcagtg tggtgctaca gaaaacggta ttttgtctcc 900

gagtacactc ccatcgatag caatatagct ttttctgtta atgcaagtga caaaggagag 960

gcgtcctgct gtgaccctgt cagcgcagca tttgagggct gcttgaggcg gctgttcaca 1020

cgctgggggt ctttctgcgt ccgaaaccct ggctgtgtca ttttcttctc gctggtcttc 1080

attactgcgt gttcgtcagg cctggtgttt gtccgggtca caaccaatcc agttgacctc 1140

tggtcagccc ccagcagcca ggctcgcctg gaaaaagagt actttgacca gcactttggg 1200

cctttcttcc ggacggagca gctcatcatc cgggcccctc tcactgacaa acacatttac 1260

cagccatacc cttcgggagc tgatgtaccc tttggacctc cgcttgacat acagatactg 1320

caccaggttc ttgacttaca aatagccatc gaaaacatta ctgcctctta tgacaatgag 1380

actgtgacac ttcaagacat ctgcttggcc cctctttcac cgtataacac gaactgcacc 1440

attttgagtg tgttaaatta cttccagaac agccattccg tgctggacca caagaaaggg 1500

gacgacttct ttgtgtatgc cgattaccac acgcactttc tgtactgcgt acgggctcct 1560

gcctctctga atgatacaag tttgctccat gacccttgtc tgggtacgtt tggtggacca 1620

gtgttcccgt ggcttgtgtt gggaggctat gatgatcaaa actacaataa cgccactgcc 1680

cttgtgatta ccttccctgt caataattac tataatgata cagagaagct ccagagggcc 1740

caggcctggg aaaaagagtt tattaatttt gtgaaaaact acaagaatcc caatctgacc 1800

atttccttca ctgctgaacg aagtattgaa gatgaactaa atcgtgaaag tgacagtgat 1860

gtcttcaccg ttgtaattag ctatgccatc atgtttctat atatttccct agccttgggg 1920

cacatcaaaa gctgtcgcag gcttctggtg gattcgaagg tctcactagg catcgcgggc 1980

atcttgatcg tgctgagctc ggtggcttgc tccttgggtg tcttcagcta cattgggttg 2040

cccttgaccc tcattgtgat tgaagtcatc ccgttcctgg tgctggctgt tggagtggac 2100

aacatcttca ttctggtgca ggcctaccag agagatgaac gtcttcaagg ggaaaccctg 2160

gatcagcagc tgggcagggt cctaggagaa gtggctccca gtatgttcct gtcatccttt 2220

tctgagactg tagcattttt cttaggagca ttgtccgtga tgccagccgt gcacaccttc 2280

tctctctttg cgggattggc agtcttcatt gactttcttc tgcagattac ctgtttcgtg 2340

agtctcttgg ggttagacat taaacgtcaa gagaaaaatc ggctagacat cttttgctgt 2400

gtcagaggtg ctgaagatgg aacaagcgtc caggcctcag agagctgttt gtttcgcttc 2460

ttcaaaaact cctattctcc acttctgcta aaggactgga tgagaccaat tgtgatagca 2520

atatttgtgg gtgttctgtc attcagcatc gcagtcctga acaaagtaga tattggattg 2580

gatcagtctc tttcgatgcc agatgactcc tacatggtgg attatttcaa atccatcagt 2640

cagtacctgc atgcgggtcc gcctgtgtac tttgtcctgg aggaagggca cgactacact 2700

tcttccaagg ggcagaacat ggtgtgcggc ggcatgggct gcaacaatga ttccctggtg 2760

cagcagatat ttaacgcggc gcagctggac aactataccc gaataggctt cgccccctcg 2820

tcctggatcg acgattattt cgactgggtg aagccacagt cgtcttgctg tcgagtggac 2880

aatatcactg accagttctg caatgcttca gtggttgacc ctgcctgcgt tcgctgcagg 2940

cctctgactc cggaaggcaa acagaggcct caggggggag acttcatgag attcctgccc 3000

atgttccttt cggataaccc taaccccaag tgtggcaaag ggggacatgc tgcctatagt 3060

tctgcagtta acatcctcct tggccatggc accagggtcg gagccacgta cttcatgacc 3120

taccacaccg tgctgcagac ctctgctgac tttattgacg ctctgaagaa agcccgactt 3180

atagccagta atgtcaccga aaccatgggc attaacggca gtgcctaccg agtatttcct 3240

tacagtgtgt tttatgtctt ctacgaacag tacctgacca tcattgacga cactatcttc 3300

aacctcggtg tgtccctggg cgcgatattt ctggtgacca tggtcctcct gggctgtgag 3360

ctctggtctg cagtcatcat gtgtgccacc atcgccatgg tcttggtcaa catgtttgga 3420

gttatgtggc tctggggcat cagtctgaac gctgtatcct tggtcaacct ggtgatgagc 3480

tgtggcatct ccgtggagtt ctgcagccac ataaccagag cgttcacggt gagcatgaaa 3540

ggcagccgcg tggagcgcgc ggaagaggca cttgcccaca tgggcagctc cgtgttcagt 3600

ggaatcacac ttacaaaatt tggagggatt gtggtgttgg cttttgccaa atctcaaatt 3660

ttccagatat tctacttcag gatgtatttg gccatggtct tactgggagc cactcacgga 3720

ttaatatttc tccctgtctt actcagttac atagggccat cagtaaataa agccaaaagt 3780

tgtgccactg aagagcgata caaaggaaca gagcgcgaac ggcttctaaa tttc 3834

<210> 3003

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'反向末端重复序列

<400> 3003

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc t 141

<210> 3004

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'反向末端重复序列

<400> 3004

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<210> 3005

<211> 278

<212> DNA

<213> 原鸡(Gallus gallus)

<400> 3005

tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60

ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120

ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180

cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240

ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278

<210> 3006

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GUSB240启动子

<400> 3006

cggctggggc tgagggtgag ggtcccgttt ccccaaaggc ctagcctggg gttccagcca 60

caagccctac cgggcagcgc ccggccccgc ccctccaggc ctggcactcg tcctcaacca 120

agatggcgcg gatggcttca ggcgcatcac gacaccggcg cgtcacgcga cccgccctac 180

gggcacctcc cgcgcttttc ttagcgccgc agacggtggc cgagcggggg accgggaagc 240

<210> 3007

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GUSB379启动子

<400> 3007

attcctgctg ggaaaagcaa gtggaggtgc tccttgaaga aacaggggga tcccaccgat 60

ctcaggggtt ctgttctggc ctgcggccct ggatcgtcca gcctgggtcg gggtggggag 120

cagacctcgc ccttatcggc tggggctgag ggtgagggtc ccgtttcccc aaaggcctag 180

cctggggttc cagccacaag ccctaccggg cagcgcccgg ccccgcccct ccaggcctgg 240

cactcgtcct caaccaagat ggcgcggatg gcttcaggcg catcacgaca ccggcgcgtc 300

acgcgacccg ccctacgggc acctcccgcg cttttcttag cgccgcagac ggtggtcgag 360

cgggggaccg ggaagctta 379

<210> 3008

<211> 146

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 单纯疱疹病毒

<400> 3008

atgacacaaa ccccgcccag cgtcttgtca ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg 60

gggcggcgcg gtcccaggtc cacttcgcat attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc 120

gagcgaccct gcagcgaccc gcttaa 146

<210> 3009

<211> 301

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 巨细胞病毒物种

<400> 3009

tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 60

gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 120

ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 180

tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 240

gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 300

g 301

<210> 3010

<211> 97

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 猿猴病毒40

<400> 3010

gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60

agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97

<210> 3011

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合内含子

<400> 3011

gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60

cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120

tttctctcca cag 133

<210> 3012

<211> 122

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> SV40聚A信号

<400> 3012

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60

tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120

tt 122

<210> 3013

<211> 56

<212> DNA

<213> 家兔(Oryctolagus cuniculus)

<400> 3013

aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 56

<210> 3014

<211> 4685

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV转移盒1

<400> 3014

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc ttgcgtcgac tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc 180

tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt 240

gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg 300

aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc 360

gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc 420

ggcgggcgat gcatgtaagt ttagtctttt tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg 480

gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta gcaccggtcg 540

ccaccatgac cgctcgcggc ctggcccttg gcctcctcct gctgctactg tgtccagcgc 600

aggtgttttc acagtcctgt gtttggtatg gagagtgtgg aattgcatat ggggacaaga 660

ggtacaattg cgaatattct ggcccaccaa aaccattgcc aaaggatgga tatgacttag 720

tgcaggaact ctgtccagga ttcttctttg gcaatgtcag tctctgttgt gatgttcggc 780

agcttcagac actaaaagac aacctgcagc tgcctctaca gtttctgtcc agatgtccat 840

cctgttttta taacctactg aacctgtttt gtgagctgac atgtagccct cgacagagtc 900

agtttttgaa tgttacagct actgaagatt atgttgatcc tgttacaaac cagacgaaaa 960

caaatgtgaa agagttacaa tactacgtcg gacagagttt tgccaatgca atgtacaatg 1020

cctgccggga tgtggaggcc ccctcaagta atgacaaggc cctgggactc ctgtgtggga 1080

aggacgctga cgcctgtaat gccaccaact ggattgaata catgttcaat aaggacaatg 1140

gacaggcacc ttttaccatc actcctgtgt tttcagattt tccagtccat gggatggagc 1200

ccatgaacaa tgccaccaaa ggctgtgacg agtctgtgga tgaggtcaca gcaccatgta 1260

gctgccaaga ctgctctatt gtctgtggcc ccaagcccca gcccccacct cctcctgctc 1320

cctggacgat ccttggcttg gacgccatgt atgtcatcat gtggatcacc tacatggcgt 1380

ttttgcttgt gttttttgga gcattttttg cagtgtggtg ctacagaaaa cggtattttg 1440

tctccgagta cactcccatc gatagcaata tagctttttc tgttaatgca agtgacaaag 1500

gagaggcgtc ctgctgtgac cctgtcagcg cagcatttga gggctgcttg aggcggctgt 1560

tcacacgctg ggggtctttc tgcgtccgaa accctggctg tgtcattttc ttctcgctgg 1620

tcttcattac tgcgtgttcg tcaggcctgg tgtttgtccg ggtcacaacc aatccagttg 1680

acctctggtc agcccccagc agccaggctc gcctggaaaa agagtacttt gaccagcact 1740

ttgggccttt cttccggacg gagcagctca tcatccgggc ccctctcact gacaaacaca 1800

tttaccagcc atacccttcg ggagctgatg taccctttgg acctccgctt gacatacaga 1860

tactgcacca ggttcttgac ttacaaatag ccatcgaaaa cattactgcc tcttatgaca 1920

atgagactgt gacacttcaa gacatctgct tggcccctct ttcaccgtat aacacgaact 1980

gcaccatttt gagtgtgtta aattacttcc agaacagcca ttccgtgctg gaccacaaga 2040

aaggggacga cttctttgtg tatgccgatt accacacgca ctttctgtac tgcgtacggg 2100

ctcctgcctc tctgaatgat acaagtttgc tccatgaccc ttgtctgggt acgtttggtg 2160

gaccagtgtt cccgtggctt gtgttgggag gctatgatga tcaaaactac aataacgcca 2220

ctgcccttgt gattaccttc cctgtcaata attactataa tgatacagag aagctccaga 2280

gggcccaggc ctgggaaaaa gagtttatta attttgtgaa aaactacaag aatcccaatc 2340

tgaccatttc cttcactgct gaacgaagta ttgaagatga actaaatcgt gaaagtgaca 2400

gtgatgtctt caccgttgta attagctatg ccatcatgtt tctatatatt tccctagcct 2460

tggggcacat caaaagctgt cgcaggcttc tggtggattc gaaggtctca ctaggcatcg 2520

cgggcatctt gatcgtgctg agctcggtgg cttgctcctt gggtgtcttc agctacattg 2580

ggttgccctt gaccctcatt gtgattgaag tcatcccgtt cctggtgctg gctgttggag 2640

tggacaacat cttcattctg gtgcaggcct accagagaga tgaacgtctt caaggggaaa 2700

ccctggatca gcagctgggc agggtcctag gagaagtggc tcccagtatg ttcctgtcat 2760

ccttttctga gactgtagca tttttcttag gagcattgtc cgtgatgcca gccgtgcaca 2820

ccttctctct ctttgcggga ttggcagtct tcattgactt tcttctgcag attacctgtt 2880

tcgtgagtct cttggggtta gacattaaac gtcaagagaa aaatcggcta gacatctttt 2940

gctgtgtcag aggtgctgaa gatggaacaa gcgtccaggc ctcagagagc tgtttgtttc 3000

gcttcttcaa aaactcctat tctccacttc tgctaaagga ctggatgaga ccaattgtga 3060

tagcaatatt tgtgggtgtt ctgtcattca gcatcgcagt cctgaacaaa gtagatattg 3120

gattggatca gtctctttcg atgccagatg actcctacat ggtggattat ttcaaatcca 3180

tcagtcagta cctgcatgcg ggtccgcctg tgtactttgt cctggaggaa gggcacgact 3240

acacttcttc caaggggcag aacatggtgt gcggcggcat gggctgcaac aatgattccc 3300

tggtgcagca gatatttaac gcggcgcagc tggacaacta tacccgaata ggcttcgccc 3360

cctcgtcctg gatcgacgat tatttcgact gggtgaagcc acagtcgtct tgctgtcgag 3420

tggacaatat cactgaccag ttctgcaatg cttcagtggt tgaccctgcc tgcgttcgct 3480

gcaggcctct gactccggaa ggcaaacaga ggcctcaggg gggagacttc atgagattcc 3540

tgcccatgtt cctttcggat aaccctaacc ccaagtgtgg caaaggggga catgctgcct 3600

atagttctgc agttaacatc ctccttggcc atggcaccag ggtcggagcc acgtacttca 3660

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gcagg 4685

<210> 3015

<211> 4617

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV转移盒2

<400> 3015

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<220>

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gtgcagcaga tatttaacgc ggcgcagctg gacaactata cccgaatagg cttcgccccc 3360

tcgtcctgga tcgacgatta tttcgactgg gtgaagccac agtcgtcttg ctgtcgagtg 3420

gacaatatca ctgaccagtt ctgcaatgct tcagtggttg accctgcctg cgttcgctgc 3480

aggcctctga ctccggaagg caaacagagg cctcaggggg gagacttcat gagattcctg 3540

cccatgttcc tttcggataa ccctaacccc aagtgtggca aagggggaca tgctgcctat 3600

agttctgcag ttaacatcct ccttggccat ggcaccaggg tcggagccac gtacttcatg 3660

acctaccaca ccgtgctgca gacctctgct gactttattg acgctctgaa gaaagcccga 3720

cttatagcca gtaatgtcac cgaaaccatg ggcattaacg gcagtgccta ccgagtattt 3780

ccttacagtg tgttttatgt cttctacgaa cagtacctga ccatcattga cgacactatc 3840

ttcaacctcg gtgtgtccct gggcgcgata tttctggtga ccatggtcct cctgggctgt 3900

gagctctggt ctgcagtcat catgtgtgcc accatcgcca tggtcttggt caacatgttt 3960

ggagttatgt ggctctgggg catcagtctg aacgctgtat ccttggtcaa cctggtgatg 4020

agctgtggca tctccgtgga gttctgcagc cacataacca gagcgttcac ggtgagcatg 4080

aaaggcagcc gcgtggagcg cgcggaagag gcacttgccc acatgggcag ctccgtgttc 4140

agtggaatca cacttacaaa atttggaggg attgtggtgt tggcttttgc caaatctcaa 4200

attttccaga tattctactt caggatgtat ttggccatgg tcttactggg agccactcac 4260

ggattaatat ttctccctgt cttactcagt tacatagggc catcagtaaa taaagccaaa 4320

agttgtgcca ctgaagagcg atacaaagga acagagcgcg aacggcttct aaatttctag 4380

gtttaaacaa gctttaagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 4440

aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag 4500

ctgcaataaa caagttctcg agccatgggc gcgccatcga tgaggaaccc ctagtgatgg 4560

agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg 4620

cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc 4680

agg 4683

<210> 3018

<211> 4663

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV转移盒5

<400> 3018

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc ttgcgtcgac cggctggggc tgagggtgag ggtcccgttt 180

ccccaaaggc ctagcctggg gttccagcca caagccctac cgggcagcgc ccggccccgc 240

ccctccaggc ctggcactcg tcctcaacca agatggcgcg gatggcttca ggcgcatcac 300

gacaccggcg cgtcacgcga cccgccctac gggcacctcc cgcgcttttc ttagcgccgc 360

agacggtggc cgagcggggg accgggaagc atgcatgtaa gtttagtctt tttgtctttt 420

atttcaggtc ccggatccgg tggtggtgca aatcaaagaa ctgctcctca gtggatgttg 480

cctttacttc tagcaccggt cgccaccatg accgctcgcg gcctggccct tatgaccgct 540

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ttggtatgga gagtgtggaa ttgcatatgg ggacaagagg tacaattgcg aatattctgg 660

cccaccaaaa ccattgccaa aggatggata tgacttagtg caggaactct gtccaggatt 720

cttctttggc aatgtcagtc tctgttgtga tgttcggcag cttcagacac taaaagacaa 780

cctgcagctg cctctacagt ttctgtccag atgtccatcc tgtttttata acctactgaa 840

cctgttttgt gagctgacat gtagccctcg acagagtcag tttttgaatg ttacagctac 900

tgaagattat gttgatcctg ttacaaacca gacgaaaaca aatgtgaaag agttacaata 960

ctacgtcgga cagagttttg ccaatgcaat gtacaatgcc tgccgggatg tggaggcccc 1020

ctcaagtaat gacaaggccc tgggactcct gtgtgggaag gacgctgacg cctgtaatgc 1080

caccaactgg attgaataca tgttcaataa ggacaatgga caggcacctt ttaccatcac 1140

tcctgtgttt tcagattttc cagtccatgg gatggagccc atgaacaatg ccaccaaagg 1200

ctgtgacgag tctgtggatg aggtcacagc accatgtagc tgccaagact gctctattgt 1260

ctgtggcccc aagccccagc ccccacctcc tcctgctccc tggacgatcc ttggcttgga 1320

cgccatgtat gtcatcatgt ggatcaccta catggcgttt ttgcttgtgt tttttggagc 1380

attttttgca gtgtggtgct acagaaaacg gtattttgtc tccgagtaca ctcccatcga 1440

tagcaatata gctttttctg ttaatgcaag tgacaaagga gaggcgtcct gctgtgaccc 1500

tgtcagcgca gcatttgagg gctgcttgag gcggctgttc acacgctggg ggtctttctg 1560

cgtccgaaac cctggctgtg tcattttctt ctcgctggtc ttcattactg cgtgttcgtc 1620

aggcctggtg tttgtccggg tcacaaccaa tccagttgac ctctggtcag cccccagcag 1680

ccaggctcgc ctggaaaaag agtactttga ccagcacttt gggcctttct tccggacgga 1740

gcagctcatc atccgggccc ctctcactga caaacacatt taccagccat acccttcggg 1800

agctgatgta ccctttggac ctccgcttga catacagata ctgcaccagg ttcttgactt 1860

acaaatagcc atcgaaaaca ttactgcctc ttatgacaat gagactgtga cacttcaaga 1920

catctgcttg gcccctcttt caccgtataa cacgaactgc accattttga gtgtgttaaa 1980

ttacttccag aacagccatt ccgtgctgga ccacaagaaa ggggacgact tctttgtgta 2040

tgccgattac cacacgcact ttctgtactg cgtacgggct cctgcctctc tgaatgatac 2100

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tgtcaataat tactataatg atacagagaa gctccagagg gcccaggcct gggaaaaaga 2280

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acgaagtatt gaagatgaac taaatcgtga aagtgacagt gatgtcttca ccgttgtaat 2400

tagctatgcc atcatgtttc tatatatttc cctagccttg gggcacatca aaagctgtcg 2460

caggcttctg gtggattcga aggtctcact aggcatcgcg ggcatcttga tcgtgctgag 2520

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tttcgactgg gtgaagccac agtcgtcttg ctgtcgagtg gacaatatca ctgaccagtt 3420

ctgcaatgct tcagtggttg accctgcctg cgttcgctgc aggcctctga ctccggaagg 3480

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ccctaacccc aagtgtggca aagggggaca tgctgcctat agttctgcag ttaacatcct 3600

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gacctctgct gactttattg acgctctgaa gaaagcccga cttatagcca gtaatgtcac 3720

cgaaaccatg ggcattaacg gcagtgccta ccgagtattt ccttacagtg tgttttatgt 3780

cttctacgaa cagtacctga ccatcattga cgacactatc ttcaacctcg gtgtgtccct 3840

gggcgcgata tttctggtga ccatggtcct cctgggctgt gagctctggt ctgcagtcat 3900

catgtgtgcc accatcgcca tggtcttggt caacatgttt ggagttatgt ggctctgggg 3960

catcagtctg aacgctgtat ccttggtcaa cctggtgatg agctgtggca tctccgtgga 4020

gttctgcagc cacataacca gagcgttcac ggtgagcatg aaaggcagcc gcgtggagcg 4080

cgcggaagag gcacttgccc acatgggcag ctccgtgttc agtggaatca cacttacaaa 4140

atttggaggg attgtggtgt tggcttttgc caaatctcaa attttccaga tattctactt 4200

caggatgtat ttggccatgg tcttactggg agccactcac ggattaatat ttctccctgt 4260

cttactcagt tacatagggc catcagtaaa taaagccaaa agttgtgcca ctgaagagcg 4320

atacaaagga acagagcgcg aacggcttct aaatttctag gtttaaacaa gctttaagat 4380

acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 4440

aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttctcg 4500

agccatgggc gcgccatcga tgaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4560

cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 4620

cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 4663

<210> 3019

<211> 4691

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV转移盒6

<400> 3019

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc ttgcgtcgac tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 180

ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 240

gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 300

ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 360

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catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggatgacaca aaccccgccc agcgtcttgt 480

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gcataccggt cgccaccatg accgctcgcg gcctggccct tggcctcctc ctgctgctac 660

tgtgtccagc gcaggtgttt tcacagtcct gtgtttggta tggagagtgt ggaattgcat 720

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gatatgactt agtgcaggaa ctctgtccag gattcttctt tggcaatgtc agtctctgtt 840

gtgatgttcg gcagcttcag acactaaaag acaacctgca gctgcctcta cagtttctgt 900

ccagatgtcc atcctgtttt tataacctac tgaacctgtt ttgtgagctg acatgtagcc 960

ctcgacagag tcagtttttg aatgttacag ctactgaaga ttatgttgat cctgttacaa 1020

accagacgaa aacaaatgtg aaagagttac aatactacgt cggacagagt tttgccaatg 1080

caatgtacaa tgcctgccgg gatgtggagg ccccctcaag taatgacaag gccctgggac 1140

tcctgtgtgg gaaggacgct gacgcctgta atgccaccaa ctggattgaa tacatgttca 1200

ataaggacaa tggacaggca ccttttacca tcactcctgt gttttcagat tttccagtcc 1260

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ctcctcctgc tccctggacg atccttggct tggacgccat gtatgtcatc atgtggatca 1440

cctacatggc gtttttgctt gtgttttttg gagcattttt tgcagtgtgg tgctacagaa 1500

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tcttctcgct ggtcttcatt actgcgtgtt cgtcaggcct ggtgtttgtc cgggtcacaa 1740

ccaatccagt tgacctctgg tcagccccca gcagccaggc tcgcctggaa aaagagtact 1800

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ctgacaaaca catttaccag ccataccctt cgggagctga tgtacccttt ggacctccgc 1920

ttgacataca gatactgcac caggttcttg acttacaaat agccatcgaa aacattactg 1980

cctcttatga caatgagact gtgacacttc aagacatctg cttggcccct ctttcaccgt 2040

ataacacgaa ctgcaccatt ttgagtgtgt taaattactt ccagaacagc cattccgtgc 2100

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actgcgtacg ggctcctgcc tctctgaatg atacaagttt gctccatgac ccttgtctgg 2220

gtacgtttgg tggaccagtg ttcccgtggc ttgtgttggg aggctatgat gatcaaaact 2280

acaataacgc cactgccctt gtgattacct tccctgtcaa taattactat aatgatacag 2340

agaagctcca gagggcccag gcctgggaaa aagagtttat taattttgtg aaaaactaca 2400

agaatcccaa tctgaccatt tccttcactg ctgaacgaag tattgaagat gaactaaatc 2460

gtgaaagtga cagtgatgtc ttcaccgttg taattagcta tgccatcatg tttctatata 2520

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cactaggcat cgcgggcatc ttgatcgtgc tgagctcggt ggcttgctcc ttgggtgtct 2640

tcagctacat tgggttgccc ttgaccctca ttgtgattga agtcatcccg ttcctggtgc 2700

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ttcaagggga aaccctggat cagcagctgg gcagggtcct aggagaagtg gctcccagta 2820

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tagacatctt ttgctgtgtc agaggtgctg aagatggaac aagcgtccag gcctcagaga 3060

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gaccaattgt gatagcaata tttgtgggtg ttctgtcatt cagcatcgca gtcctgaaca 3180

aagtagatat tggattggat cagtctcttt cgatgccaga tgactcctac atggtggatt 3240

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aagggcacga ctacacttct tccaaggggc agaacatggt gtgcggcggc atgggctgca 3360

acaatgattc cctggtgcag cagatattta acgcggcgca gctggacaac tatacccgaa 3420

taggcttcgc cccctcgtcc tggatcgacg attatttcga ctgggtgaag ccacagtcgt 3480

cttgctgtcg agtggacaat atcactgacc agttctgcaa tgcttcagtg gttgaccctg 3540

cctgcgttcg ctgcaggcct ctgactccgg aaggcaaaca gaggcctcag gggggagact 3600

tcatgagatt cctgcccatg ttcctttcgg ataaccctaa ccccaagtgt ggcaaagggg 3660

gacatgctgc ctatagttct gcagttaaca tcctccttgg ccatggcacc agggtcggag 3720

ccacgtactt catgacctac cacaccgtgc tgcagacctc tgctgacttt attgacgctc 3780

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cctaccgagt atttccttac agtgtgtttt atgtcttcta cgaacagtac ctgaccatca 3900

ttgacgacac tatcttcaac ctcggtgtgt ccctgggcgc gatatttctg gtgaccatgg 3960

tcctcctggg ctgtgagctc tggtctgcag tcatcatgtg tgccaccatc gccatggtct 4020

tggtcaacat gtttggagtt atgtggctct ggggcatcag tctgaacgct gtatccttgg 4080

tcaacctggt gatgagctgt ggcatctccg tggagttctg cagccacata accagagcgt 4140

tcacggtgag catgaaaggc agccgcgtgg agcgcgcgga agaggcactt gcccacatgg 4200

gcagctccgt gttcagtgga atcacactta caaaatttgg agggattgtg gtgttggctt 4260

ttgccaaatc tcaaattttc cagatattct acttcaggat gtatttggcc atggtcttac 4320

tgggagccac tcacggatta atatttctcc ctgtcttact cagttacata gggccatcag 4380

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ttctaaattt ctaggtttaa acaagcttaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg 4500

tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgag ccatgggcgc gccatcgatg aggaacccct 4560

agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc 4620

aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 4680

ctgcctgcag g 4691

<210> 3020

<211> 1278

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3020

Met Thr Ala Arg Gly Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys

1 5 10 15

Pro Ala Gln Val Phe Ser Gln Ser Cys Val Trp Tyr Gly Glu Cys Gly

20 25 30

Ile Ala Tyr Gly Asp Lys Arg Tyr Asn Cys Glu Tyr Ser Gly Pro Pro

35 40 45

Lys Pro Leu Pro Lys Asp Gly Tyr Asp Leu Val Gln Glu Leu Cys Pro

50 55 60

Gly Phe Phe Phe Gly Asn Val Ser Leu Cys Cys Asp Val Arg Gln Leu

65 70 75 80

Gln Thr Leu Lys Asp Asn Leu Gln Leu Pro Leu Gln Phe Leu Ser Arg

85 90 95

Cys Pro Ser Cys Phe Tyr Asn Leu Leu Asn Leu Phe Cys Glu Leu Thr

100 105 110

Cys Ser Pro Arg Gln Ser Gln Phe Leu Asn Val Thr Ala Thr Glu Asp

115 120 125

Tyr Val Asp Pro Val Thr Asn Gln Thr Lys Thr Asn Val Lys Glu Leu

130 135 140

Gln Tyr Tyr Val Gly Gln Ser Phe Ala Asn Ala Met Tyr Asn Ala Cys

145 150 155 160

Arg Asp Val Glu Ala Pro Ser Ser Asn Asp Lys Ala Leu Gly Leu Leu

165 170 175

Cys Gly Lys Asp Ala Asp Ala Cys Asn Ala Thr Asn Trp Ile Glu Tyr

180 185 190

Met Phe Asn Lys Asp Asn Gly Gln Ala Pro Phe Thr Ile Thr Pro Val

195 200 205

Phe Ser Asp Phe Pro Val His Gly Met Glu Pro Met Asn Asn Ala Thr

210 215 220

Lys Gly Cys Asp Glu Ser Val Asp Glu Val Thr Ala Pro Cys Ser Cys

225 230 235 240

Gln Asp Cys Ser Ile Val Cys Gly Pro Lys Pro Gln Pro Pro Pro Pro

245 250 255

Pro Ala Pro Trp Thr Ile Leu Gly Leu Asp Ala Met Tyr Val Ile Met

260 265 270

Trp Ile Thr Tyr Met Ala Phe Leu Leu Val Phe Phe Gly Ala Phe Phe

275 280 285

Ala Val Trp Cys Tyr Arg Lys Arg Tyr Phe Val Ser Glu Tyr Thr Pro

290 295 300

Ile Asp Ser Asn Ile Ala Phe Ser Val Asn Ala Ser Asp Lys Gly Glu

305 310 315 320

Ala Ser Cys Cys Asp Pro Val Ser Ala Ala Phe Glu Gly Cys Leu Arg

325 330 335

Arg Leu Phe Thr Arg Trp Gly Ser Phe Cys Val Arg Asn Pro Gly Cys

340 345 350

Val Ile Phe Phe Ser Leu Val Phe Ile Thr Ala Cys Ser Ser Gly Leu

355 360 365

Val Phe Val Arg Val Thr Thr Asn Pro Val Asp Leu Trp Ser Ala Pro

370 375 380

Ser Ser Gln Ala Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Phe Asp Gln His Phe Gly

385 390 395 400

Pro Phe Phe Arg Thr Glu Gln Leu Ile Ile Arg Ala Pro Leu Thr Asp

405 410 415

Lys His Ile Tyr Gln Pro Tyr Pro Ser Gly Ala Asp Val Pro Phe Gly

420 425 430

Pro Pro Leu Asp Ile Gln Ile Leu His Gln Val Leu Asp Leu Gln Ile

435 440 445

Ala Ile Glu Asn Ile Thr Ala Ser Tyr Asp Asn Glu Thr Val Thr Leu

450 455 460

Gln Asp Ile Cys Leu Ala Pro Leu Ser Pro Tyr Asn Thr Asn Cys Thr

465 470 475 480

Ile Leu Ser Val Leu Asn Tyr Phe Gln Asn Ser His Ser Val Leu Asp

485 490 495

His Lys Lys Gly Asp Asp Phe Phe Val Tyr Ala Asp Tyr His Thr His

500 505 510

Phe Leu Tyr Cys Val Arg Ala Pro Ala Ser Leu Asn Asp Thr Ser Leu

515 520 525

Leu His Asp Pro Cys Leu Gly Thr Phe Gly Gly Pro Val Phe Pro Trp

530 535 540

Leu Val Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Gln Asn Tyr Asn Asn Ala Thr Ala

545 550 555 560

Leu Val Ile Thr Phe Pro Val Asn Asn Tyr Tyr Asn Asp Thr Glu Lys

565 570 575

Leu Gln Arg Ala Gln Ala Trp Glu Lys Glu Phe Ile Asn Phe Val Lys

580 585 590

Asn Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Thr Ile Ser Phe Thr Ala Glu Arg Ser

595 600 605

Ile Glu Asp Glu Leu Asn Arg Glu Ser Asp Ser Asp Val Phe Thr Val

610 615 620

Val Ile Ser Tyr Ala Ile Met Phe Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Leu Gly

625 630 635 640

His Met Lys Ser Cys Arg Arg Leu Leu Val Asp Ser Lys Val Ser Leu

645 650 655

Gly Ile Ala Gly Ile Leu Ile Val Leu Ser Ser Val Ala Cys Ser Leu

660 665 670

Gly Val Phe Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Leu Thr Leu Ile Val Ile Glu

675 680 685

Val Ile Pro Phe Leu Val Leu Ala Val Gly Val Asp Asn Ile Phe Ile

690 695 700

Leu Val Gln Ala Tyr Gln Arg Asp Glu Arg Leu Gln Gly Glu Thr Leu

705 710 715 720

Asp Gln Gln Leu Gly Arg Val Leu Gly Glu Val Ala Pro Ser Met Phe

725 730 735

Leu Ser Ser Phe Ser Glu Thr Val Ala Phe Phe Leu Gly Ala Leu Ser

740 745 750

Val Met Pro Ala Val His Thr Phe Ser Leu Phe Ala Gly Leu Ala Val

755 760 765

Phe Ile Asp Phe Leu Leu Gln Ile Thr Cys Phe Val Ser Leu Leu Gly

770 775 780

Leu Asp Ile Lys Arg Gln Glu Lys Asn Arg Leu Asp Ile Phe Cys Cys

785 790 795 800

Val Arg Gly Ala Glu Asp Gly Thr Ser Val Gln Ala Ser Glu Ser Cys

805 810 815

Leu Phe Arg Phe Phe Lys Asn Ser Tyr Ser Pro Leu Leu Leu Lys Asp

820 825 830

Trp Met Arg Pro Ile Val Ile Ala Ile Phe Val Gly Val Leu Ser Phe

835 840 845

Ser Ile Ala Val Leu Asn Lys Val Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Leu

850 855 860

Ser Met Pro Asp Asp Ser Tyr Met Val Asp Tyr Phe Lys Ser Ile Ser

865 870 875 880

Gln Tyr Leu His Ala Gly Pro Pro Val Tyr Phe Val Leu Glu Glu Gly

885 890 895

His Asp Tyr Thr Ser Ser Lys Gly Gln Asn Met Val Cys Gly Gly Met

900 905 910

Gly Cys Asn Asn Asp Ser Leu Val Gln Gln Ile Phe Asn Ala Ala Gln

915 920 925

Leu Asp Asn Tyr Thr Arg Ile Gly Phe Ala Pro Ser Ser Trp Ile Asp

930 935 940

Asp Tyr Phe Asp Trp Val Lys Pro Gln Ser Ser Cys Cys Arg Val Asp

945 950 955 960

Asn Ile Thr Asp Gln Phe Cys Asn Ala Ser Val Val Asp Pro Ala Cys

965 970 975

Val Arg Cys Arg Pro Leu Thr Pro Glu Gly Lys Gln Arg Pro Gln Gly

980 985 990

Gly Asp Phe Met Arg Phe Leu Pro Met Phe Leu Ser Asp Asn Pro Asn

995 1000 1005

Pro Lys Cys Gly Lys Gly Gly His Ala Ala Tyr Ser Ser Ala Val

1010 1015 1020

Asn Ile Leu Leu Gly His Gly Thr Arg Val Gly Ala Thr Tyr Phe

1025 1030 1035

Met Thr Tyr His Thr Val Leu Gln Thr Ser Ala Asp Phe Ile Asp

1040 1045 1050

Ala Leu Lys Lys Ala Arg Leu Ile Ala Ser Asn Val Thr Glu Thr

1055 1060 1065

Met Gly Ile Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Ser Val

1070 1075 1080

Phe Tyr Val Phe Tyr Glu Gln Tyr Leu Thr Ile Ile Asp Asp Thr

1085 1090 1095

Ile Phe Asn Leu Gly Val Ser Leu Gly Ala Ile Phe Leu Val Thr

1100 1105 1110

Met Val Leu Leu Gly Cys Glu Leu Trp Ser Ala Val Ile Met Cys

1115 1120 1125

Ala Thr Ile Ala Met Val Leu Val Asn Met Phe Gly Val Met Trp

1130 1135 1140

Leu Trp Gly Ile Ser Leu Asn Ala Val Ser Leu Val Asn Leu Val

1145 1150 1155

Met Ser Cys Gly Ile Ser Val Glu Phe Cys Ser His Ile Thr Arg

1160 1165 1170

Ala Phe Thr Val Ser Met Lys Gly Ser Arg Val Glu Arg Ala Glu

1175 1180 1185

Glu Ala Leu Ala His Met Gly Ser Ser Val Phe Ser Gly Ile Thr

1190 1195 1200

Leu Thr Lys Phe Gly Gly Ile Val Val Leu Ala Phe Ala Lys Ser

1205 1210 1215

Gln Ile Phe Gln Ile Phe Tyr Phe Arg Met Tyr Leu Ala Met Val

1220 1225 1230

Leu Leu Gly Ala Thr His Gly Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu

1235 1240 1245

Ser Tyr Ile Gly Pro Ser Val Asn Lys Ala Lys Ser Cys Ala Thr

1250 1255 1260

Glu Glu Arg Tyr Lys Gly Thr Glu Arg Glu Arg Leu Leu Asn Phe

1265 1270 1275