一株棘孢木霉6S-2及其在减轻苹果连作障碍中的应用

摘要

本发明公开了一株棘孢木霉6S‑2及其在减轻苹果连作障碍中的应用，属于农业微生物技术领域。所述棘孢木霉6S‑2的生物保藏号为：CGMCC NO.23275，该菌株是一株内生菌，且对ARD专化型层出镰孢菌MR5和多种病原菌均具有拮抗作用；具有蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和漆酶等活性；分泌铁载体、生长素和产生氨气，且具有一定的溶磷能力；发酵萃取液具有抑菌和促生的活性；挥发性物质也具有抑菌能力。孢子液施加到连作苹果园土壤中，可减少植物的氧化损伤，促进苹果砧木生长，减轻苹果连作障碍。

说明书

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株棘孢木霉6S-2及其在减轻苹果连作障碍中的应用。

背景技术

苹果连作障碍(ARD)是一种由多种因素引起的复杂疾病(Mazzola和Manici,2012；Spath等，2015)，普遍认为土壤微生物群落结构失衡是造成ARD的主要原因(Mazzola和Manici,2012；Manici等，2018)。前期研究表明，镰孢菌是引起渤海湾地区ARD的主要病原菌(Wang等，2018)，而实验室最近筛选和鉴定的与ARD相关的专化型层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)MR5对苹果植株具有高致病性。传统的化学熏蒸和农药施用对防治ARD非常有效，但不符合生态发展的理念(Lu等，2020)。

目前，木霉属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属被广泛用作生物防治剂(Harman等2004；Hu等，2020；Maciag等，2020)，符合“双减”的理念。此外，与根际土壤微生物相比，内生菌可以更有效地定殖在植物体中，以适应环境变化，从而增强对疾病的抵抗力，促进植株的生长(Bogner等，2016)，因此内生真菌也常被用作生物防治剂、植物生长促进剂(Saad等，2019；Poveda等，2021；Poveda，2021a)。例如，从天竺葵等分离出的内生真菌具有丰富的生防次生代谢物(Saad等，2019)。Poveda等(2021)还发现内生菌可以通过增加对养分(氮、磷、钾、锌、铁)的获取、产生植物激素从而促进植物的生长。

木霉属是农业生产中最传统的有益微生物属，对植物病害显示出强大的生防效果。棘孢木霉(Trichoderma asperellum)是木霉属中的一种重要真菌，研究表明，用棘孢木霉接种洋葱具有作为合成杀真菌剂替代品的潜力，可用于保护洋葱免受病原菌的侵染(Zapata-Sarmiento等，2020)。棘孢木霉可以分泌几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶，降解真菌细胞壁，促进真菌寄生，对禾谷镰孢菌菌丝的抑制率高达60％，并能够产生聚酮化合物、烷烃和其他抗真菌次级代谢产物以抑制病原体生长，其颗粒菌肥的施用促进了玉米的生长(Wu等，2017；He等，2019)。棘孢木霉与菌根真菌共同作用可促进植物防御体系，抵抗黑荚果病。虽然棘孢木霉在绿色农业中显示出巨大的发展潜力，但尚未见其对引起ARD专化型镰刀菌生防作用的报道。

发明内容

发明人经长期的技术与实践探索，发明人从连作果园中经常出现的“抑病土壤”现象入手，从连作果园健康的苹果根中分离得到一株棘孢木霉6S-2，该菌株是一株内生菌，且对ARD专化型层出镰孢菌MR5和多种病原菌均具有拮抗作用；具有蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和漆酶等活性；分泌铁载体、生长素(IAA)和产生氨气，且具有一定的溶磷能力；发酵萃取液具有抑菌和促生的活性；挥发性物质也具有抑菌能力。孢子液施加到连作苹果园土壤中，可减少植物的氧化损伤，促进苹果砧木生长，减轻苹果连作障碍。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2，该菌株已于2021年10月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.23275。

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2，分离自连作苹果园健康果树根系，具有如下特征：

在PDA固体培养基上生长时，初期菌丝为白色的羊毛状，向边缘扩散，菌落背面无色；中期逐渐变成浅绿色，发育较早的菌丝上开始形成孢子环，逐渐由黄色转变为绿色，气生菌丝更为茂盛，变厚，呈现棉絮状；后期菌落会形成3个白绿相间的同心轮纹，圆环上附着有浓密的分生孢子，菌株整体呈现深绿色，且越接近中心的部位颜色越深，缺少气生菌丝，5天即可长满平板；在查彼得培养基上生长时，初期平板上会形成黄色的疱状突起结构，后期逐渐成熟变绿，最终形成黄绿相间的圆环，有利于孢子的产生与繁殖；在CMD培养基和SNA培养基上生长时，菌丝纤细稀薄，菌落透明，呈现辐射状，3天左右即可覆盖整个培养基，分生孢子呈簇垫状，最终形成暗绿色的疱状圆环，在CMD培养基上疱状更加聚合，紧凑，而在SNA培养基中，疱状结构比较分散，呈现半环状或者片状。

在60倍普通光学显微镜下观察时，菌丝细长有隔，主枝呈树枝状，细长，分生孢子梗分枝形成次生枝，主轴顶端下面生出的初生分枝常呈对生，与主轴的夹角为近90°，随着离顶端距离的增加，初次分枝的长度也增加，每对分枝的长度几乎相等，在接近主轴位置形成的二次分枝最长，二次分枝能够产生第三次分枝，而第三次分枝则不再进一步分枝。分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，瓶梗产生于初次、二次和三次分枝的顶端，瓶梗较短，在瓶梗尖端会急剧收缩变细，弯曲，中间膨大，呈现安瓿瓶形，顶端3个或4个一组轮生，呈旋涡状排列，发育成熟后，会在瓶梗尖端产生分生孢子。分生孢子为绿色的球形或者卵圆形，聚集或者分散排列，壁上有细密的小刺，且会有厚垣孢子产生。

上述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的孢子悬液、孢子粉、发酵萃取液和/或挥发性物质也属于本发明的保护范围。

作为优选，所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的孢子悬液由如下方法制备而成：

将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2置于PDA培养基上28℃培养7天后，用无菌水冲洗孢子，制成孢子悬液。

作为优选，所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的孢子粉由如下方法制备而成：

将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的孢子悬液接种于发酵培养基中，28℃恒温培养10-14d；发酵结束后风干、粉碎、过筛，得到孢子粉；所述发酵培养基是由麦麸和玉米粉按照体积比4：1混合，加入无菌水，使发酵培养基中无菌水的质量分数为45％。

在本发明的一个具体实施方案中，棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的孢子粉的制备方法如下：

将保存在试管中的6S-2活化后接种在PDA培养基上生长7天至长出孢子，无菌水冲洗孢子，制成孢子液；后采用浅盘发酵的方法扩繁6S-2的孢子粉。将400g灭菌培养基(麦麸与玉米粉按照4：1的体积比混合，加入无菌水，使发酵培养基中无菌水的质量分数为45％)放入30cm×20cm×5cm的浅盘中，按液体接种的方式，将孢子液按2％(体积分数)的比例接种1.0×10

作为优选，所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的发酵萃取液由如下方法制备而成：

将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2置于PDA培养基上28℃培养7天后，用无菌水冲洗孢子，制成孢子悬液；将孢子悬液加入到PDB培养基中，160r/min，28℃，培养8天，过滤后，12000r/min离心5min，收集上清液；将所收集到的上清液与乙酸乙酯按照体积比1：1的比例进行萃取，收集萃取液并浓缩至干粉状，然后再重新回溶于甲醇溶液中，离心后过滤膜除去杂质，制备得到发酵萃取液。

本发明的第二方面，提供上述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2或者棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的孢子悬液、孢子粉、发酵萃取液和/或挥发性物质在如下(1)-(4)至少一项中的应用：

(1)抑制植物病原菌的生长以及孢子的萌发；

(2)制备用于抑制植物病原菌的产品；

(3)防治由植物病原菌所致病害；

(4)制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品。

优选的，所述植物病原菌为所述植物病原菌为ARD专化型层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)MR5、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、茎枯病原菌(Phoma asparagi)、链格孢菌(Alternariaalternata)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)，巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和/或黄曲霉(Aspergillus flavus)。

本发明的第三方面，提供棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2在如下(1)-(4)至少一项中的应用：

(1)生产蛋白酶、纤维素酶、漆酶和/或淀粉酶；

(2)产生IAA；

(3)产生铁载体；

(4)产生氨气。

本发明的第四方面，提供棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的发酵萃取液或者孢子悬液在如下(1)-(3)任一项中的应用：

(1)促进植物侧根的产生和伸长；

(2)减少植物的氧化损伤；

(3)促进植物生长。

优选的，所述植物为拟南芥或苹果砧木。

本发明的第五方面，提供上述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2或者棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的孢子悬液、孢子粉和/或发酵萃取液在如下(1)或(2)中的应用：

(1)减轻苹果连作障碍；

(2)制备减轻苹果树连作障碍的生防制剂。

本发明的第六方面，提供一种减轻苹果连作障碍的方法，包括以下步骤：

将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的孢子悬液、孢子粉和/或发酵萃取液施于苹果连作土壤。

本发明的有益效果：

本发明首次从连作苹果园健康果树根系中分离得到一株内生棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2，具有潜在的拮抗促生能力。对引起苹果连作障碍的专化型层出镰孢菌MR5抑制率高达52.41％，且对尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、串珠镰孢菌、疣孢漆斑菌、恶疫霉、瓜果腐霉、立枯丝核菌、链格孢菌等都具有较强的拮抗抑制效果。该菌株具有产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和漆酶等活性；分泌铁载体、生长素(IAA)和产生氨气，且具有一定的溶磷能力。此外，棘孢木霉6S-2的发酵萃取液不仅可以抑制病原菌的生长，导致其菌丝扭曲、皱缩、膨胀、破裂并释放其内容物，而且在50mg/ml的浓度下能够最大促进拟南芥侧根的产生和伸长；该菌株的挥发性物质也具有抑菌能力。盆栽条件下，将6S-2孢子液施加到连作土壤中，可减少植物的氧化损伤，促进植物生长；在减轻苹果树连作障碍方面具有良好效果，为苹果连作障碍的生物防治提供了理论依据。

附图说明

图1：6S-2菌株与MR5拮抗试验图：MR5对照(a)，平板对峙正面(b)，平板对峙反面(c)；6S-2回接再分离图：对照(d)，培养3天菌丝形态(e)，培养5天菌丝形态(f)；MR5与6S-2共培养后，扫描电镜观察菌丝形态图(g-l)；MR5菌丝PI染色：MR5对照(m)，与6S-2共培养的MR5(p)；根系PAS染色图：横截面100x(n)、横截面400x(o)、纵切面100x(q)和纵切面400x(r)。

图2：6S-2菌株形态观察：PDA培养基(a)，查彼得培养基(b)，CMD培养基(c)，SNA培养基(d)；6S-2形态学分析：普通光学显微镜下60倍观察到的孢子梗形态(e-g)，孢子形态(h)；扫描电镜下孢子梗形态(j-m)，孢子形态(i)；6S-2功能分析：NBRIP培养基上溶磷活性(n)，解淀粉酶活性(o)，CAS培养基覆盖产铁载体活性(p)，产漆酶活性(q)，产纤维素酶活性(r)，产蛋白酶活性(s)，产氨气检测(t)：6S-2+Nesler试剂(t1)、6S-2(t2)，产IAA活性(u)：IAA标准品(u1)、6S-2+Salkowski试剂(u2)、6S-2(u3)。

图3：来自木霉属的44个分类群的ITS和TEF基因组合的最大似然系统发育树。Protocrea pallida和Protocrea farinosa的序列被用作外群。进化树显示了≥70％的Bootstrap值和≥0.90的贝叶斯后验概率。比例尺代表每个核苷酸位置的10个替换。本发明中获得的真菌物种序列以粗体显示，与已知物种Trichoderma asperellum SZMC:24288的序列100％相同。

图4：6S-2菌株与12种不同病原真菌的对峙实验(PDA培养基)：尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum(a)，层出镰孢菌Fusarium proliferatum(b)，腐皮镰孢菌Fusariumsolani(c)，串珠镰孢菌Fusarium moniliforme(d)，恶疫霉Phytophthora cactorum(e)，瓜果腐霉Pythium aphanidermatum(f)，茎枯病原菌Phoma asparagi(g)，链格孢菌Alternaria alternata(h)，疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria(i)，巴西青霉Penicillium brasilianum(j)，立枯丝核菌Rhizoctonia solani(k)，黄曲霉Aspergillusflavus(l)；6S-2菌株对不同病原真菌生长速率的抑制条形图(m)。

图5：6S-2菌株发酵萃取液抑制病原菌生长试验：牛津杯试验：左侧为甲醇，右侧为无菌水(a)；左侧为6S-2发酵萃取液，右侧为无菌水(b)；玻璃纸上接种空白琼脂块7天后接种MR5(c)；玻璃纸上接种6S-2菌株7天后接种MR5(d)；MR5在含有不同浓度6S-2发酵萃取液的PDA培养基上生长七天菌丝形态：50mg/L(e)，100mg/L(f)，150mg/L(g)，200mg/L(h)；20倍镜下，MR5孢子液与甲醇共培养36小时后孢子萌发状态(i)；20倍镜下，MR5孢子液与6S-2发酵萃取液共培养36小时后孢子萌发状态(j)；玻璃纸上接种空白琼脂块7天后接种MR5，20倍普通光学显微镜下菌丝形态(k,l)，扫描电镜下菌丝形态(o)；玻璃纸上接种6S-2菌株7天后接种MR5，20倍普通光学显微镜下菌丝形态(m,n)，扫描电镜下菌丝形态(p-w)。

图6：6S-2菌株挥发性物质的抑菌活性：PDA培养基双层板试验：上层为MR5，下层为空白培养基(a)；上层为MR5，下层为6S-2菌株(b)；上层为MR5，下层为6S-2菌株和活性炭(c)；PDA培养基二分板试验：顶部为单独培养的MR5对照，底部为与6S-2菌株共同培养的MR5(d)；20倍普通光学显微镜下MR5对照菌丝形态(e,f)；20倍普通光学显微镜下，与6S-2共培养后MR5菌丝形态(g,h)；扫描电镜下MR5对照菌丝形态(i,j)；扫描电镜下与6S-2共培养后MR5菌丝形态(k-n)。

图7：6S-2菌株挥发性物质和发酵萃取液对拟南芥生长的影响：拟南芥幼苗在1/2MS培养基上生长状态(a)；拟南芥幼苗对照在二分板上生长状态，左侧为1/2MS培养基，右侧为PDA空白培养基(b)；拟南芥与6S-2菌株在二分板上共同培养时生长状态，左侧为1/2MS培养基，右侧为接种6S-2菌株的PDA培养基(c)；二分板上拟南芥的根长度(d)；二分板上拟南芥的鲜重(e)；二分板上拟南芥一级侧根的数量和侧根的长度分布(f)；拟南芥在含有不同浓度甲醇溶液的1/2MS培养基上的生长状态：10mg/L(g1)，50mg/L(h1)，100mg/L(i1)，150mg/L(j1)，200mg/L(k1)；拟南芥在含有不同浓度6S-2发酵萃取液的1/2MS培养基上的生长状态：10mg/L(g2)，50mg/L(h2)，100mg/L(i2)，150mg/L(j2)，200mg/L(k2)；不同浓度6S-2发酵萃取液对拟南芥根长的影响(l)；不同浓度6S-2发酵萃取液对拟南芥鲜重的影响(o)；不同浓度6S-2发酵萃取液对拟南芥一级侧根数和侧根长度分布的影响：10mg/L(m)，50mg/L(n)，100mg/L(p)，150mg/L(q)。

图8：盆栽条件下植株生物量、根系保护酶活性和光合指标的测定：T337幼苗栽植在连作土壤中(a)，叶片及根系NBT染色(a1-a3)，叶片及根系DAB染色(a4-a6)；T337幼苗栽植在连作土壤中后施用6S-2孢子悬液(b)，叶片及根系NBT染色(b1-b3)，叶片及根系DAB染色(b4-b6)；平邑甜茶幼苗栽植在连作土壤中(c)；平邑甜茶幼苗栽植在连作土壤中根系扫描图(d)；平邑甜茶幼苗栽植在连作土壤中后施用6S-2孢子悬液(e)；平邑甜茶幼苗栽植在连作土壤中后施用6S-2孢子悬液根系扫描图(f)；平邑甜茶幼苗株高(g)；平邑甜茶幼苗茎粗(h)；平邑甜茶幼苗地上部鲜重(i)；平邑甜茶幼苗地上部干重(j)；平邑甜茶幼苗根系表面积(k)；平邑甜茶幼苗根系体积(l)；平邑甜茶幼苗根系鲜重(m)；平邑甜茶幼苗根系干重；胞间CO

图9：土壤可培养微生物数量统计图：细菌(a)；真菌(b)；放线菌(c)；细菌/真菌比(d)；四种镰孢菌实时荧光定量分析：尖孢镰孢菌(e)；层出镰孢菌(f)；腐皮镰孢菌(g)；串珠镰孢菌(h)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，苹果连作障碍会造成苹果果实产量和品质下降、病虫害加重、树势衰弱甚至死亡，对果农造成严重的经济损失。目前关于棘孢木霉在防治苹果连作障碍方面的研究还鲜有报道。

基于此，本发明从连作苹果园健康果树根系中分离得到一株内生真菌6S-2，根据形态学、生理生化特征检测和基于ITS，Tef1-α基因的系统发育分析，鉴定该菌为棘孢木霉。与现有报道的棘孢木霉不同的是，本发明筛选分离的棘孢木霉6S-2是一种极具开发潜力的新型生防菌，其集拮抗抑菌、产拮抗酶、分泌促生长因子、促进拟南芥和苹果砧木生长、减轻苹果树连作障碍等多种功效于一体。本发明采用平板对峙法研究其对引起苹果连作障碍的专化型层出镰孢菌、尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、串珠镰孢菌、疣孢漆斑菌、恶疫霉、瓜果腐霉、立枯丝核菌、茎枯病菌、巴西利亚青霉、黄曲霉、链格孢菌等12种病原菌的拮抗效果，棘孢木霉6S-2对12种病原菌均具有较强的拮抗抑制效果，且对ARD专化型层出镰孢菌MR5的抑制率高达52.41％。且6S-2菌株具有产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和漆酶等拮抗酶的活性，并能够分泌铁载体、生长素(IAA)和产生氨气，具有一定的溶磷能力。此外，6S-2菌株的发酵萃取液不仅可以抑制病原菌的生长，导致其菌丝扭曲、皱缩、膨胀、破裂并释放其内容物，而且在50mg/ml的浓度下能够最大程度地促进拟南芥侧根的产生和伸长；该菌株的挥发性物质也具有抑菌能力。盆栽条件下，将6S-2孢子悬液施加到连作土壤中，可减少平邑甜茶幼苗(苹果砧木)氧化损伤的程度，促进根系保护性酶的活性并降低MDA的含量，提高净光合速率，同时促进植物生长，说明6S-2菌株在减轻苹果连作障碍方面具有良好效果。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：

PDA培养基：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。

脱脂奶粉培养基：脱脂奶粉10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。

纤维素酶检测培养基：蛋白胨10.0g，酵母粉10.0g，羧甲基纤维素钠10.0g，NaCl5.0g，KH

查彼得培养基：KNO

CMD培养基:玉米粉50.0g，葡萄糖2.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.0。

SNA培养基：KH

NBRIP培养基：葡萄糖10.0g，Ca

解淀粉酶培养基：淀粉20.0g，KCl 0.5g，NaNO

铁载体培养基(CAS)培养基CaS 60.5mg，十六烷基三甲基溴化铵72.9mg，哌嗪-1，4-双(2乙磺酸)2.4g，在10mM盐酸和琼脂糖(0.9％w/v)中加入1mMM FeC1

漆酶培养基：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，愈创木酚0.4g，蒸馏水1000mL。

产氨气检测：将菌株接种于含有10mL 4％蛋白胨肉汤的液体培养基的试管中，在28±0.1℃下培养，培养6～7d后，加入1mL Nesler试剂，观察颜色变化。

产生长素检测：将菌株培养在在含色氨酸(1g/L)的10.0ml PDB的培养基中，25±0.1℃培养7d。用Whatman滤纸过滤，1mL滤液与2mL Salkowski试剂(2％0.5M FeCl

1/2MS培养基：生产编号：HB8469-6(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。

ARD专化型层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)MR5，其分类命名也称为“层生镰刀菌”，MR5菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.22426，保藏时间为2021年5月17日。菌株MR5仅对苹果砧木具有致病性，属于苹果专化型。

实施例1：菌株的分离和鉴定

1.菌株的分离纯化：

采用改良的贴根段法从烟台和沂源地区9个老苹果园(15-25年生)更新重建4-5年的连作果园中，选取健康旺盛苹果的根系立刻进行内生拮抗真菌的筛选。先用自来水冲洗根部5min去除粘附的土壤颗粒，然后在75％乙醇中浸渍2min进行表面灭菌，后用无菌水冲洗3次，然后在5％的次氯酸钠溶液浸泡5min，最后用无菌水冲洗5次。适当干燥后，将表面灭菌的根切成1cm的根段，转移到含有千分之四青霉素链霉素(100×)的PDA培养基中分离内生真菌，每个培养皿中放置四根，培养皿在28℃下保持一周。此外，将最后一次冲洗根系的无菌水涂布到相同的培养基上放置到相同环境下培养，确认根部是否已经完全消毒。结果显示涂布的平板上没有杂菌产生，健康苹果根系在表面消毒后培养3-4天后，菌丝逐渐从根样品的切割端生长出来。挑取菌丝至新的不添加抗生素的PDA平板上继续培养，共分离出内生真菌15株。

2.菌株的筛选：

菌株的初筛采用平板对峙法，将从根系分离的菌株与活化后的ARD专化型层出镰孢菌MR5在PDA平板上进行对峙试验。用直径5mm打孔器在病原菌边缘打取菌块，接种到PDA平板中央，在距离病原菌菌块2cm处的连线上接种根系中分离的菌株，以培养基中心只接种病原菌作为空白对照，每个处理重复3次，28℃培养，7d后选出有抑菌圈的菌株，进行复筛。复筛得到一株对MR5抑菌率最高的拮抗真菌，抑菌圈的宽度为6mm，命名为6S-2(图1，b-c)。通过挑取与6S-2接触的MR5菌株进行PI染色和扫描电镜观察，在450-490nm光照下，菌丝显示红色荧光(图1，p)，表明菌丝结构已损坏，而对照菌丝显示绿色荧光(图1，m)，表明菌丝完好无损；扫描电镜结果显示，当MR5和6S-2对峙培养时，6S-2菌株的菌丝开始沿着MR5的菌丝生长，随后两者的菌丝逐渐交叉缠绕(图1，g-h)，后6S-2的菌丝在MR5菌丝上产生孢子，大量6S-2孢子寄生在MR5的菌丝上(图1，j-k)，形成穿孔，使MR5菌丝破裂，释放内容物，最后皱缩(图1，i-l)。

为了进一步确定菌株的内生性，用6S-2菌株的孢子悬液(3×10

3.菌株的鉴定：

(1)形态学鉴定：

将分离获得的6S-2菌株分别在PDA培养基，CMD培养基和SNA培养基上28℃培养5-7天，观察菌丝的形态，采用普通显微镜观察结合扫描电镜观察的方式对菌株的特异性分生孢子梗的结构和分生孢子进行观察。后将6S-2菌株分别接种在具有不同功能的培养基上，通过观察功能培养基特异性变化测定其相关功能。

在PDA固体培养基上生长时，初期菌丝为白色的羊毛状，向边缘扩散，菌落背面无色；中期逐渐变成浅绿色，发育较早的菌丝上开始形成孢子环，逐渐由黄色转变为绿色，气生菌丝更为茂盛，变厚，呈现棉絮状；后期菌落会形成3个白绿相间的同心轮纹，圆环上附着有浓密的分生孢子，菌株整体呈现深绿色，且越接近中心的部位颜色越深，缺少气生菌丝，5天即可长满平板(图2，a)。在查彼得培养基上生长时，初期平板上会形成黄色的疱状突起结构，后期逐渐成熟变绿，最终形成黄绿相间的圆环，有利于孢子的产生与繁殖(图2，b)。在CMD培养基和SNA培养基上生长时，菌丝纤细稀薄，菌落透明，呈现辐射状，3天左右即可覆盖整个培养基，分生孢子呈簇垫状，最终形成暗绿色的疱状圆环，在CMD培养基上疱状更加聚合，紧凑，而在SNA培养基中，疱状结构比较分散，呈现半环状或者片状(图2，c-d)。光学显微镜和扫描电镜观察表明：6S-2菌丝细长有隔，主枝呈树枝状，细长，分生孢子梗分枝形成次生枝，主轴顶端下面生出的初生分枝常呈对生，与主轴的夹角为近90°，随着离顶端距离的增加，初次分枝的长度也增加，每对分枝的长度几乎相等，在接近主轴位置形成的二次分枝最长，二次分枝能够产生第三次分枝，而第三次分枝则不再进一步分枝。分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，瓶梗产生于初次、二次和三次分枝的顶端，瓶梗较短，在瓶梗尖端会急剧收缩变细，弯曲，中间膨大，呈现安瓿瓶形，顶端3个或4个一组轮生，呈旋涡状排列，发育成熟后，会在瓶梗尖端产生分生孢子。分生孢子为绿色的球形或者卵圆形，聚集或者分散排列，壁上有细密的小刺，且会有厚垣孢子产生(图2，e-m)。

(2)ITS和Tef1-α片段的扩增、序列分析及系统发育分析：

利用真菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio Cat#D2300)提取6S-2菌株的DNA，然后通过引物对ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)扩增ITS的片段，扩增流程如下：94℃预变性1min，94℃变性1min，50℃退火1min，74℃延伸90s，30个循环，最后74℃延伸7min；并通过引物对tef1fw(5’-GTGAGCGTGGTATCACCCATCG-3’)和tef1rev(5’-GCCATCCTTGGAGACCAGC-3’)扩增tef1片段，扩增流程如下：94℃预变性1min，94℃变性1min，59℃退火1min，74℃延伸50s，30个循环，最后74℃延伸7min。引物合成及扩增片段测序均由上海生工有限公司完成。测序结果通过国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸数据库进行BLAST比对，用MEGA7软件，采用邻接法N-J聚类分析对分离的拮抗菌进行序列分析并构建系统发育树，自展值(bootstrap value)1000次重复检验，后将发育进化树通过iTOL进行美化。菌株6S-2的ITS序列长度为265bp(序列如SEQ ID NO.1所示，GenBank登录号MZ841617)，其Tef1-α序列长度为262bp(序列如SEQ ID NO.2所示，GenBank登录号JQ040445)。经NCBI Blast进行同源性比对并用MEGA 7.0建立系统发育树，结果如图3所示。图中可以看出，6S-2的序列与棘孢木霉SZMC:24288(GenBank ITS登录号MN516477.1,Tef1-α登录号N520032.1)的序列聚在一起，结合形态学分析的结果，表明6S-2菌株是棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。

基于上述对6S-2菌株的形态学及功能分析和ITS，Tef1-α序列同源性分析结果，将分离得到的6S-2菌株鉴定为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：棘孢木霉

拉丁名：Trichoderma asperellum

菌株编号：6S-2

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年10月09日

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.23275。

实施例2：棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S-2的功能鉴定

1.产拮抗酶：

采用接种菌饼的方式，将6S-2菌株分别接种到NBRIP培养基、解淀粉酶培养基、CAS培养基、漆酶培养基、纤维素酶培养基和蛋白酶培养基上，结果显示6S-2菌株在NBRIP培养基上的磷酸盐环直径(D)与菌落直径(d)之比为0.67，说明6S-2菌株具有降解不溶性磷酸盐和释放可溶性磷酸盐的能力(图2，n)；6S-2具有很强的淀粉酶和蛋白酶活性，在降解细胞壁的脂质和蛋白质成分方面发挥作用，从而增强其生长竞争力(图2，o，s)；6S-2菌株还展示出纤维素降解能力(图2，r)；PDA平板培养7d后，用CAS培养基覆盖菌落培养2h，覆盖培养基颜色由蓝色变为橙色，表明6S-2可产生羟基型铁载体(图2，p)；并在含有愈创木酚的PDA培养基上展示出红色的变化，表明其具有漆酶活性(图2，q)。此外，通过将6S-2菌株接种到含有1g/L色氨酸的PDB液体培养基中，25±0.1℃培养7d。用Whatman滤纸过滤，1mL滤液与2mLSalkowski试剂在试管中混合，室温孵育20min，颜色变为粉红色，表明有IAA产生(图2，u)；而将菌株接种于含有4％蛋白胨肉汤的液体培养基中，28±0.1℃下培养6～7d，加入1mLNesler试剂后颜色变为黄棕色，表明6S-2菌株在生长过程中有氨气产生(图2，t)。

2.广谱抑菌效果：

采用平板对峙法评估6S-2的广谱抑菌效果。用直径5mm打孔器在病原菌边缘打取菌块，接种到距离PDA平板中央1cm的位置，在距离病原菌菌块2cm处的延长线上接种6S-2菌块，以只在PDA培养基中心接种病原菌为对照，7天后待对照长满板后用游标卡尺采用十字交叉法测量真菌菌落直径，以直径表示抑菌率的大小。重复上述操作3次。

抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％

对峙试验结果表明，6S-2菌株对12种病原菌菌丝的生长有极强的拮抗抑制作用，抑制率为31.48％～75.37％(图4，m)；并产生不同宽度的拮抗透明圈，一些有害菌株的菌丝上显示寄生6S-2菌株的孢子，菌株边缘呈淡黄色(图4，a-l2)。

实施例3：液体发酵萃取液抑菌试验

1.6S-2发酵萃取液的制备：

将保存在试管斜面中的6S-2在PDA平板上活化后重新接种到新的PDA培养中培养7天，直至产生孢子，后用无菌水冲洗，制成10

2.牛津杯试验

在培养皿底部倒入一层2％水琼脂培养基，在距边缘1cm处放置两个牛津杯，然后按照1％的比例将MR5的孢子液(10

3.玻璃纸培养抗真菌试验

将无菌玻璃纸薄膜铺在含有PDA培养基的平板上，对照组在平板中央接种空白琼脂块，处理组则接种活化两代后的6S-2菌株，培养7d后，除去玻璃纸及菌株后分别在PDA培养基上接种活化两代的MR5菌株。当对照组MR5菌丝覆盖整个平板时，测量处理组菌丝的半径，并在普通光学显微镜下和电镜下观察处理组菌丝的形态。

结果表明，当对照组MR5接种7天后，菌丝生长旺盛且致密(图5，c)，而处理组中MR5菌丝水平生长几乎为零(图5，d)，大多呈现稀疏、零星的状态且垂直生长明显，表明6S-2菌株的某些代谢物抑制了MR5菌丝的生长。随后利用乳酚棉蓝染色后，利用显微镜观察发现，对照组MR5菌株菌丝光滑，且无缠绕断裂的情况，孢子呈现镰刀状，多而饱满，均匀整齐地排列在菌丝上(图5，k-l)；而对照组MR5菌丝粗细不均，部分菌丝弯曲甚至断裂，多个菌丝杂乱缠结，孢子较小、稀疏、皱缩，分布不均(图5，m-n)。扫描电镜结果显示对照组MR5菌丝光滑，分隔明显，粗细均匀，无断裂破损，卷曲变形，内容物没有溢出(图5，o)。而处理组MR5菌丝皱缩，孢子萎缩，尖端变钝，镰刀型孢子变形，尖端的生长点肿胀，分叉明显(图5，p)，部分菌丝受损菌丝表现为肿大、萎缩、弯曲、折叠、排列不均(图5，q)，菌丝表面逐渐变成网状，多个菌丝变形、扭曲、缠结，菌丝表面出现孔洞，严重损坏的菌丝有内容物流出(图5，r-w)。

3.不同浓度液体发酵提取物的抗真菌实验

将6S-2菌株的发酵萃取液母液(10mg/L)分别与冷却至50℃的PDA培养基按不同比例混合，稀释至50mg/L、100mg/L、150mg/L和200mg/L，以添加相同体积的甲醇为对照，并以不添加任何溶液的PDA培养基作为空白对照，培养基凝固后，将第二代活化的MR5菌块置于培养基中央，当空白对照培养基中的MR5菌丝覆盖整个培养皿后，测量不同处理的菌丝生长半径，并计算抑制率。结果显示添加6S-2发酵萃取液后，在不同程度上抑制了MR5菌丝的生长(图5，e-h)，且随着提取物浓度的增加，菌丝生长被抑制程度增加。

4.孢子萌发试验

为了进一步探究6S-2发酵萃取液的抑菌机理，将30μL含有10

实施例4：6S-2菌株挥发性物质抑菌试验

采用双层板对扣和二分板培养的方法检测6S-2挥发性物质的抑菌效果。首先，分别在培养皿底和培养皿盖上倒入PDA培养基，待培养基凝固后在皿底接种MR5菌饼，在皿盖上接种6S-2菌饼，作为处理组；对照组用空白琼脂块替代，二者对扣后用液体石蜡封板防止挥发性气体扩散，并用封口膜密封，28℃孵育5d，观察并拍照。结果显示，与6S-2菌株共培养的MR5菌丝的生长受到明显抑制(图6，a)，为了进一步确定是挥发性物质的作用，用无菌手术刀将培养皿盖上的培养基分成两份，去除左侧培养基后铺满活性炭，仅在右侧接种6S-2菌株，皿底接种MR5，液体石蜡封口后用封口膜包裹，28℃培养5d，观察并拍照，此时MR5菌丝的生长加速并且与对照没有显著差异(图6，b-c)，进一步明确了6S-2菌株产生的挥发性物质具有抑菌效果，故挑取被抑制的MR5菌丝在光学显微镜和扫描电子显微镜下观察。对照组中，MR5菌丝排列均匀，光滑且无明显扭曲缠绕，孢子呈镰刀形，分布均匀，大而饱满(图6，e-f)，而处理组中MR5菌丝体粗细不均，有明显的扭曲、断裂和缠绕的现象，孢子小且皱缩(图6，g-h)。扫描电镜观察显示对照组MR5菌丝光滑饱满，排列均匀，未破损，孢子尖端圆润而饱满(图6，i-j)，而处理组菌丝粗细不均匀，扭曲缠绕在一起，排列杂乱无章；呈现萎缩、扭曲和变形的状态；菌丝尖端受损，部分表皮脱落；孢子尖端皱缩，分叉明显，断裂脱落；伤害严重的菌丝菌丝断裂，内容物流出(图6，k-n)。

实施例5：6S-2菌株发酵萃取液和挥发性物质对拟南芥潜在的促生作用

1.液体发酵提取物促生长实验

为了快速检测6S-2发酵萃取液是否具有促进生长的潜力。选取拟南芥作为模式植物，将其种子完全消毒(先在4℃冰箱中放置3d，再用无菌水冲洗2次，去除漂浮的种子，放入75％酒精中3min，无菌水冲洗3次，后放入40％次氯酸钠1min，最后用无菌水冲洗5次)，后将种子播种在含有不同浓度的6S-2菌株发酵萃取液中(10、50、100、150和200mg/L)的1/2MS培养基上，以添加等量甲醇为对照，并以不加任何物质为空白对照。每个培养基中以直线点播五粒种子，将平板在无菌工作台上吹干并置于23℃光照培养箱中，16h/8h培养9d后，用尺子测量拟南芥幼苗的根长和侧根长，用电子天平称其鲜重，统计侧根数。结果显示，与空白对照相比，向1/2MS培养基中加入不同浓度的甲醇(10-200mg/L)后，拟南芥主根的长度与甲醇的浓度成负相关，但侧根的数量和长度没有显著变化(图7，g1-k1)。与添加甲醇相比，添加6S-2发酵萃取液后在不同程度上改变了拟南芥根长，且拟南芥根长、侧根数和侧根长度在50mg/L时最高(图7，g2-k2，l-q)。随着6S-2发酵萃取液浓度从50mg/L增加到200mg/L时，根长逐渐降低，但侧根数和侧根长度有不同程度的增加。在10-100mg/L的范围内，添加6S-2发酵萃取液可以增加拟南芥的鲜重，但200mg/L时，根系生长明显受到抑制，全株呈黄白色，叶片变厚变硬(图7，k2)。

2.挥发性物质促生长实验

采用二分板检测6S-2菌株的挥发性物质是否具有促进拟南芥生长的潜力。将1/2MS培养基倒在二分板的左侧，PDA培养基倒在右侧。将3颗灭菌的拟南芥种子置于1/2MS培养基上，右侧均匀涂抹6S-2孢子液(10

实施例6：盆栽试验

1.试验设计：

盆栽试验于2021年3-9月在山东农业大学南校区国家苹果工程实验中心及苹果重茬与微生物实验室进行，盆栽试验供试植株为M9T337组培苗和平邑甜茶(Malushupeheusis Rehd.)实生苗。试验土壤取自中国山东省泰安市岱岳区满庄35年树龄的苹果园，土壤质地为棕色壤土。土壤中含有3.22mg·kg

将保存在试管斜面中的6S-2在PDA平板上活化后重新接种到新的PDA培养中培养7天，直至产生孢子，后用无菌水冲洗，制成10

2021年4月首先进行温室试验：将过筛拌匀的连作苹果园土壤装入50个7.0cm

获得温室试验结果后，2021年5月进行室外盆栽试验：将平邑甜茶种子于4℃层积30d左右，种子露白后播种于装有育苗基质的培养钵中进行育苗。待幼苗长至6片真叶时选取长势一致、无病虫害植株，于5月1日移栽至150cm

2.6S-2孢子液对M9T337幼苗氧化损伤的降低作用

硝基蓝四唑(NBT)染色：NBT组织化学染色法可以快速直观地观察组织中活性氧的积累情况，定性观察植物组织的氧化损伤程度。将硝基蓝四唑(200mg)粉末加入到PBS(100ml)中，在37℃下孵育30min并短暂涡旋以溶解，然后将10片不同处理的M9T337幼苗的功能叶和根浸泡在NBT(0.2％)染色液中，37℃水浴2h。最后用80℃的80％酒精水溶液对叶子进行脱色，用水冲洗，拍照观察。结果显示，施用6S-2孢子液后，M9T337幼苗的生长得到了改善(图8，b)，叶片边缘蓝色染料的覆盖面积减弱(图8，b1)，染色程度降低(图8，b2)。根中NBT染色也得到了同样的结果(图8，b3)，初步表明6S-2孢子液的施用可以降低M9T337组织中O

DAB(3,3'-二氨基联苯胺)染色：DAB化学染色法可以方便直观地观察组织中过氧化氢的积累情况，快速检测组织细胞中过氧化物酶的活性位点。使用DAB显色试剂盒(20×，DA1010，Solarbio)对不同处理的M9T337组织幼苗功能叶和根进行染色：分别取A液5ml和B液5ml，用90ml PBS稀释至100ml，避光保存将叶和根浸入其中，在37℃的水中浸泡1小时。最后用80％的酒精在80℃的水中对叶子进行脱色，用水冲洗，并拍照观察。结果显示，对照处理中，DAB染色后大量过氧化物集中在叶缘和根系(图8，a4-a6)，而施加6S-2孢子液后，叶片和根系的氧化损伤程度降低(图8，b4-b6)。

3.6S-2孢子液对平邑甜茶幼苗的促进生长作用

平邑甜茶幼苗生物量的测定：分别用米尺和游标卡尺测量平邑甜茶幼苗的株高和茎粗，用电子天平测量干鲜重。使用Scan Maker i800 plus扫描仪获取根系扫描的图像，并用植物图像分析仪获取根系的相关参数。结果表明，施用6S-2孢子悬液可促进平邑甜茶幼苗的生长(图8，e-f，g-n)，与对照呈显著差异。

平邑甜茶幼苗的光合特性：植物的光合能力与植物生长密切相关，光合作用的高低直接影响作物的产量和品质。2021年7月25日上午10点使用CIRAS-3便携式光合仪器(PPSystem，UK)测量了平邑甜茶幼苗的细胞间CO

平邑甜茶幼苗根系保护酶活性和MDA含量的测定：SOD、POD和CAT活性是植物交叉保护机制的核心，MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，可以间接衡量膜脂过氧化程度和植物抗逆性。将平邑甜茶幼苗的新鲜白根冲洗干净后迅速在液氮中冷冻以确定根系保护酶的活性，参考Sun等人的方法测定超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，过氧化氢酶(CAT)活性和MDA含量。结果表明施用6S-2孢子悬液可以促进根系保护酶活性(图8，s-u)，减少MDA(图8，v)的积累。

4.6S-2孢子液对连作土壤中微生物群落结构的影响

取10g新鲜土壤(4℃保存不超过24h)，采用稀释平板法对土壤中可培养的细菌、真菌和放线菌的数量进行统计，并计算细菌与真菌的比值。细菌在37℃的环境下，在LB培养基上培养24h计数，真菌在28℃的环境下，在PDA培养基上培养48h计数，放线菌在改良高氏1号培养基上培养5d计数。随后，取过筛的新鲜土壤0.5g，使用

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一株棘孢木霉6S-2及其在减轻苹果连作障碍中的应用

<130> 2021

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 265

<212> DNA

<213> 6S-2菌株

<400> 1

cttccgtagg tgaacctgcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aacccaatgt 60

gaacgttacc aaactgttgc ctcggcgggg tcacgccccg ggtgcgtcgc agccccggaa 120

ccaggcgccc gccggaggaa ccaaccaaac tctttctgta gtcccctcgc ggacgtattt 180

ctttacagct ctgagcaaaa attcaaaatg aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 240

ttctggcatc gatgaagaac gcagc 265

<210> 2

<211> 262

<212> DNA

<213> 6S-2菌株

<400> 2

tgagcgtggt atcaccatcg acattgccct ctggaagttc gagactccca agtactatgt 60

caccgtcatt ggtatgtttt ggactcttct ctctagctat cgacattcca agtccgccat 120

tctaacatgc tcttcccaca gacgctcccg gtcaccgtga tttcatcaag aacatgatca 180

ctggtacctc ccaggctgac tgcgctatcc tgattatcgc tgccggtact ggtgagttcg 240

aggctggtct ccaaggatgg ca 262

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctgcgttct tcatcgatgc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgagcgtgg tatcacccat cg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccatccttg gagaccagc 19