一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶

摘要

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶。所述融合植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明主要是通过将野生型植酸酶Y4与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述环化融合蛋白Y4‑Spy，实现提高植酸酶热稳定性的目的。引入肽标签SpyTag/SpyCatcher后显著提高了植酸酶Y4的热稳定性。本发明提供了一种热稳定性提高的适合于在能源、食品和饲料等领域中应用的融合植酸酶，有着非常广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶。

背景技术

植酸酶（Phytase），即肌醇六磷酸磷酸水解酶（myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolases）是一类能够催化植酸盐水解为肌醇、肌醇磷酸酯和无机磷酸盐的磷酸酶。用植酸酶对动物饲料进行预处理，可以提高无机磷的利用率，去除植酸的抗营养作用，从而改善食品/饲料的营养质量，减少磷污染。具有高热稳定性的植酸酶有着巨大的市场需求和商业价值。

SpyTag是一个多肽段，SpyCatcher是与之相对应的一个蛋白质，它们之间能够重组，并自发形成异肽键偶联，这就将蛋白质组装和化学反应结合在一起，产生稳定的分子自组装体。

发明内容

本发明的目的是提供一种热稳定性提高的融合植酸酶。

本发明的再一目的是提供一种提高植酸酶的热稳定的方法。

本发明的再一目的是提供上述融合植酸酶的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述融合植酸酶编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述融合植酸酶编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供制备热稳定性提高的植酸酶的方法。

根据本发明的具体实施方式，对来源于

根据本发明的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型植酸酶通过linker（GSGGSG）与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述融合植酸酶。

根据本发明的具体实施方式，热稳定性提高的融合植酸酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，由560个氨基酸组成。

根据本发明的具体实施方式，还提供了编码上述热稳定性提高的融合植酸酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，共为1683 bp（包含终止密码子）。

根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述融合植酸酶编码基因的重组载体，所述重组表达载体的出发载体具体为pPICZαA，所述重组表达载体具体为pPICZαA-Y4-Spy。

根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述融合植酸酶编码基因的重组菌株，所述重组菌的出发菌株具体为毕赤酵母GS115(pPICZαA-Y4)，所述重组菌株具体为GS115(pPICZαA-Y4-Spy)。

根据本发明的具体实施方式，制备热稳定性提高的植酸酶的方法，包括以下步骤：

1）制备包含上述融合蛋白编码基因的重组载体；

2）以所述重组载体转化宿主，获得重组菌株；

3）发酵培养所述宿主，诱导表达并分离纯化植酸酶。

本发明的融合植酸酶与野生型植酸酶相比，融合植酸酶热稳定性增强，100℃处理5min仍保留42%左右的活性，而野生酶活性已基本消失。

本发明主要是通过将野生型植酸酶Y4与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述环化融合蛋白Y4-Spy，实现提高植酸酶热稳定性的目的。引入肽标签SpyTag/SpyCatcher后显著提高了植酸酶Y4的热稳定性。本发明提供了一种热稳定性提高的适合于在能源、食品和饲料等领域中应用的融合植酸酶，有着非常广阔的应用前景。

附图说明

图1显示野生型与融合植酸酶的比活；

图2显示野生型与融合植酸酶的最适温度；

图3显示野生型与融合植酸酶在100℃下处理的热稳定性；

图4显示木聚糖酶与融合木聚糖酶在60℃下处理10 min后的剩余酶活。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主为

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶购自TaKaRa公司和New England Biolabs(NEB) 公司，T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、大肠杆菌培养基LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl，pH自然）。毕赤酵母培养基YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，pH自然）；BMGY (1%酵母提取物，2%蛋白胨，1%甘油，1.34% YNB，0.00004%生物素，pH自然)；BMMY（1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.5%甲醇，1.34% YNB，0.00004%生物素，pH自然）。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、重组菌株GS115(pPICZαA-

首先通过NCBI网站获得肽标签SpyTag/SpyCatcher的氨基酸序列，之后由北京六合华大基因科技有限公司进行基因合成。对合成的基因

之后采用PCR的方式扩增植酸酶基因

表1

其中，Y4-F及Y4-R用于扩增植酸酶野生型Y4的基因编码序列；Y4-SPYCAT-F和SPYTAG-Y4-R用于扩增质粒pPICZαA-

扩增结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，

回收产物

待测序正确后，提取重组质粒pPICZαA-

实施例2、野生型植酸酶Y4及融合蛋白Y4-Spy的制备

1.蛋白的诱导表达

将得到的重组表达菌株接种至YPD培养基中进行种子培养，200 rpm，30℃培养48h后，以1%接种量转接至BMGY培养基中，200 rpm，30℃培养48 h。之后4500 rpm离心5 min，弃上清，收集菌体并加入含有0.5%甲醇的BMMY培养基进行诱导表达，每12 h补加0.5%甲醇，共诱导48 h。

2.蛋白的纯化

将诱导表达后的菌液12000 rpm离心10 min，收集上清进行浓缩，再用20 mM pH8.0 Tris-HCl进行透析。然后将透析后的酶液进行阴离子交换层析，A液为20 mM pH 8.0Tris-HCl，B液为A液加1 M NaCl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析。

实施例3、野生型植酸酶Y4及融合蛋白Y4-Spy的性质测定

1. 植酸酶活性测定

将酶液用0.1 mol/L含有0.05% BSA和0.05% Triton X-100的pH 5.5 HAc-NaAc缓冲液进行稀释，将100 µL稀释后的酶液加入到900 µL植酸钠底物(用0.1 mol/L的pH 5.5的HAc-NaAc缓冲液配制)中，在37度反应10 min，加入1 mL 10%(W/V)TCA终止反应，最后加入1 mL显色液[1%(W/V)四水合钼酸铵，3.2%(V/V)浓硫酸，7.32%(W/V)硫酸亚铁]进行显色。对照则是在加酶液之前先加入TCA混匀使酶变性，其他相同。显色后，在700 nm光吸收下测定OD值，计算酶活。

将纯化后的野生型和融合蛋白在pH 5.5、37℃下进行酶促反应以测定其酶活性。如图1所示，野生型的酶比活为2077 U/mg，融合酶的酶比活为2045 U/mg，与野生型相当，表明对植酸酶Y4的改造并未影响其活性。

2. 最适温度测定

在0.1mol/L pH 5.5 HAc-NaAc缓冲液条件下，分别在不同温度（20、25、30、37、40、45、50、55、60、65和70℃）下对野生型和融合蛋白的酶活性进行测定来确定最适温度，最适温度对应活性定义为100%，依次计算其余温度下的剩余酶活。如图2所示，野生型和融合蛋白的最适温度都为55℃，肽标签SpyTag/SpyCatcher与植酸酶的融合表达并未影响植酸酶Y4的最适温度。

3. 热稳定性测定

将纯化所得蛋白用0.1 mol/L含有0.05% BSA和0.05% Triton X-100的pH 5.5HAc-NaAc缓冲液稀释至合适倍数后，取100 μL于1.5 mL EP管中，分别在100度下保温0、2、5、10、15和30 min，之后测定对应酶活，以保温0 min的活性为100%，计算不同保温时间下的剩余酶活。如图3所示，野生型在100℃下处理2 min后，酶活基本消失；而融合酶在100℃下处理2 min之后，剩余酶活相当于处理前的47%，处理5 min后，剩余酶活约为42%。

实施例4、木聚糖酶XynA及融合蛋白XynA-Spy的性质测定

根据本发明的具体实施方式，对从绵羊瘤胃中分离得到的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示的木聚糖酶XynA与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述融合木聚糖酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

1. 木聚糖酶活性测定

在0.9 mL pH 6.0的 1%（w/v）榉木木聚糖底物中加入100 μL适当稀释的酶液，50℃反应10 min后加入1.5 mL DNS，煮5 min终止反应，冰上放置10 min后，室温下测定OD

2. 热稳定性测定

将纯化后的酶用最适pH缓冲液稀释后，在60℃处理下处理10 min，然后在最适温度和pH条件下测定剩余酶活。如图4所示，木聚糖酶XynA和XynA-Spy在60℃处理10 min后，剩余酶活分别为39.8%和41.2%，酶活损失情况基本一致，表明肽标签SpyTag/SpyCatcher与木聚糖酶的融合表达并未提高木聚糖酶XynA的热稳定性。

以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 418

<212> PRT

<213> 中间耶尔森氏菌 (Yersinia intermedia)

<400> 1

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115 120 125

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His Lys Ala Val Glu Glu Arg Leu Gly Gly Pro Leu Ser Glu Leu Ser

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Lys Arg Tyr Ala Lys Pro Phe Ala Gln Met Gly Glu Ile Leu Asn Phe

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275 280 285

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<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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65 70 75 80

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tag 1683

<210> 4

<211> 407

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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545