植物乳杆菌菌株WKA86及其在制备防治口臭制品方面的用途与制品

摘要

本发明“植物乳杆菌菌株WKA86及其在制备防治口臭制品方面的用途与制品”属于微生物领域。所述菌株WKA86的保藏编号为：CCTCC NO:M 2022193。本发明还提供所述菌株WKA86在制备抑制口腔病原菌制品和/或调节免疫制品和/或防治口臭制品的用途。本发明还提供基于所述菌株WKA86的抑制口腔病原菌和/或防治口臭制品、和调节免疫制品。本发明的菌株WKA86对口腔病原菌有显著抑制作用，对溶菌酶，胃酸，胆汁酸盐有较强耐受性，并能显著降低牙龈卟啉单胞菌形成的生物膜，以及产生的VSC，并能促进细胞炎性因子表达，防治口臭，改善口腔健康。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及植物乳杆菌菌株WKA86及其在制备防治口臭制品方面的用途与制品。

背景技术

口臭或口臭是指口气中有难闻的气味。口臭不仅是一个牙齿问题，也是一个令人尴尬的社会问题。口臭一种细菌性口腔疾病。牙龈卟啉单胞菌是一种革兰阴性厌氧菌。研究表明，牙龈卟啉单胞菌造成口腔出现异味的机制主要有：通过降解L-半胱氨酸和甲硫氨酸产生硫化氢等挥发性硫化物（VSC）直接造成口臭；通过形成生物膜，为其他厌氧致臭菌提供适宜的生长环境，增强菌株抗逆性，进而导致口臭。

临床上主要通过清洁牙周、舌体等口腔环境，使用抗菌剂洗必泰、西吡氯铵等来治疗口臭，在短期内有效，但停止治疗后，致臭菌很有可能将重新在口腔内定植、增殖甚至成为口腔优势菌群，故口臭复发率较高。化学抗菌剂还有刺激口腔黏膜，使牙齿着色等副作用，长期使用会造成菌群失调，直接诱发细菌的生产选择压力，造成致臭菌的耐药性，长期疗效较差。因此，如何有效地建立口腔内良好菌群结构是彻底根治口臭的关键。近年来，研究者们聚集到生物制剂上，益生菌可能逐渐成为治疗口臭的重要手段之一。

益生菌在口腔疾病的防治方面具有显著功效，研究表明益生菌可以通过抑制致病菌定植，调节粘膜免疫等机制对口臭，龋齿等进行治疗，植物乳杆菌作为一种益生菌，被广泛应用于食品发酵，保健食品，药物等行业，其中植物乳杆菌调节肠道菌群，增强免疫力方面的文献较多，但植物乳杆菌对牙龈卟啉单胞菌形成的生物膜抑制作用和口腔益生特性研究较少，因此筛选一种可以抑制牙龈卟啉单胞菌，并且耐酸，耐溶菌酶能力强，活菌数高，能有效防治口臭，改善口腔环境的菌种有重要意义及应用价值。

发明内容

基于本领域现有技术存在的上述需求，本发明提供一种植物乳杆菌（

本发明的技术方案如下：

一株植物乳杆菌（

保藏编号为CCTCC NO: M 2022193的一株植物乳杆菌（

所述口腔病原菌选自牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、变异链球菌中的一种或一种以上；

优选地，所述调节免疫指：调节牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的细胞因子水平；

优选地，所述防治口臭指：抑制牙龈卟啉单胞菌产生VSC。

所述细胞因子选自IL-6、IL-8、IL-10中的一种或一种以上；

优选地，所述调节免疫指：降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-6水平，和/或降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-8水平，和/或提升降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-10水平。

一种抑制口腔病原菌和/或防治口臭制品，其特征在于，包括：活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022193的一株植物乳杆菌（

所述制品选自药物或食品。

所述制品还包括：辅料；

优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料。

一种调节免疫制品，包括：活性成分；其特征在于，所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022193的一株植物乳杆菌（

所述制品选自药物或食品。

所述制品还包括：辅料；

优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料。

在一些国家或地区专利法允许的情况下，本发明还请求保护保藏编号为CCTCCNO: M 2022193的一株植物乳杆菌（

本发明提供一株从健康人的粪便样本选出的植物乳杆菌，其微生物保藏编号CCTCC NO: M 2022193，分类命名为：植物乳杆菌。所述植物乳杆菌保藏于武汉大学菌种保藏中心。

本发明提供一种植物乳杆菌，耐溶菌酶能力强，对胃液，肠液具有很好耐受性，能很好适应口腔环境，及胃肠道环境，从而发挥益生作用。

本发明提供了一种能拮抗，抑制口腔致病菌的保健食品，保健品或药品。其特征在于：显著抑制包括牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌，变异链球菌在内的口腔致臭菌及致病菌。

本发明提供了一种上述植物乳杆菌在防治口臭，清新口气方面的应用，其特征在于，所述防治口臭包括：口腔致臭菌牙龈卟啉单胞菌生物膜含量显著降低，VSC值抑制率高达94.47%

本发明提供了一种预防及调节口腔炎症，降低牙周炎风险的产品。其特征在于，所述调节口腔炎症反应在于：显著降低细胞促炎因子IL-6，IL-8水平。

本发明提供了一种防治口臭，制备改善口腔健康的产品，其特征在于，包括植物乳杆菌，保藏编号为CCTCC NO: M 2022193。

优选地，所述产品为保健食品，药品和日化产品中至少一种；

优选地，所述食品包括口香糖，益生菌含片，酸奶。

优选地，所述日化产品包括漱口水，牙膏。

本发明筛选获得一株新的植物乳杆菌（

本发明植物乳杆菌菌株WKA86的保藏信息如下：

菌种保藏名称：WKA86；

保藏号：CCTCC NO: M 2022193；

分类命名：植物乳杆菌；

拉丁名：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学

保藏日期：2022年3月4日。

附图说明

图1是本发明实验例2对植物乳杆菌进行溶菌酶耐受性检测的柱形图。

图2是本发明实验例5对植物乳杆菌自聚能力及与口腔致臭菌共聚能力进行测定的柱形图。

图3是本发明实验例6对植物乳杆菌自身生物膜含量以及对牙龈卟啉单胞菌生物膜含量影响的柱形图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和实验例对本发明的具体内容和技术效果做进一步详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。

实验例4-9使用的牙龈卟啉单胞菌购自广东微生物菌种保藏中心。

实验例4使用的具核梭杆菌、变异链球菌购自广东微生物菌种保藏中心。

实验例9使用的唾液链球菌K12购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，FaDu细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

第1组实施例、本发明的菌株WKA86

本组实施例提供一株植物乳杆菌（

任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、培养、扩繁、发酵保藏编号为CCTCCNO: M 2022193的植物乳杆菌（

本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为CCTCC NO: M 2022193的植物乳杆菌（

本文中，发明内容、具体实施方式部分记载的植物乳杆菌、植物乳杆菌菌株、WKA86、菌株WKA86、

第2组实施例、本发明菌株WKA86的制品用途

本组实施例提供保藏编号为CCTCC NO: M 2022193的一株植物乳杆菌（

在一些实施例中，所述口腔病原菌选自牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、变异链球菌中的一种或一种以上；

优选地，所述调节免疫指：调节牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的细胞因子水平；

优选地，所述防治口臭指：抑制牙龈卟啉单胞菌产生VSC。

在另一些实施例中，所述细胞因子选自IL-6、IL-8、IL-10中的一种或一种以上；

优选地，所述调节免疫指：降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-6水平，和/或降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-8水平，和/或提升降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-10水平。

第3组实施例、本发明菌株WKA86的适应症用途

本组实施例提供保藏编号为CCTCC NO: M 2022193的一株植物乳杆菌（

在一些实施例中，所述口腔病原菌选自牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、变异链球菌中的一种或一种以上；

优选地，所述调节免疫指：调节牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的细胞因子水平；

优选地，所述防治口臭指：抑制牙龈卟啉单胞菌产生VSC。

在另一些实施例中，所述细胞因子选自IL-6、IL-8、IL-10中的一种或一种以上；

优选地，所述调节免疫指：降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-6水平，和/或降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-8水平，和/或提升降低牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的IL-10水平。

第4组实施例、本发明的抑制口腔病原菌和/或防治口臭制品

本组实施例提供一种抑制口腔病原菌和/或防治口臭制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种抑制口腔病原菌和/或防治口臭制品包括：活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022193的一株植物乳杆菌（

在一些具体的实施例中，所述制品为药物。

在另一些实施例中，所述制品为食品。

在进一步的实施例中，所述制品还包括：辅料；

优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料。

在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。

根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备或食品生产加工工艺领域的常规技术手段（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述药用辅料或食用辅料进行选择和调配，并将CCTCC NO: M 2022193的植物乳杆菌（

第5组实施例、本发明的调节免疫制品

本组实施例提供一种调节免疫制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种调节免疫制品包括：活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022193的一株植物乳杆菌（

在一些具体的实施例中，所述制品为药物。

在另一些实施例中，所述制品为食品。

在进一步的实施例中，所述制品还包括：辅料；

优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料。

在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。

根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备或食品生产加工工艺领域的常规技术手段（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述药用辅料或食用辅料进行选择和调配，并将CCTCC NO: M 2022193的植物乳杆菌（

实验例1、植物乳杆菌的分离筛选与鉴定

（1）菌株的分离筛选

采集健康大学生的粪便样本，取0.5g至4.5mL无菌生理盐水中，充分振荡分散样品，取100μL样品梯度稀释，选取合适梯度均匀涂布于MRS琼脂平板上，置于厌氧条件下，37℃培养36～48h后，挑选单菌落，进行革兰氏染色，镜检观察菌落形态特征，初步筛选疑似乳杆菌的菌株。菌株在MRS固体培养基上进行反复划线纯化培养，获得乳杆菌纯化菌株，将纯化菌株保藏在-80℃甘油管。

MRS培养基配方（g/L）：蛋白胨10、牛肉浸粉5、酵母粉5、葡萄糖20、无水乙酸钠5、柠檬酸氢二铵2、吐温80 1、K

（2）分子生物学鉴定

对筛选的目的菌株进行培养，收集菌体，提取基因组DNA，采用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT扩增，扩增其16S rDNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并对PCR产物进行测序。其中PCR反应体系：10×buffer 10μL，10mM dNTP 2μL，上下引物各1μL，DNA模板2μL，Taq酶0.5μL，ddH

菌种保藏名称：WKA86；

保藏号：CCTCC NO: M 2022193；

分类命名：植物乳杆菌；

拉丁名：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学

保藏日期：2022年3月4日。

实验例2、植物乳杆菌WKA86溶菌酶耐受性测定

在试管中加入200μL 含有不同浓度溶菌酶的MRS培养基10mL，溶菌酶浓度分别为：0.4mg/mL，0.8mg/mL，1.2mg/mL，1.6mg/mL，2.0mg/mL，3mg/mL,再按5%的接种量接种活化好的植物乳杆菌菌液，37℃培养24h，测定活菌数，以不添加溶菌酶为对照实验，并计算存活率：存活率=含溶菌酶活菌数/不含溶菌酶活菌数×100%。实验结果见图1。

在 0~1.2 mg/mL 浓度下的溶菌酶基本不影响植物乳杆菌WKA86的生长，当溶菌酶浓度高达1.6mg/mL时，存活率为70.4%；当溶菌酶浓度为2.0mg/mL时，存活率为61.9%；当溶菌酶浓度为3.0mg/mL时，存活率为51.6%。以存活率大于60%，作为植物乳杆菌WKA86对溶菌酶具有高耐受性为依据，实验结果表明：植物乳杆菌WKA86对溶菌酶的最高耐受浓度为2mg/mL，远高于人口腔唾液中溶菌酶浓度（0~57 μg/mL），因此，植物乳杆菌WKA86能耐受口腔环境，有较高耐受性。

实验例3、胃肠道耐受性实验

人工胃液：配制PBS溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

人工肠液：配制PBS溶液，加入0.1%胰蛋白酶和0.3%的牛胆粉，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

将待测菌株活化2代后调整菌液浓度为10

实验结果表明，胃液消化3h，植物乳杆菌WKA86存活率为91.85%，肠液消化3h，植物乳杆菌存活率为93.85%，这表明植物乳杆菌WKA86有较强的耐胃酸和肠液的能力。

表1. 模拟人工胃液和人工肠液试验数据表

实验例4、植物乳杆菌WKA86对口腔有害菌的抑制能力

将牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、变异链球菌分别接种于液体BHI培养基中，37℃厌氧培养24h，活化2代后，进行抑菌实验。采用牛津杯双层平板法，在无菌平皿加入10mL琼脂培养基凝固后，放入牛津杯，将致病菌按一定比例混合到BHI培养基中，体系致病菌活菌数在10

表2. 植物乳杆菌WKA86对口腔病原菌的抑菌圈直径

由上表可知，植物乳杆菌WKA86能有效抑制口腔内病原菌，尤其是牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌，抑菌圈直径分别为32mm，29mm，显示出较强的抑制能力。

实验例5、植物乳杆菌WKA86自聚能力和与牙龈卟啉单胞菌共聚能力测定

将活化2代后的植物乳杆菌WKA86离心，收集菌体，PBS缓冲液清洗菌体2次后，重悬调整OD600为0.6左右。取8mL菌液，室温静置孵育2h、5h、21h、24h，吸取上清测定菌悬液在600nm处的吸光值(A)，重复3次测定，计算菌株自聚力。自聚力%=1-（A

牙龈卟啉单胞菌活化后，离心，收集菌体，PBS缓冲液清洗菌体2次后，重悬调整OD600为0.4左右。取4mL植物乳杆菌WKA86与4mL病原菌菌液等体积混合，涡旋，充分混匀，室温静置孵育2h、5h、21h、24h后，分别吸取上清测定菌悬液在600nm处的吸光值(A)，重复3次测定，计算菌株与病原菌的共聚力。共聚力(%)=[(Ax+Ay)/2-A(x+y)]/[(Ax+Ay)/2]×100%。其中Ax代表植物乳杆菌WKA86初始OD600，Ay代表病原菌的初始OD600，A(x + y)代表混合后在不同测定时间的OD600。实验结果见图2。

如图2所示，植物乳杆菌WKA86在2h时自聚能力为10.5%，而在5h时自聚能力显著增加到43.9%，逐步上升在24h达到60.7%。植物乳杆菌WKA86自聚能力较强表明在口腔中的定植能力较强。植物乳杆菌WKA86与牙龈卟啉单胞菌有较强的共聚能力，在2h时，与与牙龈卟啉单胞菌共聚力为12.9%，5h时为46.6%随着时间的延长，共聚能力增强，在24h时，植物乳杆菌WKA86与牙龈卟啉单胞菌的共聚能力为63.8%。这表明植物乳杆菌WKA86可以通过共聚的方式去除病原菌，发挥益生作用，改善口腔微生态，清新口气。

实验例6、植物乳杆菌WKA86对FaDu细胞黏附性测定

将菌株置于MRS培养基中培养至对数生长期，然后取出离心、收集菌体，用PBS洗涤3次后，将菌体重悬于不含双抗的DMEM培养液中，调节菌悬液的浓度为10

表3. 植物乳杆菌WKA86对FaDu细胞黏附能力测定

由上表3可知：植物乳杆菌WKA86对FaDu细胞具有较高的黏附能力，这表明，WKA86能黏附在口腔上皮细胞上，较好的定植在口腔中，从而发挥益生性能，调节口腔微生态平衡。

实验例7、植物乳杆菌生物膜形成能力和对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的抑制能力

将植物乳杆菌WKA86在MRS固体平板上划线活化后，挑取单菌落至MRS液体培养基中，在37℃下培养12h，调整菌悬液OD600为0.6左右。取200μL加到96孔板中，37℃下培养24h，用结晶紫(0.5% w/v)和番红(0.5% w/v)分别对益生菌生物膜进行染色。用PBS缓冲液冲洗微孔板。然后加入200μL乙醇(90%)，溶解生物膜染色剂，并测定655 nm的OD值。

按1%的接种量接种口腔病原菌至BHI培养基，37℃，200rpm/min摇床过夜培养，调整菌悬液OD为0.4左右。取牙龈卟啉单胞菌菌液200μL加到96孔板中，并在37℃下厌氧培养24h。培养过程中在0h，6h，12h加入50μL植物乳杆菌WKA86菌悬液，厌氧培养至24h。厌氧培养24 h后，去除表面浮游细菌，再加入200μL植物乳杆菌WKA86菌悬液，再厌氧培养24h。用结晶紫(0.5% w/v)和番红(0.5% w/v)分别对生物膜进行染色。用PBS缓冲液冲洗微孔板。然后加入200μL乙醇(90%)，溶解生物膜染色剂。以未添加益生菌的病原菌为阳性对照，以无菌BHI溶液为空白对照。测定655nm的OD值，实验重复三次，并计算生物膜减少量。减少量(%)=(A1-A2)/(A1-A0)×100%，其中A0为空白对照吸光度值，A1为阳性对照组吸光度值，A2为益生菌组吸光度值。实验结果如图3。

由图3可知，植物乳杆菌WKA86培养24h后，OD值为0.078，自成膜能力远小于牙龈卟啉单胞菌，表明植物乳杆菌WKA86形成生物膜量极少，这表明作为益生菌，植物乳杆菌WKA86在口腔环境中不会促进口腔生物膜的形成。植物乳杆菌WKA86介入后，牙龈卟啉单胞菌产生的生物膜量显著降低，在0h时，生物膜减少量达66.8%，随着介入的时间延长，生物膜减少量降低，这表明植物乳杆菌WKA86越早介入，抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成效果越好。在24h时，牙龈卟啉单胞菌生物膜基本形成，此时加入植物乳杆菌WKA86进行介导，仍然有较高的生物膜去除能力，这表明植物乳杆菌WKA86改善口臭的能力较强，可以作为防治口臭的产品应用到食品，药品，日化产品中。

实验例8、植物乳杆菌对牙龈卟啉单胞菌产生VSC的影响

将植物乳杆菌和牙龈卟啉单胞菌，分别调整至OD600为0.6左右，各取100μL按1:1的比例混合加到含1 mL的BHI培养基的15mL玻璃管中，37℃厌氧培养，使用便携式气相测定仪Oral Chroma 来进行测定VSC值。VSC指挥发性硫化物，它是造成口臭的重要原因。

表4. 植物乳杆菌WKA86对牙龈卟啉单胞菌产生VSC的影响

与对照组相比，植物乳杆菌WKA86与牙龈假单胞菌共培养时，形成的VSCs水平显著降低，VSC值由4.52ng/mL降到0.46ng/mL，抑制率高达94.47%。这表明，植物乳菌WKA86具有抑制VSC产生的能力，可成为应用于临床抑制口源性口臭的方法。

实验例9、FaDu细胞感染试验

取培养至对数生长期的FaDu细胞株（1×10

表5. FaDu细胞感染细胞因子分泌情况

IL-6，IL-8在调节牙周病的免疫反应中起着重要作用。由上表可知，牙龈卟啉单胞菌感染后，IL-6显著升高，而加入植物乳杆菌WKA86可以显著降低IL-6的分泌水平。与空白对照组相比，阳性对照组IL-8显著增高，而唾液链球菌K12组与阳性对照组IL-8水平差异无统计学意义（P＞0.05），但植物乳杆菌WKA86组IL-8分泌水平显著降低。实验组IL-10的水平均明显高于阳性对照组。植物乳杆菌WKA86能调节牙龈卟啉单胞菌感染的FaDu细胞的免疫反应，且比唾液链球菌K12有更好的免疫调节作用。牙龈卟啉单胞菌会刺激细胞释放促炎因子IL-6，IL-8，会加速炎症反应和机体损伤，植物乳杆菌WKA86调节细胞促炎因子水平，具有降低口臭伴随而来的牙周炎风险，具有开发成口腔益生菌的潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 微康益生菌（苏州）股份有限公司

<120> 植物乳杆菌菌株WKA86及其在制备防治口臭制品方面的用途与制品

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