一种基于前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因靶点的纳米递送系统的制备

摘要

本发明提供了一种基于前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因靶点的聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统的制备方法，涉及药物化学，药剂学，分子生物学等技术领域。所述纳米递送系统的合成方法包括：1)2‑氰基‑5‑((2‑甲氧基聚乙二醇)氨基)‑5‑氧代戊烷‑2‑基苯二硫代甲酸酯的合成；2)甲基丙烯酸丙酯的合成；3)N‑(2‑(3‑氨基甲酰胍)乙基)甲基丙烯酰胺的合成；4)聚二甲双胍脂质纳米颗粒的合成；5)gRNA的体外转录；6)聚二甲双胍脂质纳米颗粒与Cas9‑mRNA，gRNA通过电荷、疏水作用自组装形成聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统。本发明得到的CRISPR/Cas9纳米递送平台具有良好的核酸包封率，细胞存活率，转染细胞后有效地下调了蛋白表达，在高脂血症的预防和治疗领域具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及有机化学，药剂学，分子生物学等多项领域。具体包括聚二甲双胍脂质纳米颗粒等有机分子的化学合成、分子的自组装策略以及与CRISPR/Cas9技术相关的生物信息学和基因工程学。

背景技术

基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)系统，简称CRISPR/Cas9，是目前前沿的基因编辑工具之一，它主要是基于细菌的获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。目前，通过CRISPR/Cas9在靶细胞实现基因编辑的主要方式有3种：①递送Cas9的蛋白和gRNA；②递送编码Cas9以及gRNA的质粒；③递送Cas9-mRNA和gRNA。在这三种方式中，由于Cas9-mRNA具有的无需入核，进入细胞质即可翻译加工成Cas9蛋白，产生的脱靶效应比CRISPR/Cas9质粒更低，起效更快，没有整合风险，对于临床治疗更安全等种种优势而受到了研究人员们的青睐。但Cas9-mRNA在细胞质中的半衰期很短，在24h之内就会降解，极不稳定，因此对该体系的递送形成了很大的挑战。虽然诸如慢病毒、腺病毒载体不仅解决了上述存在的问题，并且具有很高的转染效率，但其生物安全以及伦理道德问题限制了其广泛应用。正是由于这些载体不能完全满足CRISPR/Cas9系统针对肝脏递送的需求，因此，构建一种新型的CRISPR/Cas9纳米材料递送系统，并对其基因编辑效果进行探讨便有着重要的意义。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种在肝脏、小肠和肾脏中表达和分泌的循环蛋白，它可以结合细胞表面的低密度脂蛋白受体并使受体的内化，这种PCSK9与LDL-R之间的相互作用降低了细胞表面LDL-R的密度，从而引起了血浆中LDL-C的升高,进而达到预防和治疗高脂血症的效果。针对PCSK9的靶向单克隆抗体能够降低LDL水平已经被证明是有效的，然而，作用时间短以及高成本限制了它的临床应用。有研究表明，PCSK9的基因的敲除可显著降低LDL-C水平和患心血管疾病的风险。令人鼓舞的是，这些突变并没有造成不良的临床后果，这意味着针对PCSK9为靶点的基因疗法将是治疗LDL-C诱导的心血管疾病安全有效的方法。

二甲双胍是治疗糖尿病常用药物之一，通过激活AMPK通路，抑制肠道糖类吸收，促进组织对葡萄糖的摄取和利用，从而达到降低血糖的目的。此外，研究显示，二甲双胍能够增加心脏泵血功能、改善能量平衡、减少脂肪蓄积、抑制细胞凋亡从而减少心肌细胞丢失，对心脏具有保护作用。也有报道称二甲双胍可降低2型糖尿病患者血浆甘油三酯(TG)，血清总胆固醇(TC)，LDL-C水平，对HDL-C改变不明显。更重要的是，二甲双胍结构中胍基带有正电荷，其可以很好地与Cas9-mRNA、gRNA等带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用相互结合，因此，二甲双胍的聚合物可以成为核酸传递的理想载体。正因为二甲双胍所具有改善糖脂代谢和胍基结构中带有正电荷并能够与核酸相结合的优势，因此我们构建了一种新型的聚二甲双胍的纳米脂质颗粒于递送以PCSK9基因为靶点的CRISPR/Cas9基因编辑工具，并实现了对PCSK9基因的有效敲除

发明内容

本发明提供了一种基于PCSK9基因靶点的聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统的制备方法，其步骤包括：

1. 2-氰基-5-((2-甲氧基聚乙二醇)氨基)-5-氧代戊烷-2-基苯二硫代甲酸酯的合成：取4，4’偶氮(4-氰戊酸)5.839g，双硫代苯甲酰基4.25g，溶解于80mL乙酸乙酯中，加热回流反应16h。柱层析纯化(乙酸乙酯：正己烷/2：3)，得红色油状产物(5.3g，68％)。之后，将上述产物、77.6mg碳二亚胺、46mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于4mL二氯甲烷中，活化2-3h，称取甲氧基聚乙二醇100mg，溶解于二氯甲烷中，取活化好的产物加入其中，反应过夜，之后滴加4℃乙醚重结晶，3000rpm离心，倒去上清液，冻干，得粉红色产物。

2.甲基丙烯酸丙酯的合成：取正丙醇7.45mL，三乙胺4.18mL，溶解于30mL二氯甲烷中。冰浴搅拌，并缓缓加入2.5mL甲基丙烯酰胺。加热反应至室温，反应过夜，过滤并收集溶液，旋蒸浓缩滤液，得浅黄色油状产物。

3.N-(2-(3-氨基甲酰胍)乙基)甲基丙烯酰胺的合成：取N-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺135.92mg，双氰胺72.03mg溶解于2％HCl溶液中，90℃反应3h，旋蒸浓缩，得白色固体状产物

4.聚二甲双胍脂质纳米颗粒的合成：取MeO-PEG-CPADN50mg，N-(2-(3-氨基甲酰胍)乙基)甲基丙烯酰胺79.55mg，甲基丙烯酸丙酯39μL，溶解于20mL DMSO中，70℃氮气保护反应24h。甲叔醚萃取出多余的DMSO后，取底部橙色产物，水相透析24h，冻干过夜，得棕色固体产物。

5.gRNA的体外转录合成：

①溶解T7启动子引物于DEPC水中，使成100mM

模板DNA的退火：

②体外转录

RNase-free water 10μL

10X Reaction Buffer 1.5μL

NTP 1.5μL/种共6μL

模板DNA 1μL

T7 RNA polymerase Mix 1.5μL

37℃孵育16h

6.聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统的构建：首先将Cas9-mRNA与gRNA按2:1混合后，放置于冰浴，再将聚二甲双胍脂质纳米颗粒溶解于0.1M的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中并快速与Cas9-mRNA、gRNA按3:1混合，室温孵育半小时。

7.聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统的功能验证

1)细胞存活率

取HepG2细胞，消化，分散，计数，10000个/孔种于96孔板中，分别取溶解于HEPEsbuffer中的聚二甲双胍脂质纳米颗粒及二甲双胍2.625μg，5.25μg，10.5μg，加入96孔板中，37℃孵育2-3天。加入CCK8，酶标仪450nm检测吸光度。

2)核酸包封率

取1mg聚二甲双胍脂质纳米颗粒溶解于1mL HEPEs中，快速将其加入含有Cas9-mRNA、gRNA的EP管中，使聚二甲双胍脂质纳米颗粒与核酸的质量比为1:1，1:2，1:3，1:4，室温孵育30min，2％琼脂糖凝胶电泳检测包封率。

3)PCSK9基因编辑效果

取1mg聚二甲双胍脂质纳米颗粒溶解于1mL HEPEs中，快速将其加入含有Cas9-mRNA、gRNA和Cas9、gRNA的EP管中，并使聚二甲双胍脂质纳米颗粒与核酸的质量比为1:3，室温孵育30min后转染HepG2细胞三天，WB检测PCSK9蛋白下调效果。

附图说明

图1A为4-甲基4-((苯基碳硫酰基)硫代)戊酸的质谱

图1B为2-氰基-5-((2-甲氧基聚乙二醇)氨基)-5-氧代戊烷-2-基苯二硫代甲酸酯的红外光谱图

图2为甲基丙烯酸丙酯的核磁共振氢谱

图3为N-(2-(3-氨基甲酰胍)乙基)甲基丙烯酰胺的核磁共振氢谱

图4A为聚二甲双胍脂质纳米颗粒的核磁共振氢谱

图4B为聚二甲双胍脂质纳米颗粒的透射电镜图

图5A为聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统的细胞存活率

图5B为聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统包封效果的琼脂糖电泳图

图5C为聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统对PCSK9基因编辑效果图

具体实施方式

本发明以下实施例中所采用的仪器与设备如下：

透射电子显微镜JEM-1200EX(JEOL，日本)，红外光谱仪Nicolet iS10(Thermofisher，美国)，核磁共振仪AVANCE III 600M(Bruker，德国)，质谱仪MALDI-TOF(Bruker，德国)

本发明的具体实施方式进一步详细描述如下：

实施例1：聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统合成方法，具体步骤见发明内容所示。

实施例2：分别通过透射电镜、核磁共振仪、红外光谱仪、质谱仪对聚二甲双胍脂质纳米颗粒的形态、结构、分子量进行分析，具体步骤如下：

(1)透射电镜的表征：聚二甲双胍脂质纳米颗粒PEG-H(PMet)冻干粉末用适量纯水重悬，分散均匀后，在铜网上分别滴加PEG-H(PMet)悬液，室温风干，通过透射电子显微镜观察颗粒的形态和分散性。

(2)核磁共振表征：取N-(2-(3-氨基甲酰胍)乙基)甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸丙酯、聚二甲双胍脂质纳米颗粒PEG-H(PMet)冻干粉末，真空干燥烘干粉末，取氘代重水、溶解粉末，放置于核磁管中，通过核磁共振氢谱检测化学结构

(3)红外表征：取适量干燥溴化钾，研磨成极细粉，压片后放置于红外光谱仪中，扣除背景。取少量MeO-PEG-CPADN，与干燥溴化钾混合后研磨成极细粉，压片后放置于红外光谱仪中检测。

(4)质谱分析：取极少量4-甲基4-((苯基碳硫酰基)硫代)戊酸溶解于甲醇中，使浓度小于1μg/mL，进样，于质谱仪中检测分子量

实施例3：分别通过琼脂糖凝胶电泳、Western Blot检测聚二甲双胍脂质纳米颗粒的核酸包封以及对PCSK9的编辑效果，具体步骤如下：

(1)琼脂糖凝胶电泳检测核酸包封效果：①配胶：取50mL 1X TAE加入锥形瓶中，取1g琼脂糖粉末加入，微波加热1min，迅速加入5μL godview染料，混匀后，倒入磨具，等待凝固。②上样：分别取5μL marker、10μL Cas9-mRNA/gRNA、不同比例10μL Cas9-mRNA/gRNA/PEG-H(PMet)加入上样孔中。③电泳：110V电泳40min。④检测：取出凝胶，放置于凝胶成像仪中检测，观察DNA条带。

(2)Western Blot检测PCSK9的编辑效果：①配胶：取8mL下层胶溶液、8mL下层胶缓冲液、160μL凝固液，加入模具中，乙醇封闭，等待凝固。倒去乙醇溶液，等待挥发干净后，加入4mL上层胶溶液及凝固液，插入梳子，等待凝固。②样品制备：取单层贴壁细胞，加入细胞裂解液，转移至EP管中，裂解30min后，4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并于酶标仪中进行含量测定。上样：分别取空白组，Lipo3000/Cas9-mRNA/gRNA组、PEG-H(PMet)/Cas9-mRNA/gRNA组、PEG-H(PMet)/Cas9蛋白/gRNA组加入上样孔中。③电泳：80V电泳2h。④转膜：根据蛋白分子量切胶后，盖上一层活化后的PVDF膜，200mA转模90min。⑤封闭：转膜完成后，将PVDF膜放置于BSA封闭液中，封闭10min。⑥孵育抗体：4℃孵育PCSK9一抗过夜，TBST洗膜3次，常温孵育二抗30min后，TBST洗去多余二抗。⑦显影：相PVDF膜上滴加显影液，放置于凝胶成像仪中，观察条带。

图1A为4-甲基4-((苯基碳硫酰基)硫代)戊酸的质谱。4-甲基4-((苯基碳硫酰基)硫代)戊酸分子量为280，由于其具有酸性，在吸附玻璃器皿中的硅酸钠成分后，成为4-甲基4-((苯基碳硫酰基)硫代)戊酸的钠盐，故分子量为303，该质谱表明4-甲基4-((苯基碳硫酰基)硫代)戊酸的成功合成。

图1B为2-氰基-5-((2-甲氧基聚乙二醇)氨基)-5-氧代戊烷-2-基苯二硫代甲酸酯的红外光谱图，由于1700处出现-NHCO-吸收峰，表明产物的成功合成。

图2为甲基丙烯酸丙酯的核磁共振氢谱，图中信息表明甲基丙烯酸丙酯的成功合成

图3为N-(2-(3-氨基甲酰胍)乙基)甲基丙烯酰胺的核磁共振氢谱，图中信息表明N-(2-(3-氨基甲酰胍)乙基)甲基丙烯酰胺成功合成

图4A为聚二甲双胍脂质纳米颗粒PEG-H(PMet)的核磁共振氢谱，图中信息表明PEG-H(PMet)成功合成

图4B为聚二甲双胍脂质纳米颗粒PEG-H(PMet)的透射电镜图，图中信息表明，纳米药物形成了类脂质体的镂空结构，平均粒径约为100nm，并且大小均一，分散性良好。

图5A为聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统的细胞存活率，随着给药浓度的增加，细胞活力程度同时略有上升，表明聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统具有优良的细胞存活率

图5B为聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统包封效果的琼脂糖电泳图，随着聚二甲双胍脂质纳米颗粒PEG-H(PMet)与Cas9-mRNA/gRNA比例的增加，紫外荧光急剧减少，表明其比例为1:3以上时，PEG-H(PMet)对核酸进行了有效包封。

图5C为聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统对PCSK9基因编辑效果图，Lipo3000作为阳性对照表明，所设计的Cas9-mRNA、gRNA能够有效对PCSK9蛋白进行下调，而相比于空白组，聚二甲双胍CRISPR/Cas9纳米递送系统能够有效递送Cas9-mRNA、Cas9蛋白、gRNA对PCSK9进行编辑，最终使PCSK9蛋白表达下调。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 一种基于前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因靶点的纳米递送系统的制备

<130> 2021-9-8

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

ggggaccaac tttggccgct gt 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

ttcgattatg ctgagtgata t 21

<210> 3

<211> 123

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

aagctaatac gactcactat aggggaccaa ctttggccgc tgtgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

ttt 123

<210> 4

<211> 4245

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

auggccccca agaagaagcg gaaggugggc auccacggcg ugcccgccgc cgacaagaag 60

uacagcaucg gccuggacau cggcaccaac agcgugggcu gggccgugau caccgacgag 120

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uaccuggacg agaucaucga gcagaucagc gaguucagca agcgggugau ccuggccgac 3900

gccaaccugg acaaggugcu gagcgccuac aacaagcacc gggacaagcc cauccgggag 3960

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aagaagaagg gcagcuaccc cuacgacgug cccgacuacg ccuga 4245