一种发酵罐生产两性霉素B的分批补料发酵方法

摘要

本发明涉及一种发酵罐生产两性霉素B的分批补料发酵方法。本发明分阶段发酵调控策略能够提供结节链霉菌一个最佳的菌体生长和产物合成的外部环境，有利于两性霉素B的积累；采用本发明发酵方法，两性霉素B在温度在31℃，发酵溶氧维持在20％，发酵液残糖控制在0.5～1％时，最终两性霉素B在50吨发酵罐中产量为14g/l左右。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种发酵罐生产两性霉素B的分批补料发酵方法。

(二)背景技术

两性霉素B(AmphotericinB，AmB)是重要的抗真菌类抗生素，自1966年上市以来，一直是深部真菌感染的首选药物。AmB纯品的颜色为黄色或橘黄色，由于其分子结构中亲水基团与疏水基团的不对称分布和带有酸碱性的特点，使得AmB在水相及大部分有机相中的溶解度极低。AmB抗真菌谱广、活性强，对念珠菌、隐球菌、毛霉菌、曲霉菌、组织胞浆菌、球孢子菌等大多数深部真菌都有很强的抗真菌作用，还能有效抑制假丝酵母菌和用于治疗利什曼病等，因此两性霉素B及其衍生物的应用仍然非常广泛。

目前两性霉素B的工业生产仍主要采用的是微生物发酵法，微生物发酵生产抗生素的水平高低除了与菌种遗传特性有关，还与发酵培养基成分和发酵条件及发酵过程控制有关。对于前者目前有诱变育种和分子改造等手段，对于后者主要通过优化得到最适发酵培养基配方、发酵培养条件。目前，两性霉素B仍存在产量较低，产业化生产发展缓慢的问题限制了两性霉素B的发展，对其进行扩大培养的条件进行优化，尤其是大型发酵罐发酵工艺条件的优化对于工业生产具有非常重要的意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种提高大肠杆菌L-半胱氨酸合成量的发酵方法。

本发明采用的技术方法是：

一种发酵罐生产两性霉素B的分批补料发酵方法，所述方法为：将结节链霉菌接种至种子培养基，获得种子液；种子液接种至发酵培养基，进行发酵培养，发酵总时间120±36小时，发酵过程中参数控制如下：

(1)控制发酵体系pH维持在6.5～7.8，直至发酵结束；

(2)在发酵培养第0～36h，维持温度在31±2℃，当发酵至36h时，将温度降至26±2℃，维持该温度直至发酵结束；

(3)发酵前期使菌体在自然DO条件下生长，当发酵体系DO值下降至20％～30％时，控制DO值维持在大于20％直至发酵结束；

控制发酵培养基中葡萄糖浓度，发酵过程中浓度下降到1％～2％时，进行恒速补料，控制葡萄糖含量为0.5％～1％至发酵结束。每隔12h对残糖浓度进行实时检测，根据残糖浓度来补加液糖。

本发明通过对于两性霉素B在发酵罐中的发酵工艺进行优化，可以了解两性霉素B在扩大培养过程中可能中存在的问题，补料可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的影响，改善发酵流变学的性质；可用作控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例。葡萄糖的流加调节，避免了葡萄糖在整个发酵过程中浓度不均一，以及一次性补入大量葡萄糖，不利于菌体的生长代谢的问题。此外糖高会产生酸性物质，如乳酸等，造成菌体不长，pH下降；糖低营养不足，造成菌体不长。菌体不长或生长缓慢将会打破两性霉素B生物合成过程中的正常代谢途径，同时造成pH变化，最终形成更多复杂的副产物，不利于后期的分离纯化。通过本发明的补料控制方法，可以保证发酵液中葡萄糖的相对稳定浓度，使得菌体生长的各个阶段都可以保持最佳生产状态，有效提高两性霉素B的产率。

优选的，所述结节链霉菌为结节链霉菌CCTCC NO.M 2017426，已在CN110564718A中披露。

具体的，所述发酵罐容量为500L～10000L。

所述种子培养基组成如下：蛋白胨10～30g/L，酵母提取物5～20g/L，氯化钠1～10g/L，葡萄糖5～20g/L，碳酸钙0.5～2g/L，溶剂为水，pH 7.0～7.2。

所述发酵培养基组成如下：葡萄糖80～100g/L，黄豆粉30～50g/L，柠檬酸钠5～10g/L，硫酸镁0.5～5g/L，硫酸锰0.05～1g/L，氯化钙0.05～1g/L，碳酸钙5～10g/L，PPG2000 0.5～5g/L，溶剂为水，pH自然。

具体的，发酵过程中以质量浓度30±2％的氨水控制pH值。

本发明的有益效果主要体现在：本发明通过分阶段发酵调控策略，能够提供结节链霉菌一个最佳的菌体生长和产物合成的外部环境，有利于两性霉素B的积累；同时补料调控则通过补料培养基和外源化合物的补料，避免了营养物质在发酵过程中的消耗，后期得不到必要的补充的问题。同时，通过溶氧，残糖，以及PH的控制，使发酵过程中不必要的副产物减少，能够提升两性霉素B的产量。按照本发明方法，能够在50吨发酵罐中得到两性霉素B产量为14g/L。

(四)附图说明

图1为发酵温度为30℃时5吨发酵罐的发酵曲线，显示了AMB的产量以及AMA与AMB的比例。

图2为发酵温度为26℃时的发酵曲线，显示了AMB的产量以及AMA与AMB的比例。

图3为不控制ph时5吨发酵罐的发酵曲线，显示了AMB的产量，AMA与AMB的比例以及ph的变化趋势。

图4为控制溶氧≥10％时5吨发酵罐的发酵曲线，显示了AMB的产量，AMA与AMB的比例以及溶氧的变化趋势。

图5为控制溶氧≥20％时5吨发酵罐的发酵曲线，显示了AMB的产量，AMA与AMB的比例以及溶氧的变化趋势。

图6为控制溶氧≥30％时5吨发酵罐的发酵曲线，显示了AMB的产量，AMA与AMB的比例以及溶氧的变化趋势。

图7为控制残糖≥2.0％时5吨发酵罐的发酵曲线，显示了AMB的产量，AMA与AMB的比例以及残糖的变化趋势。

图8为控制残糖为0.5～1％时5吨发酵罐的发酵曲线，显示了AMB的产量，AMA与AMB的比例以及残糖的变化趋势。

图9为50吨发酵罐发酵的温度，溶氧，ph以及残糖的变化曲线，显示了发酵过程中温度，溶氧，ph以及残糖的变化趋势。

图10为图9发酵曲线下，50吨发酵罐的产量，显示了AMB的产量，AMA与AMB的比例。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

对比例：

本发明实施例中所用的菌种为结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050(CCTCC No：M 2017426)，来自中国典型培养物保藏中心。

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到5000L发酵罐中，初始发酵液为3000L，在31℃、100r/min，1500m

实施例1：

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到5000L发酵罐中，初始发酵液为3000L，在26℃、100r/min，1500m

实施例2：

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的分阶段温度调控策略发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到5000L发酵罐中，初始发酵液为3000L，发酵初始条件为100r/min，1500m

实施例3：

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到5000L发酵罐中，初始发酵液为3000L，发酵初始条件为100r/min，补料方式参照对照例，每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵前期0～36h，控制温度为31℃，在发酵后期36h至发酵结束，控制发酵温度为26℃。发酵过程中控制通气量调节溶氧大于等于10％，在发酵培养至116h时结束发酵，取样检测AMB含量以及AMA，结果如图4所示，用高效液相色谱测得AMB含量为12.35g/L，两性霉素A/B为4.2％，AMB产量较对照例提高31％。

实施例4：

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到5000L发酵罐中，初始发酵液为3000L，发酵初始条件为100r/min，发酵中待葡萄糖浓度降低到20g/L后以1.5g/l/h的速率进行恒速补料，每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵前期0～36h，控制温度为31℃，在发酵后期36h至发酵结束，控制发酵温度为26℃。发酵过程中控制通气量调节溶氧大于等于20％，在发酵培养至120h时结束发酵，取样检测AMB含量以及AMA，结果如图5所示，用高效液相色谱测得AMB含量为13.89g/L，两性霉素A/B为3.2％，AMB产量较对照例提高42％。

实施例5：

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到5000L发酵罐中，初始发酵液为3000L，发酵初始条件为100r/min，补料方式参照对照例，每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵前期0～36h，控制温度为31℃，在发酵后期36h至发酵结束，控制发酵温度为26℃。发酵过程中控制通气量以及补料联合调节溶氧大于等于30％，在发酵培养至120h时结束发酵，取样检测AMB含量以及AMA，结果如图6所示，用高效液相色谱测得AMB含量为13.71g/L，两性霉素A/B为2.9％，与对照例5相比，产量没有明显的变化，并且发酵后期控制溶氧大于30需要极大的提高通气量，对能源造成较大浪费。

实施例6：

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到5000L发酵罐中，初始发酵液为3000L，发酵初始条件为100r/min，1500m

实施例7：

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到5000L发酵罐中，初始发酵液为3000L，发酵初始条件为100r/min，1500m

实施例8：

一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙1g/L，溶剂为蒸馏水，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。

发酵培养基包括以下成分：葡萄糖100g/L，黄豆粉50g/L，柠檬酸钠10g/L，硫酸镁5g/L，硫酸锰1g/L，无水氯化钙1g/L，碳酸钙10g/L，PPG2000 5g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值，蒸汽灭菌。

发酵过程中，加入氨水来调节pH值，氨水的质量百分比浓度为30％。

补料培养基：液糖(30％葡萄糖溶液，300g/L)

两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：

从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。

(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：

以10％的接种量将二级种子液接种到50000L发酵罐中，初始发酵液为35000L，发酵初始条件为100r/min，发酵0～24h，通气量为1000m