用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒、其制备方法以及使用其递送核酸基因的方法

摘要

本申请公开了用于递送核酸基因的具有改善的转染效率和稳定性的LDL样阳离子纳米微粒，所述阳离子纳米微粒被模仿天然LDL的脂质组分表面修饰和重建，公开了所述阳离子纳米微粒的制备方法和使用其递送核酸基因的方法。本发明的阳离子纳米微粒可有效地应用于过度表达LDL受体的癌症的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及用于递送核酸基因的低密度脂蛋白(LDL)样阳离子纳米微粒、其制备方法以及使用其递送核酸基因的方法，更具体地，涉及用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒，所述阳离子纳米微粒被天然LDL的组成成分——脂质组分表面修饰和/或重建，以便它具有改善的转染效率和稳定性，涉及所述阳离子纳米微粒的制备方法以及使用其递送核酸基因的方法。

背景技术

已经报导，作为RNA干扰的调节剂的21-25bp长度的合成的小干扰核糖核酸(siRNA)的双螺旋可引起哺乳动物细胞中目标信使RNA的裂解，这继而抑制特定基因的表达(A.Hamilton，D.Baulcombe，A species of smallantisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants，Science 286(1999)950-2.；S.Elbashir，J.Harborth，W.Lendeckel，A.Yalcin，K.Weber，T.Tuschi.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference incultured mammalian cells，Nature 411(2001)494-8.)。从那以后，在通过基因疗法治疗获得性或先天性疾病或病症方面，具有在mRNA水平选择性地击倒(knocking-down)目标基因的性能的siRNA引起了更多的关注。

siRNA是公知的针对基因疗法的希望的候选药物，然而，由于细胞内和细胞外的障碍，它在实际的治疗应用中具有局限性。带负电荷的siRNA显示极低的细胞摄取和转染效率。主要的细胞外障碍是被血清核酸酶化学降解，因此，siRNA在血液中的不稳定性造成静脉内(IV)给药方面的问题。

为了克服上述障碍，基于电荷互补行为，通过聚合电解质复合物形成，已经将阳离子脂质(De Paula D，Bentley MV，Mahato RI.Hydrophobizationand bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting)，RNA.13(2007)431-56)和/或阳离子聚合物(DJ.Gary，N.Puri，YY.Won，Polymer-basedsiRNA delivery：Perspectives on the fundamental and phenomenologicaldistinctions from polymer-based DNA delivery)，J Control Release.2007 May26，[打印前电子版])应用于siRNA递送系统。

特别地，在聚合电解质复合物(polyplex)形成中广泛使用以阻止血清核酸酶的聚阳离子聚乙烯亚胺(PEI)可附着于质膜，并且因此可以通过胞吞而被摄取。

然而，已知PEI通常通过坏死或凋亡造成各种细胞系的细胞死亡，而且，随着PEI的分子量和/或支化程度的增加，这样的细胞毒活性变得越明显。

已经表明，低分子量的PEI或聚乙二醇(PEG)接枝的PEI共聚物具有较低的细胞毒性。然而，由于阳离子聚合物的胺密度低并且复合物缩合的程度低，所以，该聚合物不能积极地转染细胞，并因此增加培养基中的酶促(水解)反应和siRNA的不稳定性。

应该注意，据显示，相比siRNA/PEI复合物，结合PEG的siRNA和PEI(分子量为25K)系聚合电解质复合物(PEC)微粒具有改善的对抗酶攻击的稳定性和优良的使基因沉默的效力。

得自天然来源的非合成载体可减轻细胞毒性，同时可提高生物相容性和生物可降解性，因此优选用于递送siRNA。天然载体的优选实施方案可以包含既不会引起免疫反应也不会被网状内皮系统(RES)识别的LDL的脂质部分。该LDL通常参与脂质和蛋白质的运输，具体地，通过其体循环参与将胆固醇递送至外部肝脏组织。

实际上，在临床前治疗或临床治疗中，将非亲水性的药物诸如环孢霉素A和两性霉素B脂质复合物(ABLC)与LDL微粒结合，以便被有效地递送。所述LDL可以与硬脂酰聚(L-赖氨酸)(硬脂酰-PLL)(所谓的Terplex DNA系统)结合，以便用于基因送递(DG.Affleck，L.Yu，DA.Bull，SH.Bailey，SW.Km，Augmentation of myocardial transfection usingTerplex DNA：a novel gene delivery system，Gene Ther.8(5)(2001)349-53)。对于该制剂，已经与带负电荷的DNA发生相互作用的PLL成分之间可能存在疏水作用。

同时，已知从血液中分离天然LDL的过程非常困难并且耗费大量时间。为此，人们已经使用胆固醇酯和磷脂在不加入载脂蛋白的条件下，开发出作为LDL模拟模型的重建的LDL样微乳(LDE)。已从动物研究和临床治疗揭露，被引入血流中的LDE像天然LDL那样发挥作用(RC.Maranhao，B.Garicochea，EL.Silva，P.Dorlhiac-Llacer，SM.Cadena，D.Coelho，JC.Meneghetti，FJ.Pileggi，DA.Chamone.Plasma kinetics and biodistribution ofa lipid emulsion resembling low-density lipoprotein in patients with acuteleukemia，Cancer Res.54(17)(1994)4660-6)。

然而，为了确立基于核酸基因诸如siRNA的方法的实际应用，仍强烈需要新的技术方案和/或策略以克服常规问题，诸如较低的转染效率和/或稳定性。

发明技术问题的公开

因此，本发明涉及解决关于常规方法的上述问题，而且，本发明的目的是提供用于递送核酸基因的具有改善的转染效率和稳定性的LDL样阳离子纳米微粒，所述阳离子纳米微粒被模仿天然LDL的组分表面修饰和/或重建。

本发明的另一个目的是提供制备用于递送核酸基因的具有改善的转染效率和稳定性的LDL样阳离子纳米微粒的方法。

本发明的又一个目的是提供用于递送核酸基因的方法，所述方法使用如上所述的用于递送所述核酸基因的具有改善的转染效率和稳定性的LDL样阳离子纳米微粒。

技术方案

为了实现以上目的，本发明的第一个方面是提供用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒，所述阳离子纳米微粒包含：含有胆固醇酯和甘油三酸酯的脂质核部分；和含有胆固醇、磷脂和阳离子脂质的阳离子表面脂质部分，该部分通过疏水作用形成所述脂质核部分的阳离子表面。

本发明还提供制备用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒的方法。

更进一步，本发明提供用于将核酸基因递送至目标细胞的方法，所述方法使用如上所述制备的LDL样阳离子纳米微粒。

有益效果

由于本发明的用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒被模仿天然LDL的组分表面修饰和重建，所以本发明的纳米微粒显示出优良的转染效率和稳定性，由此有效地将核酸基因特别地是siRNA递送至目标细胞。

附图简述

结合附图，相关领域的技术人员将更清楚本发明的以上目的、特征和优点。所述附图中：

图1的示意图说明用于制备阳离子脂质微乳(CLM)的LDL的脂质部分、DOPE和DC-胆固醇的组装，其中说明了通过带正电荷的CLM表面和带负电荷的siRNA之间的静电相互作用形成siRNA-PEG/CLM复合物的方法；

图2显示通过透射电子显微镜(TEM)观察到的CLM的图像，比例条是500nm；

图3显示通过透射电子显微镜(TEM)观察到的CLM的图像，比例条是200nm；

图4描绘的图表说明在10％血清存在下MDAMB435细胞中基因载体的细胞毒性分析结果，其中黑色长方形和白色圆圈分别代表PEI 25K和CLM；

图5说明siRNA/CLM复合物的特性，其中，测得的siRNA-PEG/CLM复合物的尺寸和ζ电位的结果与DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA-PEG的重量比具有函数关系；

图6说明siRNA/CLM复合物的特性，其中，凝胶阻滞分析结果与DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA-PEG的重量比具有函数关系，在长方形图片B中，M和O分别对应标记物和对照siRNA-PEG，箭头指示siRNA-PEG的完全复合的重量比。；

图7描绘的图表说明在含有10％血清的RPM-1培养基1640中测得的siRNA-PEG/CLM复合物的尺寸；

图8描绘的图表说明培养2小时后PC-3细胞中用cy3标记的siRNA-PEG/CLM复合物的流式细胞计数结果；

图9和10描绘的图表说明：由siRNA-PEG/CLM复合物的转染造成的基因表达抑制的比率与DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA-PEG的重量比具有函数关系。

实施本发明的最佳方式

从以下的详细描述和附图，本发明将更加清楚。

根据所述本发明的第一个方面，用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒包含：含有胆固醇酯和甘油三酸酯的脂质核部分；和含有胆固醇、磷脂和阳离子脂质的阳离子表面脂质部分，该部分通过疏水作用形成所述脂质核部分的阳离子表面。

本发明的胆固醇酯涉及与具有10-24个碳原子的饱和的或不饱和的脂肪酸通过酯化结合的胆固醇。优选地，所述胆固醇酯是具有16-18个碳原子的不饱和脂肪酸(诸如油酸)的酯。本发明的纳米微粒可以包括单种或多种胆固醇酯。

本发明的甘油三酸酯可以包括具有不同组成的各种脂肪酸的纯化的甘油三酸酯或主要含有具有多种脂肪酸的甘油三酸酯的植物油。优选地，所述甘油三酸酯包括动物油或植物油，并且所述植物油可以包括大豆油、橄榄油、棉籽油、芝麻油、肝油等。这样的油可以单独使用或以其两种或多种组合起来使用。

本发明的胆固醇酯和甘油三酸酯可以通过疏水作用形成本发明的LDL样阳离子纳米微粒的脂质核部分。

本发明的磷脂可以包括任意类型的中性磷脂、阳离子磷脂和阴离子磷脂，此外，可以包括单种或多种磷脂。所述磷脂可以包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、以上磷脂的溶血类型，或具有6-24个碳原子的脂族链的完全饱和的或部分硬化的形式。本发明的磷脂不受特别的限制，然而，可以包括选自以下的至少一种：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；卵磷脂酰胆碱(EPC)；二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；二油酰磷脂酰甘油(DOPG)；和二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)。

本发明的磷脂和胆固醇可以改善基因转染效率，并用作助手(helper)脂质用于减少阳离子脂质合成物的细胞毒性。磷脂通过促进所述纳米微粒的阳离子脂质与内体膜磷脂的融合使内体小泡的膜不稳定。此外，胆固醇为表面包装(packing)提供形态学刚性，由此改善所述纳米微粒的稳定性同时改善所述助手的活性。

本发明的阳离子脂质可以包括在特定pH(诸如生理pH)下本质上具有正电荷的阳离子脂质。根据本发明的示例性实施方案，所述阳离子脂质可以包括选自以下的至少一种：

3β-[N-(N′，N′，N′-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(TC-胆固醇)；

3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)；

3β-[N-(N′-一甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(MC-胆固醇)；

3β-[N-(氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(AC-胆固醇)；

N-(N’-氨基乙烷)氨基甲酰基丙酸生育酚(AC-生育酚)；

N-(N’-甲基氨基乙烷)氨基甲酰基丙酸生育酚(MC-生育酚)；

N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)；

N，N-二硬脂酰基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)；

N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)；

N，N-二甲基-(2，3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)；

N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)；

1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)；

1，2-二油酰基氨基甲酰基-3-二甲基铵丙烷(DOCDAP)；

1，2-二亚油酰基(dilineoyl)-3-二甲基铵丙烷(DLINDAP)；

二油酰氧基-N-[2-(精胺酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(DOSPA)；

双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)；

1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵(DMRIE)；

3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺式，顺式-9，12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)；

2-[5’-(胆甾-5-烯-3β-氧基)-3’-氧杂戊氧基]-3-二甲基-1-(顺式，顺式-9’，12’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)；

N，N-二甲基-3，4-二油基氧基苄胺(DMOBA)；

1，2-N，N’-二油基氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷(DOcarbDAP)；

1，2-二酰基-3-三甲基铵丙烷(TAP)；和

1，2-二酰基-3-二甲基铵丙烷(DAP)。

特别地，DC-胆固醇比其他阳离子脂质显示出更低的细胞毒性，而且DC-胆固醇系基因载体已经获得批准用于各种疾病的临床治疗，所述疾病包括例如黑素瘤、囊性纤维化、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等。因此，DC-胆固醇可优选地用于本发明。

本发明优选的实施方案是提供用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒，所述阳离子纳米微粒包含：含有胆固醇酯和甘油三酸酯的脂质核部分；和含有胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和3β-[N-(N′，N′-二甲氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)的阳离子表面脂质部分，该部分通过疏水作用形成所述脂质核部分的阳离子表面。

上述阳离子脂质可以与所述核酸通过静电相互作用结合以形成核酸/脂质复合物。

本发明的纳米微粒是LDL样阳离子纳米微粒。天然LDL通常包含两种脂质相，即极性组分(磷脂和载脂蛋白)和预先由胆固醇酯和甘油三酸酯组成的非极性的中性脂质，它们的组成和物理化学性质显示在表1中。磷脂和载脂蛋白使非极性脂质乳化，以确保其表面的稳定性，由此形成稳定的生物微乳。

表1

[表1]

[表]天然LDL的组成和它们的物理化学性质

本发明的用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒包含：30-60重量％胆固醇酯；0.1-10重量％甘油三酸酯；5-20重量％胆固醇；5-30重量％磷脂；和10-50重量％阳离子脂质。优选地，该纳米微粒可以包含：40-50重量％胆固醇酯；1-5重量％甘油三酸酯；8-12重量％胆固醇；12-16重量％磷脂；和25-30重量％阳离子脂质。

在本发明的纳米微粒中，所述脂质核部分与所述表面脂质部分的重量比可以是，相对纳米微粒载体的重量，30∶70-70∶30，优选地可以是40∶60-60∶40，并且更优地可以是45∶55-55∶45。

在本发明的示例性实施方案中，对于CLM，磷脂∶胆固醇∶阳离子脂质的摩尔比是9.4∶13∶26，阳离子脂质与助手脂质的摩尔比是1.16，这允许有效的组成具有基本上相等的摩尔比。

本发明的LDL样阳离子纳米微粒可以用于递送核酸。

这样的核酸可以选自siRNA、核糖体RNA(rRNA)、RNA、脱氧核糖核酸(DNA)、互补DNA(cDNA)、适体、信使DNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)和反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)，然而，并不具体地局限于这些。

例如，本文中使用的siRNA指双螺旋RNA或单链RNA(在所述单链RNA内具有双螺旋RNA形式)。双螺旋RNA的两条链可以通过核苷酸之间的氢键结合，所述双螺旋RNA中的所有核苷酸不需要完全地、互补地结合在一起。所述siRNA的长度可以是15-60、15-50或15-40个核苷酸(对于双螺旋RNA，是一条链的核苷酸数量，即碱基对的数量；而对于单链RNA，是该单链RNA内的双螺旋链的长度)。通常，以上siRNA包括长度为15-30、15-25或16-25个核苷酸，优选地长度为19-25、21-25或21-23个核苷酸的siRNA。此外，所述siRNA可以包括其中引入了不同官能团的核苷酸，以便增加在血液中的稳定性或损坏免疫活度。

因此，本发明的siRNA可以是一般siRNA的修饰形式或未修饰形式。例如，可以用聚乙二醇修饰所述siRNA的一个末端。

PEG是疏水性的、可弯曲的和非离子型的聚合物，而且是修饰纳米微粒的表面并使载体具有长的循环周期以防止单核巨噬细胞系统(MPS)识别纳米微粒的表面的一种广泛已知的物质(Xing X，Yujiao Chang J，Hung M.Preclinical and clinical study of HER-2/neu-targeting cancer gene therapy，Adv Drug Deliv Rev.30(1-3)(1998)219-227.；S.Mao，M.Neu，O.Germershaus，O.Merkel，J.Sitterberg，U.Bakowsky，T.Kissel.，Influence ofpolyethyleneglycol chain length on the physic-ochemical and biologicalproperties of poly(ethyleneimine)-graft-poly(ethyleneglycol) blockcopolymer/SiRNA polyplexes，Bioconjug Chem.17(5)(2006)1209-18)。

在本发明的示例性实施方案中，如果PEG具有5,000道尔顿的分子量，那么所述siRNA可充分受到保护，抵抗核糖核酸酶消化，同时继续保持其优良的转染性能。

在本发明中，所述阳离子脂质与所述核酸的N/P比率可以是0.1-128，优选可以是地0.5-32，并且更优地可以是1-16。在本发明的示例性实施方案中，所述阳离子脂质与所述核酸的重量比可以是1.4-3.2，并且优选地可以是2.8-16.8。

本发明的LDL样阳离子纳米微粒可以包含一类或多类载脂蛋白。所述载脂蛋白可以从天然脂蛋白中提取或通过蛋白质重组来制备。所述载脂蛋白的优选实例可以包括B-100、载脂蛋白E等。这样的载脂蛋白可以使本发明的纳米微粒以特定的方式被有效地引入细胞中。

根据本发明的第二个方面，提供制备用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒的方法。通过该方法制备的纳米微粒的组分的种类和含量基本上等同于上述的那些。

在本发明的示例性实施方案中，提供制备用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒的方法，所述方法包括：(a)将胆固醇酯、甘油三酸酯、磷脂、胆固醇和阳离子脂质溶解在有机溶剂中；(b)除去所述有机溶剂以产生脂质膜；和(c)向所述脂质膜中添加水溶性溶液以使所述脂质膜水合。

所述步骤(a)中使用的有机溶剂可以包括例如选自氯仿、甲醇和环己烷的至少一种。例如，所述有机溶剂是单独的氯仿或甲醇或者它们以相对比率的组合，然而，并不具体地局限于此。

在高于胆固醇酯的熔点的温度下除去所述步骤(b)中的有机溶剂，如果使用胆固醇油酸酯，所述温度优选地是52-60℃。

在本发明的另一个示例性实施方案中，提供制备用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒的方法，所述方法包括：(a’)溶解胆固醇酯、甘油三酸酯、磷脂、胆固醇和阳离子脂质；(b’)向以上溶液中加入水并混合以制备混合物；和(c’)搅拌所述混合物以形成均匀的溶液。

在所述步骤(a’)中，可以通过加热或使用上述步骤(a)中的有机溶剂来溶解所述脂质成分。在通过使用所述有机溶剂来溶解所述脂质成分的情况下，根据所述第二个示例性实施方案的以上方法还可包括从所述均匀的溶液中除去所述有机溶剂的步骤(d′)。在高于胆固醇油酸酯的熔点的温度下除去所述有机溶剂，如果使用胆固醇酯，所述温度优选地是52-60℃。

在所述步骤(b’)中，水的添加量可以是所述溶液的3-7倍(v/v)。

所述步骤(c’)中的搅拌可以通过任意的常规方法诸如声处理、高压均化、使用膜流化装置等来进行，以产生均一的微粒。关于声处理，它可以在125W时进行1-5分钟，然而，并不具体地局限于这些条件。

优选地，本发明的另一个示例性实施方案的用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒可以通过改良的溶剂乳化法来制备。

在本发明的第三个方面，提供将核酸基因递送至目标细胞的方法，所述方法使用如上所述的用于递送核酸基因的LDL样阳离子纳米微粒。

在本发明的示例性实施方案中，提供这样的方法，所述方法包括：(1)制备核酸基因和如上所述的LDL样阳离子纳米微粒的复合物；和(2)使所述制备的复合物转染目标细胞。

所述步骤(1)中的复合物可以通过在核酸基因存在下，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或除盐水中温育所述LDL样阳离子纳米微粒来形成。所述PBS的pH可以是7.0-8.0，并且所述PBS可以包含0.8％NaCl，然而并不具体地局限于此。

以上方法还可以包括所述步骤(1)之后的从核酸基因-PEG缀合物和所述LDL样阳离子纳米微粒得到的复合物的凝胶阻滞处理。可以实施这样的凝胶阻滞处理，以确定通过带负电荷的siRNA和纳米微粒的带正电荷表面之间的静电相互作用是否稳定地形成了所述复合物。

在本发明的另一个示例性实施方案中，如果使用PEG修饰所述核酸，那么以上方法还可以包括在所述步骤(1)之前形成核酸基因-PEG缀合物的步骤(1’)。

具体地，可以使用核酸基因和PEG之间的二硫键来获得所述步骤(1’)中的缀合物，更优选地，使用在siRNA的有义链的3’末端具有官能化的己胺基的核酸基因来制备所述缀合物。过量的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸盐(SPDP)在siRNA的3′末端处与己胺在PBS(pH 7.5)中反应，以激活该核酸。剩余的未反应的SPDP使用除盐柱除去。SPDP激活的siRNA可与PEG(分子量为5,000)-SH过量反应，以产生二硫键，由此与所述PEG结合。剩余的未反应的PEG-SH通过透析(MWCO＝10,000)除去，由此获得纯化的通过所述二硫键与所述PEG结合的siRNA。

例如，所述siRNA由于其良好的表达抑制活性，对基因治疗非常有用。然而，该核酸在稳定性和转染效率方面有问题，因此在实际应用中受到限制。

本发明的阳离子纳米微粒(CLM)可以在含有血清的培养基中通过静电相互作用与核酸形成稳定的复合物，其中，与所述核酸结合的CLM显示出非常低的细胞毒性和优良的细胞摄取，因此它对于递送所述核酸是非常有用的。

或者，可以使血浆载脂蛋白吸附到CLM的表面，由此使所述CLM模仿含有天然载脂蛋白的脂蛋白。因此，期望在体内通过天然脂蛋白机制产生所述CLM。

在下文中，从以下实施例和实验例，本发明将变得清楚，所述实施例和实验例的给出仅出于说明的目的，而不应该被解释成是对本发明的范围的限制。

所述实施例和/或实验例中使用的胆固醇油酸酯、甘油三油酸酯(甘油三酸酯)和未酯化的胆固醇购自Sigma Chemical。

L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐由Avanti Polar Lipids生产。

此外，VEGF siRNA和GFP siRNA购自Bioneer Co.(Daejeon，Korea)。GFP siRNA的有义链是5′-GCAAGCUGACCCUGAAGUUdTdT-3′，而其反义链是5′-AACUUCAGGGUCAGCUUGCdTdT-3′。同样地，VEGF siRNA的有义链是5′-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3′，而其反义链是5′-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3′。

N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸盐(SPDP)和巯基衍生的甲氧基聚(乙二醇)(mPEG-SH，分子量是5,000)分别购自Pierce(Lockford，IL)和Nectar(Huntsville，AL)。

胎牛血清(FBS)、Roswell Park Memorial Institute-1(RPM-1)培养基1610和达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)购自Gibco BRL(Grand Island，NY)。此外，用于分析的其他化学药品和试剂用于所述本发明的示例性实施方案中。

实施例1：阳离子脂质微乳的制备

通过改良的溶剂乳化作用制备阳离子脂质微乳(CLM)。更具体地，在玻璃瓶中，将22.5mg(45重量％)胆固醇油酸酯、1.5mg(3重量％)甘油三油酸酯、7mg(14重量％)DOPE、5mg(10重量％)未酯化的胆固醇和14mg(28重量％)DC-胆固醇溶解在2mL由氯仿∶甲醇(2∶1)组成的溶剂中。CLM中，DOPE∶胆固醇∶DC-胆固醇的摩尔比是9.4∶13∶26，阳离子脂质与助手脂质的摩尔比是1.16，这允许有效的组成具有基本上相等的摩尔比。

在充分搅拌下，向该溶液中加入10mL蒸馏水。用Branson 450超声破碎仪(20kHz，工作循环＝40，输出控制＝3.5)，使所得悬浮液接受3分钟声处理。

将制得的微乳转移至旋转蒸发仪，然后在52-60℃的温度(该温度是胆固醇油酸酯的熔点)下除去溶剂，并在4℃储存。

实施例2：siRNA-PEG的合成

siRNA-PEG通过二硫键结合。即，将300μg siRNA(20nmol VEGF或GFP siRNA)溶解在PBS(pH 7.5)中，所述siRNA已在有义链的3’-末端被己胺基修饰。

之后，将20μL(400nmol)20mM SPDP的DMSO溶液加入制得的siRNA溶液中。使该混合物在室温下反应3小时，然后通过凝胶渗透色谱法(D-SaltTM葡聚糖除盐柱，Pierce，Lockford，IL)除去过量SPDP以获得纯化的siRNA-SPDP。

接着，向纯化的siRNA-SPDP中加入在PBS(pH 7.5)中的4μmolmPEG-SH，随后在室温下反应3天。通过对除盐水透析(MWCO 10,000)来分离未反应的PEG，同时使用高速真空浓缩设备浓缩siRNA-PEG缀合物。

通过测定260和280nm处的UV吸收值来测定所得产物的纯度和浓度。纯化的siRNA-PEG缀合物保存在-80℃。

实施例3：复合物的形成

以分别是0、1.4、2.8、4.2、5.6和8.4的各DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA重量比使用siRNA-PEG，于室温下在PBS(pH 7.4和150mMNaCl)或脱盐水中温育CLM15分钟。之后，对所得复合物进行凝胶阻滞并通过测量其尺寸和ζ电位确定性质。

实施例4：siRNA-PEG/阳离子微乳复合物的凝胶阻滞

如上所述，以不同重量比制备各siRNA-PEG/CLM复合物(20μL)，并与2μL负载染料混合(10×)。将22μL全部悬浮液与tris-乙酸盐(TAE)电泳缓冲液加入具有2％琼脂糖凝胶的孔内进行电泳，于100V下、历时15分钟使所述孔从阴极移动至阳极。

使用溴化乙锭将所得siRNA-PEG染色以变得可见，并通过紫外线获得其凝胶图像。

实施例5：siRNA-PEG/CLM复合物的转染

用得自Korean Cell Line Bank(Seoul，Korea)的PC3细胞(人前列腺癌细胞系)进行细胞培养，使细胞生长在含有热灭活的10％(v/v)胎牛血清、100UI/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPM-1培养基1610上。

使过度表达的GFP和Samyang Co.(Daejeon，Korea)提供的稳定转染的MDAMB 435细胞(人乳腺癌细胞)生长在补充了10％血清和上述抗生素的DMEM上。

于37℃和5％CO₂下使细胞保持在潮湿空气中，随后使用胰蛋白酶/EDPA标准分裂细胞培养物。

使Cy3标记的siRNA-PEG与CLM复合，然后在含有10％血清的培养基中与PC3细胞温育2小时，由此完成其转染。

实验例1：阳离子纳米微粒的表征

通过激光散射法测得实施例3中制备的CLM的平均直径是103.6±4.5nm，用透射电子显微镜(TEM)观察到该CLM具有如图2所示的球形形态。该CLM的ζ电位是41.76±2.63mV。与天然LDL相比，因DC-胆固醇与DOPE结合而使该值增加，该CLM的表面电荷从负值变为正值。制备后，该CLM在室温下稳定地保持数周而无聚集。

作为主要的核组分的胆固醇油酸酯的熔点是52℃，该CLM核在常规生理温度下以固态存在。这是为什么该CLM能在长时期内保持稳定性的原因。具有高稳定性的该CLM会比常规的DC-胆固醇/DOPE脂质体制剂更有利。

关于该CLM的物理化学性质，据鉴定，该CLM是阳性修饰的用于递送siRNA的脂质微乳并可成为用于医学治疗应用的稳定的LDL样系统。

通过TEM可见地观察了CLM的形态。按序三次将20μL该微乳(5mg/mL)浸入尺寸为300目的Formvar/碳支架载网，随后将该载网干燥2分钟。在80kV用Zeiss Omega 912 TEM(Car Zeiss，Oberkochen，Germany)观察所得载网。

使用装备了He-Ne激光器的动态光散射仪(DLS)(Zeta-Plus，Brookhaven Instruments，NY)以632nm的波长和90°的探测角进行尺寸和ζ电位的测量，以测定该CLM和/或该CLM与siRNA-PEG的复合物的直径和表面ζ电位。

对于尺寸测量，合意地将各样品稀释在除盐水中，以保持每秒104-105的计数数量。为了研究复合物在血清中的稳定性，向该复合物中加入含有10％FBS的RPM-1培养基1640，并进行反应动力学方面的测量。

实验例2：阳离子纳米微粒的细胞毒性分析

对于阳离子纳米微粒的细胞毒性的测定，在进行细胞毒性分析之前24小时，将MDAMB 435细胞接种于96孔板(每孔104个细胞)。

在含有10％FBS的RPM-1培养基1610中制备具有不同浓度(3、6、12、18、24、36、48和72μg/mL)的各CLM和PEI。除去培养基之后，向平板的各个孔中加入100μL制备的悬浮液。使细胞与CLM或PEI悬浮液在37℃下温育24小时，向各孔中加入10μL Cell Counting Kit-8(CCK-8)溶液(Dojindo molecular technologies Inc.，MD，USA)。细胞在37℃下再温育4小时，使用微孔鉴定板(BioRad Model 550)在450nm下对培养基进行吸收测量。

通过将MDAMB 435细胞的细胞脱氢酶释放到培养基中并对结果定量，来实施体外细胞毒性分析。考虑到以下转染实验，在含有10％血清的培养基的存在下，以3-72μg/mL的量使用CLM或作为一种最流行的非病毒类基因载体的PEI 25K，用于以上分析。在培养24小时后，在18μg/mL时，PEI 25K仅显示出6.9±0.4％细胞存活率(IC50值是约9μg/mL)。而CLM直到48μg/mL时基本上显示无有害影响。对于高剂量给药，72μg/mLCLM显示出78±1％的细胞存活率，这大大高于显示出5.2±0.1％的细胞存活率的PEI 25K(见图3)。

无siRNA的PEI 25K和CLM之间的细胞毒性比较表明，CLM比PEI25K显示出更低的细胞毒性。这表明CLM在细胞毒性方面会比PEI更有利，可以具有稳定的转染效率并优选地代替PEI。

实验例3：siRNA-PEG/CLM复合物的表征

对于siRNA-PEG和CLM之间的复合与DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA的重量比的函数关系的表征，在室温下使siRNA-PEG与CLM在水溶液中温育。通过根据DLS测量微乳的尺寸和其ζ电位来测定通过静电相互作用复合的程度。

如图5中说明的，当DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA的重量比从1增加至4.67时，CLM的ζ电位从-13.8±3.9mV增加至+35.67±1.2mV，然后，当DC-胆固醇/siRNA的重量比超过4.7时，保持该ζ电位值。这些数据表明，在DC-胆固醇/siRNA重量比为4.7时，所有带负电荷的siRNA磷酸酯残基完全与CLM形成复合物。

而且，观察到，包被了siRNA-PEG的CLM的尺寸基本上保持接近100nm，这与DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA-PEG的重量比无关，因此，在与siRNA-PEG一起温育后，CLM未发生很多的聚集(见图5)。从这些尺寸和ζ电位数据显示，siRNA-PEG/CLM复合物的带正电荷的表面可以产生复合物之间的电荷排斥。

此外，确定了：复合物表面上的PEG链用作保护云(protective cloud)，并通过空间排斥防止CLM聚集。

与此同时，对重量比为1.4-8.4的DC-胆固醇(包含在CLM)/siRNA实施凝胶阻滞分析。作为琼脂糖凝胶电泳的结果，发现在5.6和8.4的重量比时，CLM被siRNA-PEG充分阻滞(见图6)。

这些结果表明，当所述重量比超过5.6时，通过电荷相互作用充分形成了siRNA-PEG/CLM复合物。ζ电位数据和凝胶阻滞分析证明，在约5的重量比时复合是完全的，因此支持siRNA-PEG/CLM复合物的复合与重量比之间的相互关系。

实验例4：siRNA-PEG/CLM复合物在含有10％血清的培养基中的稳定性

通过经二硫键的结合，将PEG 5K引入siRNA递送系统。产生siRNA-PEG/CLM复合物后，使用DLS在含有10％血清的培养基中测量该复合物的尺寸。

如图7中所示，在动力学方面表现出两类吸附模式，即血浆蛋白的快速和慢速吸附。快速吸附在2分钟的温育时间之后达到，在所述温育时间中，复合物的尺寸增加至47.6nm。当在含有血清的培养基中进行温育达2-20分钟时，siRNA-PEG/CLM复合物的尺寸慢慢地但逐步地增长到19.3nm(例如，在2分钟时为151.2±13.2nm，在20分钟时为170.3±29.9nm)，显示其特定的变化曲线。

这表明，最初时，血浆蛋白颗粒在聚乙二醇化(PEG化)的纳米微粒系统的表面上的吸附和重排增加了，在温育20分钟后达到其最大水平。这些事实解释了在最初的20分钟温育过程中，蛋白质在siRNA-PEG/CLM复合物上的吸附。而且，当温育进行了20-60分钟时，复合物的尺寸基本上未改变，没有因聚集造成尺寸增加，因此显示出该复合物的稳定性。

以上获得的结果表明，模仿LDL的纳米微粒上的PEG链造成的空间排斥可减少血浆蛋白的离散吸附并可提供在含有血清的培养基中的高稳定性且无聚集现象。

实验例5：siRNA-PEG/CLM复合物的细胞摄取

为了评估siRNA/CLM复合物的细胞摄取能力，使Cy3标记的siRNA-PEG与CLM复合，然后在含有10％血清的培养基中与PC3细胞温育2小时。对所得cy3-siRNA-PEG/CLM复合物进行相对细胞摄取流式细胞计数。

更具体地，在六(6)块细胞板上以每孔5×105个细胞的密度接种PC3细胞，所述细胞在含有10％FBS和抗生素的RPM-1培养基1640中在37℃下生长24小时。在除去培养基后用PBS(pH 7.4)洗涤所得细胞。1μgsiRNA-PEG或siRNA-PEG/CLM复合物(其中DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA的重量比为8.4)在37℃温育2小时。除去培养基，停止细胞摄取。所得细胞用冷PBS轻轻洗涤，随后使用1％(w/v)多聚甲醛溶液固定细胞。通过流式细胞计(FACScan，Becton，Dickinson)观察细胞摄取并使用CELLQUEST软件(PharMingen)进行分析。

图8显示，cy3-siRNA-PEG/CLM复合物的荧光强度曲线移动至图表的右侧。该结果证明细胞摄取显著地大于对照。

在仅为cy3-siRNA-PEG的情况下，相比对照，细胞摄取结果有轻微移动。因此，推测cy3-siRNA-PEG可自我形成，微粒可造成细胞摄取的小幅增加。

实验例6：siRNA-PEG/CLM复合物的转染效率

使用稳定的MDAMB 435细胞系测定siRNA-PEG/CLM复合物抑制siRNA基因的效力，所述细胞系过度表达GFP并在含血清培养基中转染。

更具体地，在转染实验之前，在十二(12)块细胞板上以每孔2×105个细胞的密度接种过度表达GFP的MDAMB 435细胞并培养24小时，所述孔含有具有10％FBS和抗生素的DMEM培养基。除去培养基后，所得细胞用PBS(pH 7.4)洗涤三次。

于37℃下在含有10％FBS的培养基中转染1μg各siRNA-PEG或具有不同的DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA重量比(比率为0、1.4、2.8、5.6、8.4和16.8)的siRNA-PEG/CLM复合物2小时。用补充血清的新鲜培养基代替细胞上清液。

接着，使转染的细胞生长42小时并使用0.1％Triton X100的PBS溶液进行处理。在525nm下对细胞裂解液进行荧光测量(该裂解液在488nm处显示激发)。

对于使用PC3细胞进行的VEGF释放抑制实验，如上所述使样品转染，4小时后，用含有血清的新鲜培养基代替使用过的细胞培养基。转染处理后培养6小时，然后再次用补充了10％FBS和20μg/mL肝素的新鲜RPM-1培养基代替使用过的培养基。样品再温育16小时，然后收集含有VEGF的细胞上清液。

根据生产商的使用说明书，使用Quantikine人VEGF免疫测定试剂盒(R&D System，Minneapolis，MN)测定从细胞释放的VEGF的浓度。

在含有10％血清的RPM-1培养基中，分别使用过度表达GFP的MDAMB 435细胞或释放VEGF的PC-3细胞处理GFP或VEGF基siRNA-PEG/CLM复合物。

图9显示以上复合物的使GFP基因沉默的效力。根据DC-胆固醇(包含在CLM中)/siRNA的重量比的增加，siRNA-PEG/CLM复合物在1.4-8.4的重量比范围内抑制GFP基因的表达。

在5.6和8.4的各个重量比时，含有GFP基siRNA-PEG的CLM复合物在GFP表达方面分别显示出41.2±3.7％和58.9±4.9％的下调节率。该结果基本对应一个事实，即在所述重量比超过5.6的情况下完全形成了GFP基siRNA-PEG/CLM复合物。

可解释为，通过完全复合为对siRNA具有化学计量作用的递送系统，可以改善使基因沉默的性能。还可以在释放VEGF的PC3细胞中以与上述相同的方法(除了使用与CLM复合的VEGF基siRNA-PEG)来测定转染效率。PC3细胞的VEGF抑制曲线基本上与MDAMB 435细胞的GFP抑制曲线相同(见图10)。

对于重量比为5.6和8.4的VEGF基siRNA-PEG/CLM复合物，VEGF表达抑制率分别是37.6±1.2％和53.8±0.9％。这些结果依次在PC3细胞中呈现。同时，单独的siRNA-PEG使基因沉默的效率分别是6.9±6.5％和9.55±7.2％，因为GFP基siRNA-PEG和VEGF基siRNA-PEG都显示低细胞摄取能力(见图9和10)。

在16.8的重量比下，GFP基siRNA-PEG/CLM和VEGF基siRNA-PEG/CLM复合物的目标蛋白表达抑制率分别是38±0.3％和22.8±13％。这些结果表明，鉴于细胞摄取，未复合的CLM可以保留并与siRNA-PEG/CLM复合物竞争。这可能是使基因沉默的效率在16.8的重量比时轻微下降的原因。

尽管参考附图和示例性的实施方案描述了本发明，但是本领域的技术人员会理解，在不脱离所附权利要求书定义的本发明的范围的情况下可以在其中作各种修改和变化。

工业实用性

从以上公开的说明可明白，LDL受体在各种癌症例如髓性白血病细胞、肠癌、肾癌、脑癌等中过度表达，因此，本发明的阳离子纳米微粒有效地用于使用此类LDL受体治疗以上疾病的癌症治疗中。

虽然结合附图中例举的示例性的实施方案描述了本发明，但这仅仅是说明性的。本领域的技术人员会理解，可以对本发明做各种修改和等同。因此，本发明真正的技术范围应该由所附权利要求书确定。