一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液

摘要

本发明公开了一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液，其特征在于，包括如下步骤：首先制备低共熔溶剂，然后将微量生物检材加入到低共熔溶剂中，在50℃‑60℃温度中孵育，并且震荡10‑20分钟后，取微量低共熔溶剂直接加入PCR扩增体系中，低共熔溶剂的量不超过扩增总体积的30％，检材与离子液体的质量比为1:99‑1:50。本发明利用低共熔溶剂裂解细胞提取DNA方法，低共熔溶剂制备方法具有操作简单、耗时短、成本低、提取效率高的特点，扩宽低共熔溶剂应用领域，以微量或痕量的生物样本的裂解物即能进行PCR检测，一定条件下与磁珠试剂裂解纯化法相当或略优。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液。

背景技术

DNA作为生物体重要的遗传信息物质，其检测和分析已广泛应用于各个领域，尤以应用最为广泛的聚合酶链式扩增反应(PCR)在临床疾病诊断、食品安全、环境治理、动物疫病，特别是在法庭鉴定中已经成为一种不可或缺的技术手段。

刑事侦查领域的生物样品具有其特殊性，现场采集到的样品经常是微量、甚至是痕量。虽然理论上一个DNA模板就可完成PCR反应，但实际工作中需要一定量的DNA模板数和良好的质量才可完成PCR过程。特别是法庭鉴定过程中经常使用STR分型技术，受DNA模板数和质量的影响较大，如果模板量不足会造成基因座丢失或峰值过低而无法保证鉴定的准确性。目前，PCR进行之前需要对生物样品中的DNA进行提取纯化处理，主要方法包括Chelex-100法、有机法(饱和酚法)、二氧化硅法(硅珠法、磁珠法)、盐析法等，虽然各有优势，但对于微量甚至痕量生物样品中的DNA来说不甚满意，因为这些方法中都需要多步操作，包括裂解、吸附、漂洗、最后洗脱得到较干净的DNA，在这些操作过程中难免丢失一些DNA，最终难以满足PCR的模板要求。因此，近年来裂解液直接PCR扩增技术逐渐受到重视，因为不需要繁杂的操作过程，避免了微量生物样品中DNA的丢失，特别适合于微量或痕量生物样品，尤以接触性样品为佳，例如指纹中的DNA。至今，已有一些专利涉及此技术，例如，中国专利(CN105441421 A)“一种细胞裂解方法”，其主要功能成分为蛋白酶K，主要适合于培养的细胞悬液的裂解。中国专利(CN 102177250 A)“由粗制核酸样品直接扩增的方法”，其使用的细胞裂解成分为氢氧化钠，该方法产生的粗制核酸样品只能适合于该专利中特定的PCR直接缓冲液，该缓冲液中含有一定量的非离子表面活性剂、甘油和牛血清白蛋白(BSA)。而这些化合物在常规市售的PCR缓冲液中并不含有，因此可能影响氢氧化钠裂解后的粗制核酸样品在常规市售PCR缓冲液中的扩增。有鉴于此，迫切需要新的具有良好细胞降解能力和DNA提取能力的溶剂，同时对下游PCR过程无影响。

低共熔溶剂(Deep eutectic solvent，DES)作为一种新型绿色溶剂，由于具有原料来源价廉丰富、合成简单以及产物无需提纯等优点，与其他分离技术相结合被广泛用于蛋白质和核酸的纯化，这类和离子液体有很多相似之处的新型溶剂比离子液体更环保、具有可降解性，因此引起了越来越多人的关注。一种低共熔溶剂可以简单地通过Lewis酸和碱混合、或者氢键供体(hydrogen bond donor)和氢键受体(hydrogen bond acceptor)的混合而制备。最重要的是该溶剂的性质是可以根据需要可调的。制备得到的低共熔溶剂熔点低于其组成化合物，在室温条件下以液态存在，即使组成化合物在室温时是固态。咪唑是一种五元芳杂环化合物，其分子结构中含有两个间位氮原子。咪唑具有酸性，也具有碱性，在pH<6的环境中，其3位的N原子质子化，使得咪唑环带有正电荷，当在pH>6的条件下又去质子化，形成不带电的咪唑环，可以利用其与DNA的结合能力作为DNA的输送载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液，其特征在于，包括如下步骤：

首先制备低共熔溶剂，然后将微量生物检材加入到低共熔溶剂中，在50℃-60℃温度中孵育，并且震荡10-20分钟后，取微量低共熔溶剂直接加入PCR扩增体系中，低共熔溶剂的量不超过扩增总体积的30％，检材与离子液体的质量比为1:99-1:50。

作为本发明再进一步的方案：所述低共熔溶剂由咪唑和烷基化羧酸以及水组成，该低共熔溶剂中的咪唑以带正电荷的状态存在，而烷基化羧酸具有溶解细胞膜脂质的特性，释放出的DNA可以特异性地与咪唑结合。将该混合物加入PCR体系后，由于PCR的反应缓冲液pH值通常为8-9，在该体系中咪唑发生去质子化，导致其与DNA的静电相互作用消失，DNA与咪唑脱离，并进行PCR反应。

作为本发明再进一步的方案：咪唑与烷基化羧酸的摩尔比1：2-2:1，在密闭条件下，温度60-80℃下强力搅拌，溶液变成澄清透明为止，再向该体系中加入不超过总体积20％的水，混合均匀即可。

作为本发明再进一步的方案：微量生物检材与低共熔溶剂的质量比优选1:90，加入PCR体系中的低共熔溶剂的体积优选为占PCR体积的20％。

作为本发明再进一步的方案：咪唑与烷基化羧酸的摩尔比优选1:2到1:1，水加入量优选10％。该低共熔溶剂的熔点低，粘度小。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用低共熔溶剂裂解细胞提取DNA方法，低共熔溶剂制备方法具有操作简单、耗时短、成本低、提取效率高的特点，扩宽低共熔溶剂应用领域，以微量或痕量的生物样本的裂解物即能进行PCR检测，一定条件下与磁珠试剂裂解纯化法相当或略优。

附图说明

图1为咪唑/己酸低共熔溶剂裂解的500倍稀释的血液STR图谱；

图2为磁珠提取试剂对500倍稀释血液提取后的STR图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1～2，本发明实施例中，一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液。

实施例1：

制备低共熔溶剂：首先准确称取咪唑6.8克，然后加入装有23.2克己酸的烧杯中，然后利用磁力搅拌器，在温度为80℃条件下搅拌至澄清透明的液体形成，再向该混合液中加入3.5毫升去离子水，搅拌10分钟后，备用。

将人的血液用生理盐水稀释500倍，取该稀释液1微升滴在载玻片上，自然风干，用棉签或植绒拭子擦拭该血斑，将擦拭后的棉签局部剪下，装入2.0毫升的离心管中，加入100微升咪唑/己酸低共熔溶剂，完全浸没该样品，然后在温度为50℃条件下加热孵育震荡20分钟，吸取裂解液2微升，直接加入STR-PCR体系中进行扩增，扩增总体积10微升。同时将该稀释血液1微升用于DNA磁珠试剂裂解纯化，经裂解、吸附、漂洗、洗脱步骤后取2微升洗脱液用于STR-PCR体系中进行扩增，扩增总体积10微升。

经分别对两种裂解方法的50个样品的分析发现使用磁珠试剂裂解纯化法的STR分型图谱中检测出12个以上基因座33例，均达到16个基因座，可进行有效个体识别的检出率为68％。50例使用咪唑/己酸低共熔溶剂进行STR分型检测检出12个以上基因座32例，均达到16个基因座，可进行有效个体识别的检出率为64％，样品图谱峰值均在200-1000RFU范围内。

实施例2：

制备低共熔溶剂：首先准确称取咪唑13.6克，然后加入装有28.8克辛酸的烧杯中，在磁力搅拌器上60℃搅拌至澄清透明的液体形成，再向该体系中加入9.0毫升去离子水，搅拌10分钟后，备用。

将人的血液用生理盐水稀释500倍，取该稀释液1微升滴在载玻片上，自然风干，用透明胶带粘取该血斑，将粘取后的胶带局部剪下，装入2.0毫升的离心管中，加入100微升咪唑/辛酸低共熔溶剂，完全浸没该样品，然后温度为60℃条件下加热孵育震荡10分钟，吸取裂解液3微升，直接加入STR-PCR体系中进行扩增，扩增总体积10微升。同时取该稀释血液1微升用于DNA磁珠试剂裂解纯化，经裂解、吸附、漂洗、洗脱步骤后取3微升洗脱液用于STR-PCR体系中进行扩增，扩增总体积10微升。

经分别对两种裂解方法的50个样品的分析发现使用磁珠试剂裂解纯化法的STR分型图谱中检测出12个以上基因座35例，均达到16个基因座，可进行有效个体识别的检出率为80％。50例使用咪唑/辛酸低共熔溶剂进行STR分型检测检出12个以上基因座38例，均达到16个基因座，可进行有效个体识别的检出率为76％，样品图谱峰值均在400-1600RFU范围内。

实施例3：

制备低共熔溶剂：首先准确称取咪唑136克，然后加入装有88克丁酸的烧杯中，在磁力搅拌器上70℃搅拌至澄清透明的液体形成，再向该体系中加入30毫升去离子水，搅拌10分钟后，备用。

将人的血液用生理盐水稀释500倍，取该稀释液1微升滴在载玻片上，自然风干，用透明胶带粘取该血斑，将粘取后的胶带局部剪下，装入2.0毫升的离心管中，加入100微升咪唑/丁酸低共熔溶剂，完全浸没该样品，然后在温度55℃条件下加热孵育震荡15分钟，吸取裂解液1微升，直接加入STR-PCR体系中进行扩增，扩增总体积10微升。同时取该稀释血液1微升用于DNA磁珠试剂裂解纯化，经裂解、吸附、漂洗、洗脱步骤后取1微升洗脱液用于STR-PCR体系中进行扩增，扩增总体积10微升。

经分别对两种裂解方法的50个样品的分析发现使用磁珠试剂裂解纯化法的STR分型图谱中检测出12个以上基因座32例，均达到16个基因座，可进行有效个体识别的检出率为63％。50例使用咪唑/丁酸低共熔溶剂进行STR分型检测检出12个以上基因座32例，均达到16个基因座，可进行有效个体识别的检出率为64％，样品图谱峰值均在200-800RFU范围内。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下。由语句“包括一个......限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素”。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。