基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究

摘要

本研究在对本课题组已注册的植酸酶phyA基因核苷酸序列及氨基酸序列分析的基础上，通过对phyA基因进行同义突变、定点突变以及结构延伸突变，获得在毕赤酵母中高效表达并且热稳定性良好的植酸酶，其结果主要如下：　　1、对来源于本课题组自主分离的黑曲霉N25(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA(GenBank：基因注册号为AF218813，蛋白质序列号为AAF25481)进行PCR介导的定点突变。　　2、采用反向长距离PCR技术对上述重组酵母pp-Npm-8的植酸酶突变基因phyAm进行PCR介导的定点突变，即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y)，将其354，358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F)，得到了两个突变体pp-Npm-1(F43Y)及pp-Npm-2(I354M,L358F)。　　3、将上述重组酵母pp-Npm-8的植酸酶突变基因phyAm重组于大肠杆菌表达载体pET-30b(+)上，以重组表达载体pET30b-FphyAm为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyAe(在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-FphyAm载体上13个氨基酸残基)。将含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyAe在毕赤酵母GS115中表达。

目录

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前言

第一章植酸酶phyA基因稀有密码子的改造提高在毕赤酵母中的表达量

摘要

1引言

2材料和方法

3结果

3.1植酸酶phyAm基因的定点突变及克隆

3.2酵母表达载体pPIC9k-phyAm的构建

3.3重组质粒pPIC9k-phyAm与pPIC9k-phyA的电击转化及转化子的筛选

3.4重组酵母转化子phyA拷贝数的鉴定

3.5转化子的诱导表达和酶活测定

3.6转化子表达产物的SDS-PAGE分析

3.7重组酵母的遗传稳定性

4讨论

第二章植酸酶phyA基因F43Y及I354M，L358F定点突变提高植酸酶热稳定性的研究

摘要

1引言

2.材料和方法

3结果

3.1植酸酶phyAm基因的定点突变及克隆

3.2突变植酸酶酵母表达载体pPIC9k-phyAm-1，pPIC9k-phyAm-2的构建

3.3重组质粒pPIC9k-phyAm-1，pPIC9k-phyAm-2的电击转化及转化子的筛选

3.4突变植酸酶基因phyAm-1,phyAm-2在毕赤巴斯德酵母中的分泌表达

3.5转化子表达植酸酶的分离纯化

3.6突变酶的酶学性质

3.7植酸酶的二级结构预测分析

3.8突变植酸酶中心骨架模式

3.9植酸酶成熟蛋白的三维结构及局部电子云密度分析

4讨论

第三章植酸酶phyA基因结构延伸突变提高酶热稳定性的研究

摘要

1.引言

2.材料与方法

3.结果

3.1植酸酶phyAm基因融合表达片段的克隆

3.2植酸酶phyAm基因pET-30b(+)融合表达载体的构建

3.3延伸突变植酸酶phyAe基因pPIC9k表达片段的PCR及克隆

3.4植酸酶phyAe基因酵母表达载体pPIC9k-phyAe的构建

3.5重组酵母表达载体pPIC9k-phyAe的电击转化及转化子的筛选

3.6突变植酸酶基因phyAe在毕赤巴斯德酵母中的分泌表达

3.7延伸突变重组酵母表达产物的纯化

3.8突变酶的酶学性质

3.9二级结构的预测

3.10三级结构预测

4讨论

结论

第四章综述

1.真菌植酸酶phyA等基因的基因工程进展

1.1在大肠杆菌中的表达

1.2在真核生物中的表达

1.3毕赤酵母表达系统

2真菌植酸酶性质及改性研究进展

2.1真菌植酸酶的酶学特性

2.2真菌植酸酶的热稳定性

2.3酶蛋白热稳定性机制

2.4植酸酶蛋白质工程研究进展

3真菌植酸酶结构与功能

3.1真菌植酸酶的活性中心

3.2植酸酶作用底物的机制

3.3真菌植酸酶的空间结构

参考文献

致谢

在读期间发表、投稿论文及发明专利