血红素及其类似物在制备线粒体疾病治疗药物中的应用

摘要

本发明公开了血红素及其类似物的新用途，其可作为一种线粒体疾病的治疗药物，该化合物可有效促进线粒体缺陷导致的细胞分化程度的降低以及相应的细胞功能如脂肪储存能力、非颤栗性产热能力以及细胞呼吸的降低，因此本发明为线粒体疾病提供了辅助治疗方法，为临床治疗线粒体疾病提供了新的理论与技术支撑，并为相应孤儿药的研发提供可能。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及血红素及其类似物在制备线粒体疾病治疗药物中的应用。

背景技术

线粒体疾病是一种复杂的代谢性疾病也是最常见的遗传代谢病，是由功能障碍的线粒体引起的一类疾病，其主要涉及遗传性线粒体氧化磷酸化系统的功能缺陷。线粒体疾病是一种稀有疾病，病因复杂，涉及线粒体基因组或核基因组的遗传性基因突变。原发性线粒体疾病可能由线粒体DNA中影响线粒体功能的突变或由核DNA的基因(其产物被输入到线粒体中)中的突变引起。不同于原发性线粒体疾病，获得性线粒体功能障碍的继发性线粒体功能障碍可以由核DNA的不直接参与线粒体氧化磷酸化级联的基因引起。该疾病可在任意年龄阶段发病，任一组织系统都可受到影响。这些特点使得线粒体疾病在诊断和治疗上都颇具挑战性。

线粒体缺陷可直接导致多系统疾病的发生，包括心血管系统疾病如遗传性心肌病，肌肉系统疾病如线粒体肌病，内分泌系统缺陷如线粒体糖尿病，消化系统缺陷如假性肠套叠、消化不良和肝衰竭等，神经系统疾病如智力发育迟缓和癫痫等。临床疾病表型多样，包括贫血、痴呆、癫痫、糖尿病、肌病、高血压、淋巴瘤、视网膜病、癫痫发作和神经发育障碍等。即使是同一基因突变引起的线粒体疾病，患者间的症状，受损组织也都可能差异极大。线粒体疾病影响的组织之广，症候之复杂，疾病的预后有赖于相关致病基因。这使得线粒体疾病的治疗面临极大的挑战。

至今为止除了少数以辅因子突变引起的线粒体疾病，可以通过维生素的补充来缓解相应症状以外。至今并无有效的逆转或缓解线粒体疾病的方式。特别是线粒体肌病、线粒体肝病、线粒体肾病和线粒体神经系统疾病等，治疗方法、药物都有限，且效果不佳。至今为止，FDA仅批准艾地苯醌idebenone做为LHON综合征急性视力损伤的小分子治疗药物。由于眼睛微环境的遗传封闭性，FDA及欧盟也已批准了两款基于基因疗法的治疗LHON综合征急性视力损伤的药物。但是对于其他类型的线粒体疾病，并无药物可用。现今，各大中心，通常使用对症药物，以及以肉碱，肌酸，辅酶Q10及维生素等鸡尾酒疗法来治疗线粒体疾病，治疗效果有限。而至今为止，尚无针对线粒体缺陷所致细胞代谢重塑及细胞表观遗传修饰改变的药物发表或进入临床实验。

在细胞水平上，线粒体是重要的产能器官，也参与合成包括固醇，血红素(heme)等重要分子。而固醇和血红素等也能作为信号分子影响到细胞的基因表达。线粒体氧化磷酸化系统的功能影响了线粒体内三大营养物质的代谢，也影响了多种信号分子的合成，故线粒体OXPHOS缺陷对细胞生理功能有着深远的影响。线粒体OXPHOS缺陷不仅仅影响终末分化的细胞，已有研究表明，线粒体功能缺陷可降低多种细胞的分化，进而影响终末分化细胞的功能。然现今研究和治疗主要针对终末分化细胞，并未对细胞的分化加以重视，使得线粒体疾病在治疗上有所掣肘。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了血红素及其类似物的新用途，该物质可改善线粒体缺陷导致的细胞分化降低、脂质储存功能降低以及细胞呼吸抑制情况，其具有作为新的线粒体缺陷引起的相关疾病治疗药物的潜力。

本发明公开了血红素及其类似物在制备线粒体疾病治疗药物中的应用。

线粒体疾病是人类唯一一种受两个基因组控制的遗传缺陷，同时，OXPHOS的功能也受到众多细胞代谢通路、自噬通路的影响，故多种类型的遗传缺陷也将造成线粒体OXPHOS缺陷。线粒体OXPHOS功能缺陷是引起线粒体疾病主要病因。而申请人经过大量研究发现，血红素可有效促进线粒体缺陷导致的细胞分化的降低以及相应的细胞功能如脂肪储存能力、非颤栗性产热能力以及细胞呼吸的降低，证明线粒体疾病可通过调控细胞内血红素含量的高低调节细胞转录程序，从而影响细胞的分化和功能。此发现为线粒体疾病提供了辅助治疗方法，并为相应孤儿药的研发提供可能。

目前已有文献(Homma K,Toda E,Osada H,Nagai N,Era T,Tsubota K,Okano H,Ozawa Y.Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in thepatient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymaltransition in the retinal pigment epithelium.Redox Biol.2021May；41:101921.doi:10.1016/j.redox.2021.101921.Epub 2021 Feb 28.PMID:33706170；PMCID:PMC7944050.)从细胞代谢水平研究牛磺酸治疗对线粒体疾病的影响，如通过鱼藤酮处理构建线粒体复合酶体I缺陷的线粒体疾病模型来研究牛磺酸对线粒体疾病的治疗效果，且已经临床试验确定牛磺酸为线粒体疾病有效的潜在细胞保护药物。因此本发明申请中，发明人构建经鱼藤酮处理的线粒体复合酶体I缺陷的药理学模型以及NDUFAF5敲降的遗传学模型，来研究血红素对线粒体疾病的治疗作用。

进一步地，线粒体疾病为线粒体心血管系统疾病、线粒体肌肉系统疾病、线粒体内分泌系统疾病、线粒体神经系统疾病或线粒体消化系统疾病。

进一步地，线粒体心血管系统疾病为线粒体心肌病，线粒体肌肉系统疾病为线粒体肌病，线粒体内分泌系统疾病为线粒体糖尿病，线粒体神经系统疾病为线粒体癫痫或神经发育障碍，线粒体消化系统疾病为线粒体肝病或线粒体肾病。

进一步地，上述药物用来治疗线粒体缺陷引起的线粒体疾病，具体的，用来改善线粒体OXPHOS缺陷引起的线粒体疾病。

进一步地，上述药物用来治疗细胞分化程度和细胞功能降低的线粒体疾病。

进一步地，血红素类似物为氯化血红素、氯化高铁血红素、草酸血红素、咪唑血红素或甲酸血红素。

进一步地，上述药物还包括线粒体药物，如艾地苯醌、维生素、氨基酸、烟酰胺单核苷酸和白藜芦醇等。

进一步地，药物为注射液。

进一步地，药物通过静脉注射或腹腔注射。

本发明的一种用于治疗线粒体疾病的药物，该药物包括血红素，还包括醋酸钠、β-烟酰胺单核苷酸(NMN)、白藜芦醇和牛磺酸中的一种或几种。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明基于现在缺乏有效的疗法的问题，构建了线粒体复合酶体I缺陷的药理学模型和遗传学模型，发现血红素部分补救了复合酶体I缺陷引起的细胞分化降低和脂肪细胞脂肪酸的合成，脂滴聚集等也得以补救，同时线粒体基因的表达也有所增加，从而发现了血红素的新用途，其可减轻线粒体缺陷引起的疾病或并发症，为开发新的线粒体药物提供了方向。

(2)本发明的血红素容易获取，突破了其他临床治疗方案的局限性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为线粒体缺陷对细胞分化程度、脂肪储存和线粒体基因表达的影响；

图2为鱼藤酮处理细胞的血红素合成关键基因Alas1的表达以及细胞内总血红素的变化情况；

图3为血红素对细胞分化、脂质储存以及OXPHOS复合酶体水平和活性的影响；

图4为血红素对细胞组蛋白修饰水平、去甲基化酶水平和转录因子的影响；

图5用10nM的鱼藤酮、10μM血红素或4mM醋酸钠处理后细胞内Ucp1基因的表达情况；

图6为100nM鱼藤酮处理肌肉细胞或通过Ndufaf5敲降，建立成肌细胞的药理学和遗传学模型，用10μM血红素，检查成肌细胞分化情况；

图7为5-ALA处理后OXPHOS缺陷所造成的细胞分化的结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1线粒体缺陷模型的构建

(1)线粒体复合酶体I缺陷的药理学模型通过在分化前和分化中用复合酶体I抑制剂鱼藤酮(Rotenone,ROT)处理得到。鱼藤酮在水溶液中不稳定，为了构建药理学模型，在棕色前体脂肪细胞分化前以及细胞分化过程中用10nM的鱼藤酮处理。用seahorse细胞能力代谢分析仪测量棕色前体脂肪细胞10nM ROT处理后细胞呼吸速率。

结果如图1A所示，10nM可造成前体脂肪细胞呼吸抑制20％左右。

(2)线粒体复合酶体I的遗传学模型的构建是在棕色前脂肪细胞中通过shRNA(5‘-CCUGGUGGUUAGCAGCUUATT-3’)的方法对复合酶体I核心亚基ND1组装因子NDUFAF5进行稳定敲降。我们用含有针对NDUFAF5设计的shRNA的逆转录病毒感染棕色前脂肪细胞并筛选出相应的单克隆构建了NDUFAF5敲降的遗传学模型。

实施例2

(1)在棕色脂肪细胞分化至第7天进行拍照，细胞进一步用PBS洗3遍，然后加入4％的甲醛溶液固定20分钟，进一步用2.5％的油红的丙醇溶液染色1小时。染色结束后用PBS清洗3次并拍照。细胞甘油三酯：细胞脂质成分的提取，分析方法详见文献(Zhou,D,FASEBJ.2012Nov；26(11):4733-42.)。

(2)细胞内的脂质棕色前脂肪细胞在分化前和分化中同时用10nM的鱼藤酮和10mM血红素处理。细胞分化结束通过甲醇/水(1:1)萃取，通过TLC将TAG，FFA，以及FA分离开来，最后再通过GC/MS的方法测量。详见文献(Zhou,D,FASEB J.2012Nov；26(11):4733-42.)。

结果如图1所示，其中，B为油红染色和TAG测量细胞脂滴形成和脂肪储存的情况，C为逆转录实时PCR技术(qRT-PCR)检测棕色脂肪细胞特征基因，线粒体基因表达的高低，D为遗传学模型中Ndufaf5敲降对细胞呼吸的抑制，E为遗传学模型中棕色脂肪细胞特征基因表达的影响。从图B-D可知，油红染色证明成熟脂肪细胞脂滴降低；TAG的测量证明，鱼藤酮处理的细胞脂肪储存降低；qRT-PCR实验证明鱼藤酮处理或是Ndufaf5敲降降低棕色脂肪细胞特征基因的表达，棕色脂肪细胞的分化程度降低，线粒体相关基因的表达降低。

实施例3

(1)棕色前脂肪细胞在分化前和分化中用10nM的鱼藤酮处理，分化7天后，提取RNA，通过qRT-PCR技术检测血红素合成限速步骤的酶Alas1的表达。

(2)棕色前脂肪细胞分化前和分化中用10nM的鱼藤酮处理并测量细胞内总的血红素的浓度。细胞重用2M草酸溶液挂下，取等体积的细胞悬液，一份于95度水浴加热半小时，一份于室温下加热半小时。加热后用酶标仪在Ex/Em＝400/662nM处测量计算血红素含量。

检验鱼藤酮处理细胞的血红素合成关键基因以及血红素的变化，结果如图2所示。从图2可知，分化前脂肪细胞用鱼藤酮处理后，血红素合成关键基因Alas1的表达降低，同时，分化后细胞内总血红素的水平明显降低。

实施例4

(1)棕色前脂肪细胞在分化前和分化中同时用10nM的鱼藤酮和10μM血红素处理，在分化的第三天进行油红染色。染色过程如前所述。

(2)细胞内的脂质棕色前脂肪细胞在分化前和分化中同时用10nM的鱼藤酮和10μM血红素处理。细胞分化结束通过甲醇/水(1:1)萃取，通过TLC将TAG，FFA，以及FA分离开来，最后再通过GC/MS的方法测量。详见文献(Zhou,D,FASEB J.2012Nov；26(11):4733-42.)

(3)Western blotting：用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0),0.4％Nonidet P-40,120mM NaCl,1.5mM MgCl

(4)复合酶体I活性检测：通过差速离心法提取线粒体，并用BCA方法测试线粒体蛋白含量。取4-10微克线粒体用于复合酶体I活性的检测。线粒体冻融3次后加入反应溶液(80μM NADH，160μM DCIP,60μMdecylubiquinone，3mg/ml BSA,25mM磷酸钾缓冲液pH 7.4,2μM抗霉素A，2mM KCN)于600nM处读取动力学曲线3分钟，后加入4μM鱼藤酮，读取动力学曲线后，计算鱼藤酮敏感的复合酶体I活性。

图3显示，药理学模型和遗传学模型中添加血红素改善了细胞分化的情况、脂质的储存以及OXPHOS复合酶体的水平。图3A，3E中鱼藤酮处理的线粒体缺陷的药理学模型或NDUFAF5敲低的线粒体缺陷的遗传学模型中，与未添加血红素组相比，添加血红素后鱼藤酮处理的细胞以及NDUFAF5敲低的细胞都可见明显的脂质积累的增加；图3B显示，持续处理分化7天后，与未添加血红素组相比，血红素处理组三酰基甘油的含量，总脂肪酸和游离脂肪酸的含量都有显著增加，说明血红素处理能部分回补线粒体缺陷所造的甘油三酯的降低以及脂肪酸合成的降低；图3C,3F中，血红素处理也能部分回补线粒体中度缺陷所造成的分化特征基因Ucp1，Cidea，Prdm16表达的降低，细胞分化程度增高，同时，血红素处理可增加细胞色素c的表达，脂肪酸合酶表达增高；图3D中，线粒体复合酶体III、复合酶体IV的水平增加。图3D、3G所示，复合酶体I缺陷的药理学模型和遗传学模型中，复合酶体I活性下降，而血红素处理后复合酶体I活性恢复。

实施例5

Western blotting：用含有蛋白酶抑制剂的SDS-PAGE样品缓冲液(0.125mM Tris-HCL pH 6.8,1％SDS,25％glycerol)提取细胞总蛋白，稀释后通过BCA反应测量蛋白浓度。10ul细胞蛋白通过10％的SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜上。进而用5％的脱脂牛奶封闭膜，并进一步与一抗(如图中所示)和二抗孵育，最后通过化学发光法显影，并用ImageJ软件进行条带的灰度分析。

结果如图4所示，表明血红素可能通过调控细胞组蛋白修饰的水平来介导细胞分化和转录的改变。图4A表明线粒体缺陷造成细胞组蛋白H3K9三甲基化，二甲基化修饰增加。组蛋白H3K9三甲基化，二甲基化修饰常常与基因沉默，基因表达抑制相关。而在分化中添加血红素后，线粒体缺陷细胞组蛋白H3K9三甲基化，二甲基化修饰降低。而参与H3K9甲基化调控的去甲基化酶KDM3A表达在血红素添加后有所增加(4B)，血红素可能参与了组蛋白H3K9的甲基化调节。而进一步检查促进脂肪细胞分化的相关转录因子的表达发现(4C)，血红素添加后，转录因子PPARγ、cEBPβ表达增加，故血红素可能通过调控细胞组蛋白修饰水平，调控转录因子PPARγ、cEBPβ的表达来促进线粒体缺陷的细胞的分化。

实施例6

棕色前脂肪细胞在分化前和分化中同时用10nM的鱼藤酮，10μM血红素或4mM醋酸钠孵育，在分化的第三天进行油红染色；或提取总RNA通过qrt-PCR检测棕色脂肪细胞Ucp1基因的表达。

结果如图5所示，A为分化第三天的油红染色结果，B为棕色脂肪细胞经三组处理后Ucp1基因的表达情况。可见，血红素，醋酸钠以及血红素和醋酸钠共处理组脂滴生成增加，Ucp1表达增加。

实施例7

(1)线粒体复合酶体I缺陷的药理学模型通过在分化前和分化中用复合酶体I抑制剂鱼藤酮(Rotenone,ROT)处理得到。鱼藤酮在水溶液中不稳定，为了构建药理学模型，在C2C12细胞分化前以及细胞分化过程中用100nM的鱼藤酮处理。

(2)线粒体复合酶体I的遗传学模型的构建是在棕色前脂肪细胞中通过shRNA(5‘-CCUGGUGGUUAGCAGCUUATT-3’)的方法对复合酶体I核心亚基ND1组装因子NDUFAF5进行稳定敲降。我们用含有针对Ndufaf5设计的shRNA的逆转录病毒感染C2C12细胞并筛选出相应的单克隆构建肌肉细胞NDUFAF5敲降的遗传学模型。

(3)C2C12细胞在分化前和分化中同时用100nM的鱼藤酮和10μM血红素处理。C2C12细胞培养至接触抑制后用分化培养基(含2％HS的DMEM)诱导分化7天至成熟肌肉纤维。

结果如图6所示，成肌细胞Ndufaf5敲降可显著降低细胞中Ndufaf5的表达以及复合酶体I核心亚基ND1的蛋白水平。依此可造就细胞的遗传学模型而100nM鱼藤酮可以显著降低成肌细胞的细胞核融合情况，肌纤维成比较短粗。而血红素处理后可以增加细胞的分化程度，成肌细胞的核融合增加，肌纤维较未处理前增长。

实施例8

棕色前脂肪细胞在分化前和分化中同时用10nM的鱼藤酮，血红素和β-烟酰胺单核苷酸孵育，在分化的第三天进行油红染色；或提取总RNA通过qrt-PCR检测棕色脂肪细胞Ucp1基因的表达。

将β-烟酰胺单核苷酸更换为白藜芦醇或牛磺酸，结果显示均可得到与实施例6类似的实验结果。

对比例1

(1)在棕色脂肪细胞前体细胞分化前和分化中用10nM的鱼藤酮(10nM,100nM)以及3mM、5mM ALA处理细胞，直至完全分化为成熟棕色脂肪细胞。

(2)棕色前脂肪细胞用分化前和分化中用10nM的鱼藤酮和ALA处理，分化7天后，提取RNA，通过qRT-PCR技术检测棕色脂肪细胞特征基因Ucp1,Cidea的表达。

(3)结果如图7所示。ALA的添加不能减少OXPHOS缺陷所造成的棕色脂肪细胞分化的降低。通过对细胞脂质积累的跟踪，以及UCP1和Cidea的表达水平的检测，发现分化中添加heme合成的前体ALA并不能增加细胞脂滴的积累，也不能改善OXPHOS缺陷所造成的细胞分化的降低。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。