一种用于特异性检测胃癌LncRNA-GACAT2的引物、探针及装置

摘要

本发明公开了一种用于特异性检测胃癌LncRNA‑GACAT2的引物、探针及装置，属于生物检测领域，所述引物序列为：上游引物：5’‑CCGGAATTCCCCCTCCGTGGAGAAAAGAT‑3’；下游引物：5’‑CCCAAGCTTCGGGCAGTGGCGTCTTAGT‑3’；所述探针序列为：5’‑6FAM‑CCGGATTAAGCACCC‑MGB‑3’；所述检测装置包括含有上述引物和探针的PCR扩增平台；定量结果显示，在待测样本中对LncRNA‑GACAT2的检测限低至92.823拷贝/μl，检测灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于特异性检测胃癌LncRNA-GACAT2的引物、探针及装置。

背景技术

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率居我国恶性肿瘤第2位。我国胃癌发病率和死亡率分别占全球胃癌的44.1%和44.9%。由于胃癌起病隐匿，患者常常无自觉症状，早期诊断、治疗的手段有限，现有的胃癌肿瘤标志物的灵敏度和特异性均比较低，使得胃癌死亡率难以得到有效控制。因此，寻找理想的的肿瘤标志物在胃癌的临床早期筛查中将具有重要的社会意义。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA分子，根据其在基因组中的位置可以分为基因间lncRNA、内含子lncRNA、反义lncRNA、增强子lncRNA和双向lncRNA等类型。近年来的研究表明，lncRNA在人体的正常发育及疾病的发展过程当中，扮演着重要的作用，尤其在肿瘤细胞的发生发展过程中发挥着关键调控作用。长链非编码RNA-GACAT2全称为长链非编码RNA-胃癌相关转录本2(Gastriccancer associated transcripts 2, GACAT2)。前期多项研究表示，lncRNA-GACAT2在胃癌组织中高表达，其在Genebank数据库中的基因ID为100287082(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100287082)。

目前研究初步表明， lncRNA-GACAT2在胃癌的发生发展过程中起重要调控作用。但是，当前对于检测基因表达使用的方法多数是基于SYBR染料的实时荧光定量PCR方法，该方法存在非特异性扩增及不能确切定量的情况，其用于对lncRNA-GACAT2检测时也存在上述情况。

因此，提高lncRNA-GACAT2在胃癌中的检测灵敏性和检测特异性，具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种能够对胃癌组织中lncRNA-GACAT2的表达进行高效率、高特异性和高灵敏度检测的引物。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种用于特异性检测胃癌LncRNA-GACAT2的引物，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-CCGGAATTCCCCCTCCGTGGAGAAAAGAT-3’；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCGGGCAGTGGCGTCTTAGT-3’。

本发明的目的之二，在于提供一种用于特异性检测胃癌LncRNA-GACAT2的探针，所述探针的核苷酸序列为：5’-6FAM-CCGGATTAAGCACCC-MGB-3’。

本发明的目的之三，在于提供一种用于特异性检测胃癌LncRNA-GACAT2的检测装置，采用的技术方案为：一种用于特异性检测胃癌LncRNA-GACAT2的检测装置，包括：

LncRNA-GACAT2基因序列，该序列取自于NCBI所属的Genebank数据库，其基因ID为100287082(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100287082)；

LncRNA-GACAT2的检测引物：

上游引物：5’-CCGGAATTCCCCCTCCGTGGAGAAAAGAT-3’；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCGGGCAGTGGCGTCTTAGT-3’

LncRNA-GACAT2的检测探针：

5’-6FAM-CCGGATTAAGCACCC-MGB-3’；

PCR检测平台，用于对LncRNA-GACAT2基因序列进行PCR定量检测，从而得到LncRNA-GACAT2的含量。

为了提高LncRNA-GACAT2基因检测的灵敏度和特异性，本发明提供了用于检测人胃癌LncRNA-GACAT2基因的引物、探针及其检测装置。本检测方法灵敏度高，在体外实验中约93个拷贝便能稳定地检出。通过本发明设计的引物、探针及方法，解决了在低丰度的样本中不能检出的问题，可以灵敏地检测出LncRNA-GACAT2的表达水平。

本发明设计并选择最优的检测LncRNA-GACAT2的引物为：

上游引物：5’-CCGGAATTCCCCCTCCGTGGAGAAAAGAT-3’；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCGGGCAGTGGCGTCTTAGT-3’；

所述LncRNA-GACAT2设计的探针为：5’-6FAM-CCGGATTAAGCACCC-MGB-3’；

本发明所设计的Taqman-MGB探针，相比较于传统的Taqman探针来说，使用的探针只需要13-25bp即可，同时GC含量，Tm值也更容易控制。因此，探针设计的成功率更高。

更进一步地，所述PCR检测平台中，将LncRNA-GACAT2基因序列作为扩增模板，将扩增模板、引物、探针以及PCR Master Mix进行混合，以进行定量PCR扩增后得到PCR扩增产物。

更进一步地，所述PCR检测平台还连接有电泳仪和电泳槽，将所述PCR扩增产物放置在电泳槽中，在100V恒定的电压下，PCR扩增产物由负极向正极进行泳动，根据LncRNA-GACAT2分子量大小不同分离得到目的扩增片段。

重组质粒构建系统，将PCR扩增LncRNA-GACAT2后的目的片段，进行双酶切，并进行载体连接，从而得到重组质粒，平行设置阴性对照质粒。

更进一步地，所述重组质粒构建系统包括载体连接系统，所述载体连接系统中有pUC57载体；载体连接系统将目的扩增片段经过EcoRI、HindⅢ双酶切后，与所述pUC57载体进行连接，从而获得重组质粒，平行设置阴性对照质粒。

更进一步地，所述载体连接系统将目的扩增片段与pUC57载体进行连接时，加入2μl的目的扩增片段、5μl的2×Buffer溶液、1μl的pUC57载体、1μl的T4 DNA连接酶、1μl的无菌水进行混匀，混匀后室温放置一小时，4℃连接过夜，从而获得重组质粒。

更进一步地，所述重组质粒构建系统还包括转化系统，所述转化系统用于将1μl重组质粒放入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，再加入500μl的LB培养液经过振荡、离心后，均匀涂布在Amp+筛选平板上，设置未转化菌作为阴性对照质粒。

更进一步地，所述鉴定体系包括酶切鉴定体系、测序鉴定体系，所述酶切鉴定体系用于接入重组质粒和阴性对照质粒，并将重组质粒和阴性对照质粒酶切后进行电泳，根据分子量大小进行鉴定；所述测序鉴定体系将电泳后目标条带进行核酸测序，根据核酸序列进行鉴定。

更进一步地，所述鉴定体系还包括质量及浓度计算体系，所述质量及浓度计算体系对鉴定后的重组质粒测吸光度值计算出重组质粒的浓度，并且计算出重组质粒的原始拷贝数：

原始拷贝数=（重组质粒浓度×重组质粒体积/重组质粒相对分子质量）×6.02×10

更进一步地，所述PCR检测平台用于通过荧光定量对重组质粒进行检测，以实现对LncRNA-GACAT2的定量检测；在本方法中，对LncRNA-GACAT2的表达量最低检测限为92.823copies/μl。

所述PCR检测平台的扩增体系为：10μl的PCR Master Mix、1μl的上游引物、1μl的下游引物、1μl的探针、2μl的扩增模板、5μl的蒸馏水后，进行PCR扩增反应。

本发明通过自定义的检测装置模拟胃癌组织中lncRNA-GACAT2的表达，得到结果：

灵敏度高，采用该引物、探针和荧光定量PCR检测方式可检测到lncRNA-GACAT2的含量低至92.823拷贝/μl，说明其灵敏度高。

与现有技术相比，本发明的方法的有益效果是：本方法利用Taqman探针结合筛选的特异性引物对可以实现对样本中目的基因的高特异性扩增，可以很好地解决现有技术的非特异性的问题，相对于SYBR染料法特异性更高；本检测方法灵敏度高，在体外实验中检测限低至92.823拷贝/μl；

附图说明

图1为GACAT2质粒标准曲线；

图2为本发明的检测装置示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本发明通过下述技术方案实现，如图2所示，胃癌特异性LncRNA-GACAT2的检测装置，包括LncRNA-GACAT2序列、PCR检测平台、重组质粒构建系统、筛选系统及鉴定系统，其中：

LncRNA-GACAT2基因序列，该序列取自于NCBI所属的Genebank数据库；其在Genebank数据库中的基因ID为100287082(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100287082)；

所述PCR检测平台用于对LncRNA-GACAT2基因序列进行PCR扩增，从而得到目的扩增片段。

更详细的，所述PCR检测平台在对LncRNA-GACAT2基因序列进行PCR扩增之前，加入预先设计引物、探针，所设计的引物为：

上游引物：5’-CCGGAATTCCCCCTCCGTGGAGAAAAGAT-3’；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCGGGCAGTGGCGTCTTAGT-3’；

所设计的探针为：

探针：5’-6FAM-CCGGATTAAGCACCC-MGB-3’；

PCR检测平台连接有电泳仪和电泳槽，将所述PCR扩增片段放置在电泳槽中，在100V恒定的电压下，PCR扩增产物由负极向正极进行泳动，根据扩增片段自身分子量大小不同从而分离得到目的扩增片段。

所述重组质粒构建体系用于将目的扩增片段进行载体连接，得到重组质粒，并且设置阴性对照质粒。详细来说，所述重组质粒构建体系包括载体连接系统、转化系统与筛选系统：

所述载体连接系统中有pUC57载体；载体连接系统将目的扩增片段经过EcoR I,Hind Ⅲ双酶切后，与所述pUC57载体进行连接，从而获得重组质粒。载体连接系统将目的扩增片段与pUC57载体进行连接时，载入2μl的目的扩增片段、5μl的2×Buffer溶液、1μl的pUC57载体、1μl的T4 DNA连接酶、1μl的无菌水进行混匀，混匀后放置1小时，4度连接过夜，从而获得重组质粒。

所述转化系统用于将1μl重组质粒放入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30min，42℃休克90s，随即冰浴2min后，再加入500μl的LB培养液经过220r/min振荡1h，1200r/min离心5min后，弃上清后剩余约100μl菌液，将剩余菌液均匀涂布在Amp+筛选平板上，设置未转化菌作为阴性对照质粒。

所述鉴定系统包括酶切鉴定体系、测序鉴定体系，所述酶切鉴定体系用于接入重组质粒和阴性对照质粒，并将重组质粒和阴性对照质粒酶切后进行电泳，根据分子量大小进行鉴定。所述测序鉴定体系将电泳后目标条带回收进行核酸测序，根据核酸序列进行鉴定。

详细来说，所述鉴定系统还包括质量及浓度计算体系，所述质量及浓度计算体系对鉴定后的重组质粒进行吸光度值检测后，根据浓度采用下列公式计算出重组质粒的原始拷贝数：

原始拷贝数=（重组质粒浓度×重组质粒体积/重组质粒相对分子质量）×6.02×10

所述PCR检测平台还用于接入鉴定好的重组质粒后，将重组质粒稀释为10

通过对不同浓度的重组质粒进行扩增，用扩增结果做标准曲线，得到结果如图1所示。得到回归方程：

所述荧光定量PCR检测平台设计的引物、探针为：

上游引物：5’-CCGGAATTCCCCCTCCGTGGAGAAAAGAT-3’；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCGGGCAGTGGCGTCTTAGT-3’；

探针：5’-6FAM-CCGGATTAAGCACCC-MGB-3’；

本发明使用PCR检测平台对重组质粒进行扩增，以实现对LncRNA-GACAT2的定量检测；本方法对样本中LncRNA-GACAT2可检出的最低含量为92.823拷贝/μl。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式。但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。