涉及用于特异性检测MAGE－A3标记的引物和探针的用于检测和诊断癌症的方法

摘要

本发明涉及用于新的诊断试剂盒和方法中的MAGE－A3特异性引物和探针。本发明还涉及遭受表达MAGE－A3的肿瘤的特定癌症患者群体的免疫治疗处理。

说明书

发明领域

本发明涉及用于检测MAGE-A3的诊断方法。本发明还涉及遭受表 达MAGE-A3的肿瘤的患者群体的免疫治疗处理，其中具有表达 MAGE-A3的肿瘤组织的患者已经使用本文所述的诊断方法鉴别出来。

背景

由于源自癌症患者的血液淋巴细胞的溶细胞性淋巴细胞的识别，最 初鉴别出MAGE(黑素瘤抗原)基因家族(Van der Bruggen等人1991)。 MAGE基因家族现在包含超过20个成员，且由MAGE-A、B、C和D 基因组成(Scanlan等人，(2002)Immunol Rev.188：22-32；Chomez等 人，(2001)Cancer Res.61(14)：5544-51)。它们簇集在染色体X上(Lucas 等人，1998Cancer Res.58：743-752；Lucas等人，1999Cancer Res 59： 4100-4103；Lucas等人，2000Int J Cancer 87：55-60；Lurquin等人，1997 Genomics 46：397-408；Muscatelli等人，1995 Proc Natl Acad Sci USA 92： 4987-4991；Pold等人，1999Genomics 59：161-167；Rogner等人1995 Genomics 29：725-731)，并具有尚不明确的功能(Ohman等人2001 Exp Cell Res.265(2)：185-94)。MAGE基因是高度同源的，且尤其MAGE-A 家族的成员具有60-98％同源性。MAGE基因不在所有的正常细胞中表 达，例外是在精原细胞和胎盘中表达(Haas等人1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 18：47-51；Takahashi等人1995Cancer Res 55： 3478-382)。

癌症中MAGE基因表达的再激活是由于启动子的异常去甲基化 (De Smeet等人1996 Proc Natl Acad Sci USA 93(14)：7149-53；De Smeet 等人1999 Mol Cell Biol.19(11)：7327-35)。12个MAGE-A基因在下述 癌症中易变地超表达：移行细胞癌、食道癌、黑素瘤、膀胱和非小细胞 肺癌(NSCLC)(Scanlan等人2002Immunol Rev.188：22-32)。癌性组织 中MAGE表达的超表达和特异性已经导致MAGE-A3蛋白被用作癌症疫 苗的抗原(Scanlan等人2002Immunol Rev.188：22-32)。但是，由于在 癌症患者中发现的广范围表达，必须精确估计每位患者中的MAGE-A3 表达水平，以指导给表达该蛋白的患者的接种疫苗。MAGE-A3经常互 换地称作MAGE-3；二者都在本文中使用。

黑素瘤

呈现出远端转移中的恶性黑素瘤的患者(根据美国癌症联合委员会 (American Joint Committee on Cancer)(AJCC)分类，是IV期)具有1年 的中值生存时间，仅5％的长期生存率。甚至IV期黑素瘤的标准化疗也 具有仅8-25％的治疗应答率，但是对总生存没有作用。具有局部转移(III 期)的患者具有2-3年的中值生存，长期生存的机会非常低，甚至在原发 和局部转移的充分外科手术控制之后(Balch等人，1992Semin Surg Oncol.8(6)：400-14)。大多数具有I至III期黑素瘤的患者经外科手术去 除他们的肿瘤，但是这些患者仍然维持复发的相当大危险。因而，仍然 需要预防黑素瘤进展，和具有转移性黑素瘤的改良治疗方案和已经去除 原发肿瘤的患者的辅助治疗。

肺癌

存在2种类型的肺癌：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。 这些名称简单地描述了在肿瘤中发现的细胞的类型。NSCLC包括鳞状 细胞癌、腺癌和大细胞癌，且占肺癌的约80％。NSCLC难以治愈，且 可利用的治疗倾向于具有尽可能长地延长生命和减轻疾病症状的目的。 NSCLC是最常见的肺癌类型，且与差的结果有关。在所有NSCLC患者 中，约25％在诊断时具有局部疾病，且仍然顺从外科手术切除(根据AJCC 分类，IB、IIA或IIB期)。但是，这些患者中超过50％将在彻底外科手 术切除后2年内复发。因此需要为这些患者提供更好的治疗。

MAGE-A3表达

以前已经尝试许多方法来测量细胞系和肿瘤样品内MAGE-A3基 因的表达。已经使用了半定量RT-PCR(De Plaen等人1994 Immunogenetics 40(5)：360-9)、其它基于PCR的技术和低密度微阵列 (Zammatteo等人2002 Clinical Chemistry 48(1)25-34)。但是，在许多这 样的研究中，主要问题是MAGE家族成员之间的非常高的同源性，其造 成假阳性。对于大的II和III期试验而言，需要能特异性鉴别表达 MAGE-A3的样品和降低样品错误测试为阳性的可能性的定量高通量测 定。

另一个困难源自福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织的使 用，这是临床中心通常的肿瘤组织保藏方法。在福尔马林中固定改变组 织内RNA的分子结构，从而造成交联和部分降解。部分降解导致100-300 碱基对的更小的RNA碎片的产生。RNA的这些结构变化使得难以在常 规诊断技术中使用从FFPE组织提取的RNA。

附图简述

图1：MAGE-A家族成员内MAGE-A3RT-PCR TaqMan引物的特异 性。

图2：MAGE-A3表达的小沟结合(MGB)探针TaqMan RT-PCR的特 异性。

图3：在MAGE-A3和MAGE-6质粒存在下，MAGE-A3引物的特 异性试验。

图4：通过定量TaqMan PCR测量的MAGE-A3的肿瘤表达。

图5：MAGE-A3表达的测试。

图6a：为FFPE组织使用设计的MAGE-A3引物的特异性。

图6b：差别量的RNA的引物的试验线性。

图7：RNA later冷冻测定和FFPE组织PCR之间的对比。

图8：RNA later冷冻和基于FFPE的MAGE-A3测定的相对对比。

图9：编码脂蛋白D片段、Mage3片段和组氨酸尾的融合蛋白的核 苷酸序列和其各个氨基酸序列(SEQ ID NO：35和36)。

图10：NS1-MAGE3和组氨酸尾的融合蛋白(SEQ ID NO：37)。

图11：编码融合蛋白NS1-MAGE3-His的DNA(SEQ ID NO：38)。

图12：CLYTA-MAGE3-组氨酸的融合蛋白(SEQ ID NO：39)。

图13：融合蛋白CLYTA-MAGE3-His的DNA(SEQ ID NO：40)。

图14：用于设计RT-PCR引物和MAGE-A3探针的MAGE-A基因 家族序列的比对。

图15：MAGE-A3和MAGE-A6序列的比对，以鉴别含有靶序列的 区域(加框的打字机字体)。

图16：半定量MAGE-A3RT-PCR的分类：5个类型如何分配给半 定量MAGE-A3RT-PCR测定的实例。

图17：使用20、2、0.2、0.02pg的DNA，来自MAGE-A质粒的 Ct值的图形对比。

图18：使用20、2、0.2、0.02pg的DNA，其它MAGE-A质粒相对 于MAGE-A3的ΔCt值的图形对比。

图19：FFPE异种移植物GERL RNA的线性——从100至0.1ng RNA 输入的2倍系列稀释物。

图20：显示了RNA输入的log(底2)对MAGE-A3和β-肌动蛋白之 间的ΔCt的图。

表和序列的描述

表1：用于半定量MAGE RT-PCR的寡核苷酸引物。

表2：用于TaqMan定量RT-PCR的寡核苷酸引物。

表3：MAGE-A3半定量PCR和定量TaqMan PCR的对比。

表4：使用PCR混合物1和PCR混合物2的Ct和ΔCt值的对比。

表5：用于来自冷冻组织的MGB TaqMan定量RT-PCR的寡核苷 酸引物。

表6：半定量MAGE-A3 RT-PCR的分类：5个类型如何分配给半 定量MAGE-A3 RT-PCR测定的实例(参考图16)。

表7：COBAS^TM TaqMan MAGE-A3引物和探针序列。

表8：COBAS^TM TaqManβ-肌动蛋白引物和探针序列。

表9：COBAS^TM TaqMan样品&对照有效CT范围。

表10：COBAS^TM TaqMan热循环概况-MAGE-A3排他性实验的 PCR热概况

表11：线性和RT-PCR效率、分析灵敏度(检测限度)、方法关联、 和再现性实验的RT-PCR热概况

表12：使用20、2、0.2、0.02pg DNA的MAGE-A质粒的Ct值

表13：使用20、2、0.2、0.02pg DNA的其它MAGE-A质粒相对 于MAGE-A3的ΔCt值

表14：MAGE-A3排他性实验验证

表15和表16：MAGE-A3排他性实验细节

表17：来自在11个水平的10个复制品的线性MAGE-A3和β-肌 动蛋白Ct和ΔCt

表18：MAGE-A3和β-肌动蛋白的RT-PCR扩增效率

表19：线性/RT-PCR效率实验验证

表20、21和22：线性/RT-PCR效率实验细节

表23：MAGE-A3Ct命中率，每种条件N＝24

表24：MAGE-A3Ct命中率百分比，每种条件N＝24

表25：β-肌动蛋白Ct命中率，每种条件N＝24

表26：β-肌动蛋白Ct命中率百分比，每种条件N＝24

表27：MAGE基因FAM对照Cts

表28：β-肌动蛋白HEX对照Cts

表29；表30；和表31：检测限度实验细节

表32：样品的交叉验证总结

表33：通过比较器百分比一致测得的COBAS和原型试验阳性和阴 性

表34：通过比较器百分比一致测得的COBAS和原型试验阳性和阴 性，用冷冻试验解析不一致的结果

表35：实验对照MAGE基因Cts

表36：实验对照β-肌动蛋白基因Cts

表37、38和39：方法关联/交叉验证实验细节

表40：运行1—来自GERL RNA对照的MAGE-A3表达阈

表41：运行1—再现性样品的MAGE-A3表达调用(call)

表42：运行2—来自GERL RNA对照的MAGE-A3表达阈

表43：运行2—再现性样品的MAGE-A3表达调用

表44：再现性验证

表45、46和47：再现性实验细节

SEQ ID NO：1-MAGE3-E2F(用于半定量MAGE3测定的引物) (表1)

SEQ ID NO：2-MAGE3-E3R(用于半定量MAGE3测定的引物)(表 1)

SEQ ID NO：3-E3MAGE3TMF(外显子3MAGE-A3的正向引物) (表2)

SEQ ID NO：4-E3MAGE3TMR(外显子3MAGE-A3的反向引物； 该引物是它识别的MAGE-A3外显子序列的反向互补体)(表2)

SEQ ID NO：5-I3MAGE3TMF(内含子3MAGE-A3的正向引物) (表2)

SEQ ID NO：6-I3MAGE3TMR(内含子3MAGE-A3的反向引物； 该引物是它识别的MAGE-A3内含子序列的反向互补体)(表2)

SEQ ID NO：7-MAGEA3-775F(MAGE-A3的正向引物)(表5)

SEQ ID NO：8-MAGEA3-849R(MAGE-A3的反向引物；该引物 是它识别的MAGE-A3序列的反向互补体)(表5)

SEQ ID NO：9-MAGEA3e-950F(MAGE-A3的正向引物)(表5)

SEQ ID NO：10-MAGEA3e-1037R(MAGE-A3的反向引物；该引 物是它识别的MAGE-A3序列的反向互补体)(表5)

SEQ ID NO：11-MAGEA3f-623F(MAGE-A3的正向引物)(表5)

SEQ ID NO：12-MAGEA3f-697R(MAGE-A3的反向引物；该引 物是它识别的MAGE-A3序列的反向互补体)(表5)

SEQ ID NO：13-E3MAGE3TMP(外显子3MAGE3的探针)(表2)

SEQ ID NO：14-I3MAGE-A3TMP(内含子3MAGE3的探针)(表 2)

SEQ ID NO：15-MAGEA3-801Tmc(MAGE3的探针)(表5)

SEQ ID NO：16-MAGEA3e-1000Tmc(MAGE3的探针)(表5)

SEQ ID NO：17-MAGEA3f-651Tm(MAGE3的探针)(表5)

SEQ ID NO：18-B-肌动蛋白-E4F(B-肌动蛋白引物)(表1)

SEQ ID NO：19-B-肌动蛋白-E6R(B-肌动蛋白引物)(表1)

SEQ ID NO：20-B-肌动蛋白-TMF(B-肌动蛋白引物)(表2)

SEQ ID NO：21-B-肌动蛋白-TMR(B-肌动蛋白引物)(表2)

SEQ ID NO：22-B-肌动蛋白TMP(B-肌动蛋白探针)(表2)

SEQ ID NO：23-SEQ ID NO：29：MAGE3免疫肽

SEQ ID NO：30-SEQ ID NO：34：辅助寡核苷酸

SEQ ID NO：35-脂蛋白D片段-MAGE3片段-组氨酸尾的融合 蛋白的核苷酸序列(图9)

SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：35的氨基酸序列(图9)

SEQ ID NO：37-NS1-MAGE3-组氨酸尾的融合蛋白的氨基酸序 列(图10)

SEQ ID NO：38-编码SEQ ID NO：37的核苷酸序列(图11)

SEQ ID NO：39-CLYTA-MAGE3-组氨酸融合蛋白的氨基酸序列 (图12)

SEQ ID NO：40-编码CLYTA-MAGE3-组氨酸融合蛋白的核苷酸 序列(图13)

SEQ ID NO：41-MAGE1片段(图14)

SEQ ID NO：42-MAGE2片段(图14)

SEQ ID NO：43-MAGE4a片段(图14)

SEQ ID NO：44-MAGE7片段(图14)

SEQ ID NO：45-MAGE8片段(图14)

SEQ ID NO：46-MAGE10片段(图14)

SEQ ID NO：47-MAGE11片段(图14)

SEQ ID NO：48-MAGE12片段(图14)

SEQ ID NO：49-MAGE-A6片段(图14)

SEQ ID NO：50-MAGE-A3片段(图14)

SEQ ID NO：51-MAGE-A3片段(图15)

SEQ ID NO：52-MAGE-A6片段(图15)

SEQ ID NO：53-MAGE-A3合成探针序列MAGEA3F-646MOD(表 7)

SEQ ID NO：54-具有未修饰的核苷酸的MAGEA3F-646MOD探 针序列

SEQ ID NO：55-β-肌动蛋白引物序列RGI BACT F2(表8)

SEQ ID NO：56-β-肌动蛋白引物序列RGI BACT R2(表8)

SEQ ID NO：57-β-肌动蛋白探针序列HW RGIBACT H(表8)

发明概述

发明人已经开发了测定来鉴别具有表达MAGE-A3的肿瘤组织、因 此会从MAGE-A3特异性免疫疗法获益的患者。

在本发明的一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO.3-12中任一 个的核苷酸序列的引物。在另一个实施方案中，提供了包含一个或多个 下述引物对的引物集合：

a)SEQ ID NO：3和4；

b)SEQ ID NO：5和6；

c)SEQ ID NO：7和8；

d)SEQ ID NO：9和10；和

e)SEQ ID NO：11和12。

在本发明的另一个方面，提供了包含SEQ ID NO：13至17、53或 54中的任一个核苷酸序列的探针。

在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含：

(i)正向引物；

(ii)反向引物；和

(iii)探针，

其中组分(i)、(ii)和(iii)能在严格条件下与MAGE-A3的靶序列杂交， 且其中(i)、(ii)或(iii)的至少一个靶序列与所有其它MAGE-A核苷酸序列 的等价区域相比相差至少一个核苷酸，且其中该集合能用于区别 MAGE-A3和MAGE-A6。

另外，提供了试剂盒，其包含：

(i)正向引物；

(ii)反向引物；和

(iii)探针，

其中组分(i)、(ii)和(iii)能在严格条件下与MAGE-A3的靶序列杂交， 且其中(i)、(ii)或(iii)的至少一个靶序列与MAGE-A6核苷酸序列的等价 区域相比相差至少一个核苷酸，且其中该集合能用于区别MAGE-A3和 MAGE-A6。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒可以包含下述组分：(i)本文 所述的至少一个引物或引物集合；和(iii)本文所述的至少一个探针。在 一个实例中，组分(i)包含SEQ ID NO：3和4；且组分(ii)包含SEQ ID NO： 13；或者，组分(i)包含SEQ ID NO：5和6；且组分(ii)包含SEQ ID NO： 14；或组分(i)包含SEQ ID NO：7和8；且组分(ii)包含SEQ ID NO：15； 或组分(i)包含SEQ ID NO：9和10；且组分(ii)包含SEQ ID NO：16；或 组分(i)包含SEQ ID NO：11和12；且组分(ii)包含SEQ ID NO：17；或 组分(i)包含SEQ ID NO：11和12；且组分(ii)包含SEQ ID NO：53或 SEQ ID NO：54。

在本发明的另一个实施方案中，提供了测定MAGE-A3阳性的肿瘤 组织的存在或不存在的方法，其包含使从生物样品得到或衍生的分离的 核苷酸序列接触本文所述的至少一个引物、本文所述的引物集合、本文 所述的探针或本文所述的试剂盒的步骤。

本发明的另一个方面是测定MAGE-A3阳性的肿瘤组织的存在或不 存在的方法，其通过用本文所述的引物、探针或引物集合测定生物样品 实现。

在另一个方面，提供了患者诊断的方法，其包含下述步骤：使从生 物样品得到或衍生的分离的核苷酸序列接触本文所述的至少一个引物、 本文所述的引物集合、本文所述的探针或本文所述的试剂盒，和评价 MAGE-A3是否在样品中表达。

该方法还可以包含下述步骤：扩增核苷酸序列，和检测样品中扩增 的核苷酸序列。

在另一个方面，提供了测定MAGE-A3阳性的肿瘤组织存在或不存 在的方法，其包含使从生物样品得到或衍生的分离的核苷酸序列接触本 文所述的至少一个引物或探针。该方法还可以包含下述步骤：测定分离 的核苷酸序列是否在严格条件下与至少一个引物或探针杂交，从而检测 肿瘤组织是否是MAGE-A3阳性的。在一个实施方案中，该方法还可以 包含下述步骤：使用原位杂交来检测该核苷酸序列是否杂交至少一个引 物或探针。

本文所述的方法可以用于作为冷冻组织的生物样品上；可替代地或 另外地，本文所述的方法可以在作为石蜡保藏的组织的生物样品上进 行，例如福尔马林固定的、石蜡包埋的组织(FFPE)。

本发明还提供了治疗患者的方法，其包含：使用本文所述的方法测 定患者的肿瘤组织是否表达MAGE-A3，然后给患者施用包含本文所述 MAGE-A3免疫疗法或免疫治疗剂的组合物。

在另一个实施方案中，提供了治疗易复发表达MAGE-A3的肿瘤的 患者的方法，该患者已经经过治疗来去除/治疗表达MAGE-A3的肿瘤组 织，该方法包含：使用本文所述的方法测定患者的肿瘤组织是否表达 MAGE-A3，然后给患者施用包含本文所述MAGE-A3免疫疗法或免疫治 疗剂的组合物。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含MAGE-A3免疫疗法或 免疫治疗剂的组合物在生产用于治疗遭受表达MAGE-A3的肿瘤的患者 的药物中的用途，其中使用本文所述的方法将患者鉴定为具有表达 MAGE-A3的肿瘤组织。

在另一个实施方案中，提供了包含MAGE-A3免疫疗法或免疫治疗 剂的组合物在生产用于治疗易复发表达MAGE-A3的肿瘤的患者的药物 中的用途，其中使用本文所述的方法将患者鉴定为具有表达MAGE-A3 的肿瘤组织。

在一个实施方案中，提供了本文所述的治疗方法或用途，其中所述 包含MAGE-A3免疫疗法或免疫治疗剂的组合物包含MAGE-A3抗原或 其肽。在一个实施方案中，所述MAGE-A3抗原或其肽包含肽 EVDPIGHLY或由其组成。

用于本发明中的MAGE-A3抗原或肽可以融合或缀合至载体蛋白。 在一个实施方案中，所述载体蛋白可以选自蛋白D、NS1或CLytA或其 片段。

在本发明的一个实施方案中，所述包含MAGE-A3免疫疗法或免疫 治疗剂的组合物还可以包含佐剂。例如，佐剂可以包含下述的一种或多 种或其组合：3D-MPL；铝盐；含有CpG的寡核苷酸；含有皂苷的佐剂 例如QS21或ISCOMs；水包油乳剂；和脂质体。在一个实施方案中， 佐剂可以包含3D-MPL、含有CpG的寡核苷酸和QS21。

详述

本文使用的术语‘靶序列’是探针或引物的序列与其具有部分的(即 具有一定程度的错配)或完全的同一性的MAGE-A3核酸序列区域(DNA 或RNA，例如基因组DNA、信使RNA或其扩增形式)；尽管反向引物 是它识别的序列的反向互补体(或如上所述，具有一定程度的错配)。靶 序列通常是指与另一个或所有其它MAGE-A核苷酸序列相比相差至少 一个核苷酸的MAGE-A3序列区域。但是，在本发明的有些实施方案中， 就一种或多种引物和探针而言，所述靶序列可以在MAGE-A核苷酸序 列之间是相同的，前提是，至少一个或2个要使用的引物和探针识别在 要鉴别的基因之间存在差异的靶序列。

因此，在一个实施方案中，特异性的引物或探针没有错配地结合靶 MAGE-A3序列，并具有一个或多个碱基对错配地结合另一个MAGE-A 序列(例如MAGE-6序列)的等价区域。

本发明的引物或探针的靶序列可以是具有2个基因之间的最大差异 (错配)的序列，以使得能够以非常高的特异性进行MAGE-A3检测。

在本发明的一个实施方案中，所述靶序列是在图15中加框文字鉴 定出的区域中。

合适地，引物或探针可以在引物或探针长度上与靶序列具有至少 95％同一性，合适地在其长度上与靶MAGE-A3序列具有超过95％的同 一性，例如96％、97％、98％、99％同一性，最优选具有100％同一性。 本发明的引物或探针可以在引物或探针的所有核苷酸位置与靶序列具 有同一性，或可以具有1、2或多个错配，这依赖于例如探针长度、温 度、反应条件和测定要求。当然，前提是，反向引物满足针对作为引物 序列的反向互补体的区域的这些条件。

合适地，引物或探针的每个核苷酸可以与它的配对物靶核苷酸形成 氢键。

优选地，通过A：T和C：G碱基配对程度评估引物或探针与靶序 列的互补性，从而使得腺嘌呤(A)核苷酸与胸腺嘧啶(T)配对，且鸟嘌呤 (G)核苷酸与胞嘧啶(C)配对，或反之亦然。在RNA形式中，T可以被U (尿嘧啶)替代。

例如，当在通用探针中使用肌苷时，也可以通过肌苷(探针)-靶核苷 酸相互作用的程度评估互补性。

因此，本发明提供了包含SEQ ID NO.1-12中任一个的核苷酸序列 的引物，如表1和2所示。术语“引物”在本文中用于指在例如PCR技术 中能用作引物的任意单链寡核苷酸序列。因而，根据本发明的‘引物’是 指能作为引物延伸产物的合成起始点的单链寡核苷酸序列，所述引物延 伸产物与要拷贝的核酸链基本上相同(对于正向引物)或基本上是反向互 补体(对于反向引物)。引物的设计(长度和特定序列)取决于DNA和/或 RNA靶的性质和使用引物的条件(例如温度和离子强度)。

引物可以由SEQ ID NO：1-12所示的核苷酸序列组成，或可以是包 含SEQ ID NO：1-12的序列或落入SEQ ID NO：1-12的序列内的10、 15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多个碱基对，前提是 它们适合在严格条件下特异性地结合MAGE-A3核苷酸序列内的靶序 列。当需要时，可以对探针引物的长度或序列略作修饰，以维持在给定 情况下所需的特异性和灵敏度。可以将本文列出的探针和/或引物的长度 延伸或缩短1、2、3、4或5个核苷酸，例如，在任一个方向。

本文使用的术语“严格条件”是指允许引物特异性结合MAGE-A3 核苷酸序列内的核苷酸序列，但是不结合任何其它MAGE核苷酸序列 的任意杂交条件。探针与MAGE-A3核苷酸序列区域的“特异性结合”或 “特异性杂交”是指，引物或探针在使用的实验条件下与该区域的部分或 与整个区域形成双链体(双链核苷酸序列)，且在那些条件下，引物或探 针不与在要分析的样品中存在的核苷酸序列的其它区域形成双链体。应 当理解，为在MAGE-A3核苷酸序列区域内的特异性杂交设计的本发明 的引物和探针可以完全落入所述区域内，或可以在很大程度上与所述区 域重叠(即与在所述区域之外以及之内的核苷酸形成双链体)。

合适地，探针与核酸靶区域的特异性杂交在“严格的”杂交条件下发 生，例如3X SSC，0.1％ SDS，在50℃。技术人员知道如何改变温度、探 针长度和盐浓度参数，从而实现特异性杂交。杂交和洗涤条件是众所周 知的，且例示于，例如，Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，尤其其中的第 11章。

本发明还提供了包含一个或多个下述引物对的引物集合：

 

集合1：SEQ ID NO：3和4集合2：SEQ ID NO：5和6集合3：SEQ ID NO：7和8集合4：SEQ ID NO：9和10集合5：SEQ ID NO：11和12

本发明还提供了包含SEQ ID NO：13-17、53或54中的任一个核苷 酸序列的探针。术语“探针”在本文中用于指能结合核酸并在例如PCR技 术中用作探针的任意单链寡核苷酸序列：所述探针可以由SEQ ID NO： 13-17、53或54所示的核苷酸序列组成，或可以是包含SEQ ID NO： 13-17、53或54的序列或落入其中的5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19或20、25、30、35、40、45、50、75、100或 更多个碱基对，前提是它们适合特异性结合在MAGE-A3核苷酸序列内 的靶序列。

在本发明的一个实施方案中，其中探针与一对引物相组合地用于方 法中，该对引物应当允许扩增MAGE-A3多核苷酸片段的部分或全部， 探针能与其结合或其探针固定化在固体支持物上。

引物和/或探针可以额外包含能使探针被检出的标记。可以使用的标 记的实例包括：荧光标记，例如，6-羧基荧光素(6FAM^TM)、NED^TM(Applera Corporation)、HEX^TM或VIC^TM(Applied Biosystems)； TAMRA^TM标记(Applied Biosystems，CA，USA)；化学发光标记，例如 钌探针；和放射性标记，例如氚化胸苷形式的氚。³²-磷也可以用作放射 性标记。

在本发明的一个实施方案中，探针可以包含在它的5′-末端的荧光报 道染料和在它的3′-末端的猝灭剂染料。荧光报道染料可以包含6-羧基荧 光素(6FAM)，且猝灭剂染料可以包含非荧光猝灭剂(NFQ)。任选地， 可以将小沟结合蛋白(MGBTM；Applied Biosystems，CA，USA)添加到探 针上，例如探针的3’末端。

在一个实施方案中，可以使用MGB^TM Eclipse探针(Epoch Biosciences，WA，USA)。MGB^TM Eclipse探针具有位于探针5′-末端的 Eclipse^TM Dark猝灭剂和MGB^TM部分。荧光报道染料位于探针的3′-末 端。

在一个实施方案中，本发明的引物和探针序列可以含有或包含天然 存在的核苷酸结构或碱基，例如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、 胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。

在另一个实施方案中，在探针序列中可以包含合成的或修饰的核苷 酸结构或碱基类似物。“合成的或修饰的”是指非天然存在的核苷酸结构 或碱基。这种合成的或修饰的碱基可以替代探针序列中的1、2、3、4、 5、6、7、8、9个或全部碱基。在一个实施方案中，胞嘧啶可以被替代 为5-甲基dC，且胸腺嘧啶可以被替代为5-丙炔基dU。在序列中也可 以包含BHQ2猝灭剂。

本发明另外提供了试剂盒，其包含下述组分：(i)本文所述的至少 一个引物或引物集合；和(ii)本文所述的至少一个探针。在一个实施方 案中，所述试剂盒包含一个正向引物、一个反向引物和具有在通过正向 和反向引物扩增的区域内的靶序列的探针序列。在该实施方案中，该引 物集合能扩增MAGE-A3序列的部分(扩增子)，且该探针能在严格条件 下与扩增子杂交。

MAGE-A3和MAGE-A6的序列是高度同源的，它们的核苷酸98％ 序列匹配，且它们的蛋白序列95％序列匹配。为了特异性鉴别MAGE-A3 序列，必须鉴别能区分MAGE-A3和MAGE-A6的引物和探针。

在一个实施方案中，本发明提供了在严格条件下特异性杂交 MAGE-A3的靶序列的引物集合和/或探针，其中所述引物或探针的至少 一个靶序列与所有其它MAGE-A核苷酸序列的等价区域相比相差至少 一个核苷酸，且其中该集合能区分MAGE-A3和MAGE-A6。

在一个实施方案中，本发明提供了在严格条件下特异性杂交 MAGE-A3的靶序列的引物集合和/或探针，其中所述引物或探针的至少 一个靶序列与MAGE-A6核苷酸序列的等价区域相比相差至少一个核 苷酸，且其中该集合能区分MAGE-A3和MAGE-A6。

在一个实施方案中，至少一个引物或探针的靶序列与MAGE-A6的 等价区域相比相差MAGE-A3靶序列中的一个核苷酸。在另一个实施方 案中，至少一个引物或探针的靶序列与MAGE-A6的等价区域相比相差 2个核苷酸。

在一个实施方案中，包含2个引物和一个探针的试剂盒可以在引物 和探针的靶序列中具有下述差异：

(i)2个引物或探针之一的靶序列在MAGE-A3和MAGE-A6之间相 差一个核苷酸；

(ii)在(i)中未提及的引物或探针的靶序列在MAGE-A3和 MAGE-A6之间相差一个核苷酸；及

(iii)对于MAGE-A3和MAGE-A6而言，剩余引物或探针的靶序列 是相同的；

例如，在一个实施方案中，包含引物A、引物B和探针C的试剂 盒可以在靶序列中包含下述差异：

(i)引物A的靶序列在MAGE-A3和MAGE-A6之间相差一个核苷 酸；

(ii)引物B的靶序列在MAGE-A3和MAGE-A6之间相差2个核苷 酸；及

(iii)对于MAGE-A3和MAGE-A6而言，探针C的靶序列是相同的。

例如，在一个实施方案中，包含引物A、引物B和探针C的试剂 盒可以在靶序列中包含下述差异：

(i)引物A的靶序列在MAGE-A3和MAGE-A6之间相差2个核苷 酸；

(ii)对于MAGE-A3和MAGE-A6而言，引物B的靶序列是相同的； 及

(iii)探针C的靶序列在MAGE-A3和MAGE-A6之间相差1个核苷 酸。

例如，在一个实施方案中，包含引物A、引物B和探针C的试剂 盒可以在靶序列中包含下述差异：

(i)对于MAGE-A3和MAGE-A6而言，引物A的靶序列是相同的；

(ii)引物B的靶序列在MAGE-A3和MAGE-A6之间相差1个核苷 酸；及

(iii)探针C的靶序列在MAGE-A3和MAGE-A6之间相差2个核苷 酸。

在一个实施方案中，所述试剂盒可以包含：SEQ ID NO：3和4的 引物对或包含SEQ ID NO：3和4的引物对，和SEQ ID NO：13的探针 或包含SEQ ID NO：13的探针；SEQ ID NO：5和6的引物对或包含SEQ ID NO：5和6的引物对，和SEQ ID NO：14的探针或包含SEQ ID NO： 14的探针；SEQ ID NO：7和8的引物对或包含SEQ ID NO：7和8的 引物对，和SEQ ID NO：15的探针或包含SEQ ID NO：15的探针；SEQ ID NO：9和10的引物对或包含SEQ ID NO：9和10的引物对，和SEQ ID NO：16的探针或包含SEQ ID NO：16的探针；和/或SEQ ID NO： 11和12的引物对或包含SEQ ID NO：11和12的引物对，和SEQ ID NO： 17的探针或包含SEQ ID NO：17的探针。

在本发明的另一个实施方案中，提供了测定MAGE-A3阳性的肿瘤 组织的存在或不存在的方法，其包含使从生物样品得到的或衍生的核苷 酸序列接触本文所述的至少一个引物或至少一个引物集合或探针的步 骤。MAGE-A3阳性的肿瘤组织是指已经从患者分离的表达MAGE-A3 抗原的任意肿瘤或肿瘤细胞。本文所述的方法可以用于测定生物样品是 否包含MAGE-A3阳性的肿瘤组织或由其组成。

生物样品是指来自患者的已经从患者取出或分离的组织或细胞样 品。

另外提供了患者诊断的方法，其包含下述步骤：使从生物样品得到 的或衍生的核苷酸序列接触本文所述的至少一个引物或至少一个引物 集合或探针，并评价MAGE-A3是否在样品中表达。

在一个实施方案中，所述核苷酸序列已经从生物样品分离。

本文使用的术语“从......得到的或衍生的”是指包含地使用。也就是 说，意在包括从肿瘤样品直接分离的任意核苷酸序列或从样品衍生的任 意核苷酸序列，例如通过使用反转录来生成mRNA或cDNA。

本发明的方法还可以包含：扩增核苷酸序列和检测样品中扩增的核 苷酸序列。可替代地或附加地，本发明的方法还可以包含：使分离的或 扩增的核苷酸序列接触本文所述的一个或多个探针。

在一个实施方案中，从肿瘤样品分离或纯化核苷酸序列。在RT-PCR 中，基因组DNA污染可能导致假阳性结果。在一个实施方案中，从要 在本发明的方法中测试或包含的样品去除或基本上去除基因组DNA。

本发明的方法适合于检测MAGE-A3阳性的肿瘤组织。在本发明的 一个实施方案中，MAGE-A3阳性的组织可以使用原位杂交来检测。原 位杂交是指使用根据本发明的引物或探针在从患者分离的完整染色体、 细胞或组织上进行的杂交反应，用于特定DNA或RNA序列的形态学位 点的直接显现。

多核苷酸的杂交可以使用任意合适的杂交方法和检测系统来进行。 杂交系统的实例包括常规的斑点印迹、DNA印迹、和夹心方法。例如， 合适的方法可以包括反向杂交方法，其中将类型-特异性的探针固定化在 固体支持物的已知的独特位置(斑点、线或其它图形)，并标记扩增的多 核酸，以检测杂种形成。可以用生物素标记MAGE-A3特异性的核酸序 列，例如本文所述的探针或引物，且可以通过与非放射性显色系统偶联 的生物素-链霉抗生物素蛋白来检测杂种。但是，也可以采用其它反向杂 交系统，例如，如Gravitt等人(Journal of Clinical Microbiology，1998， 36(10)：3020-3027)所述，其内容也引入作为参考。标准的杂交和洗涤 条件描述在Kleter等人，Journal of Clinical Microbiology，1999，37(8)： 2508-2517，且在给定情况下最优化，以维持探针和引物的长度和序列所 需的特异性和灵敏度。

在一个实施方案中，本发明的方法可以包含下述物质的用途：

a)包含SEQ ID NO：3和4的引物对；和包含SEQ ID NO：13的 探针；

b)包含SEQ ID NO：3和4的引物对；和包含SEQ ID NO：17的 探针

c)包含SEQ ID NO：3和4的引物对；和包含SEQ ID NO：53的 探针

d)包含SEQ ID NO：3和4的引物对；和包含SEQ ID NO：54的 探针

e)包含SEQ ID NO：5和6的引物对和包含SEQ ID NO：14的探 针；

f)包含SEQ ID NO：7和8的引物对和包含SEQ ID NO：15的探针；

g)包含SEQ ID NO：9和10的引物对和包含SEQ ID NO：16的探 针；

h)包含SEQ ID NO：11和12的引物对和包含SEQ ID NO：17的 探针；

i)包含SEQ ID NO：11和12的引物对；和包含SEQ ID NO：53 的探针；和/或

j)包含SEQ ID NO：11和12的引物对；和包含SEQ ID NO：54 的探针。

本文所述的方法适用于新鲜组织、冷冻组织、石蜡保藏的组织和/ 或乙醇保藏的组织。众所周知的提取和纯化方法可以用于从样品分离 RNA或DNA(例如Sambrook等人，1989)。RNA或DNA可以在从样品 提取后直接使用，或更优选地，在多核苷酸扩增步骤(例如PCR)后。在 特定情况下，例如对于反向杂交测定，必须在扩增前将RNA反转录成 cDNA。在后两种情况下，扩增的多核苷酸“源自”样品。

在一个实施方案中，其中样品是石蜡保藏的组织，可以使用下述引 物集合和探针：

a)包含SEQ ID NO：7和8的引物对，和包含SEQ ID NO：15的 探针；

b)包含SEQ ID NO：9和10的引物对，和包含SEQ ID NO：16的 探针；

c)包含SEQ ID NO：11和12的引物对，和包含SEQ ID NO：17 的探针；

d)包含SEQ ID NO：11和12的引物对；和包含SEQ ID NO：53 的探针；和/或

e)包含SEQ ID NO：11和12的引物对；和包含SEQ ID NO：54 的探针。

本发明另外提供了治疗患者的方法，其包含：使用本文所述的方法 测定患者的肿瘤组织是否表达MAGE-A3，和给所述患者施用包含 MAGE-A3抗原、表位或抗原衍生物或MAGE-A3特异性的抗体或免疫 球蛋白的组合物。所述患者可以具有表达MAGE-A3的肿瘤组织(活动性 疾病情况)，或可以易于复发表达MAGE-A3的肿瘤，该患者已经经过治 疗来去除/治疗表达MAGE-A3的肿瘤组织(辅助情况)。

本发明还提供了包含MAGE-A3抗原、表位或抗原衍生物或 MAGE-A3特异性的抗体或免疫球蛋白的组合物在生产药物中的用途， 所述药物用于治疗遭受表达MAGE-A3的肿瘤或易于复发表达 MAGE-A3的肿瘤的患者，其中使用本文所述的诊断方法、试剂盒、引 物或探针将患者鉴别为具有或已经具有表达MAGE-A3的肿瘤组织。

包含MAGE-A3抗原、表位或抗原衍生物的组合物可以包含 MAGE-A3抗原或其肽。在一个实施方案中，所述MAGE-A3抗原或其 肽包含肽EVDPIGHLY或由其组成。MAGE-A3抗原或肽可以融合或缀 合至载体蛋白，后者可以选自蛋白D、NS1或CLytA或其片段。

在一个实施方案中，组合物还可以包含佐剂；例如包含下述一种或 多种或其组合的佐剂：3D-MPL；铝盐；含有CpG的寡核苷酸；含有皂 苷的佐剂例如QS21或ISCOMs；水包油乳剂；和脂质体。

因而，本发明提供了在临床应用中筛选来自人患者的组织样品存在 或不存在MAGE-A3的表达的方法。这种样品可以由例如针吸活组织检 查核心、外科手术切除样品或淋巴结组织组成。例如，这些方法包括得 到活组织检查，后者任选地通过恒冷切片机切片分级分离，以富集肿瘤 细胞至总细胞群体的约80％。在某些实施方案中，使用本领域众所周知 的技术，可以从这些样品提取核酸。在其它实施方案中，使用本领域众 所周知的技术，可以扩增从组织样品提取的核酸。可以检测MAGE-A3 表达水平，且可以与统计学有效组和/或MAGE-A3阴性患者对照相对 比。

在一个实施方案中，诊断方法包含测定受试者是否表达MAGE-A3 基因产物，例如通过检测基因产物的对应的mRNA和/或蛋白水平。例 如通过使诸如RNA印迹分析、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、半定 量RT-PCR、定量RT-PCR、TaqMan PCR、原位杂交、免疫沉淀、蛋白 印迹分析或免疫组织化学的技术。根据这种方法，可以从受试者得到细 胞或组织，并将mRNA和/或蛋白水平与不表达MAGE-A3的组织的相 对比。

TaqManPCR技术

Taq DNA聚合酶具有5′-3′外切核酸酶活性。Taqman PCR测定使用 该外切核酸酶活性来切割在PCR扩增过程中与靶序列退火的双标记的 探针。

简而言之，从样品提取RNA，并合成cDNA(反转录)。然后将cDNA 加入用于Taqman PCR的含有标准PCR组分(参见，例如，由Roche(CA， USA)供应的组分)的PCR反应混合物。所述反应混合物另外含有探针， 其与2个引物之间的模板核苷酸序列(即在PCR反应扩增的序列内，“扩 增子”)退火。探针包含在5′-末端的荧光报道染料和在3′-末端的猝灭剂染 料。猝灭剂能猝灭报道荧光，但是仅在两个染料彼此邻近时：这发生于 完整探针。

在扩增过程中和之后，Taq DNA聚合酶将探针降解，并检测任意荧 光。

对于定量测量，使用荧光达到10乘以基线发射标准差的阈值的PCR 循环数。该循环数称作循环阈(Ct)，它与靶cDNA的起始量成反比，并 允许测量cDNA的量。基本上，样品中存在的靶RNA越多，得到的Ct 数越低。

将得到的Ct值测量值与得到的持家基因测量值相对比。这允许基 于加入每个反转录反应中的总RNA量(基于波长吸光度)和它的质量(即， 降解)的任意误差：它们中的每一个都不是测量原料的可靠参数。因此， 将持家基因的转录物定量为内源对照。β-肌动蛋白是最常用的非特异性 持家基因之一，尽管可以使用其它的。

在本发明的另一个实施方案中，提供了治疗遭受表达MAGE-A3的 肿瘤的患者的方法，该方法包含：通过使用本发明的方法，测定患者是 否表达MAGE-A3蛋白，和随后施用包含MAGE-A3抗原、表位或抗原 衍生物或MAGE-A3特异性的抗体或免疫球蛋白的组合物，以预防或改 善疾病的复发。患者可以首先接受治疗，例如通过外科手术切除任意肿 瘤或其它化疗或放疗治疗。

因而，本发明还提供了MAGE-特异性的免疫疗法在生产药物中的 用途，所述药物用于治疗遭受表达MAGE-A3的肿瘤的患者或已经接受 治疗(外科手术、化疗或放疗)来去除或治疗表达MAGE-A3的肿瘤的患 者，所述患者已经通过使用根据本发明的诊断方法、试剂盒、引物或探 针被确定为具有表达MAGE-A3的肿瘤组织。

因而，本发明可以用于具有表达MAGE-A3的癌症的患者，例如： 黑素瘤；乳腺癌；膀胱癌，包括移行细胞癌；肺癌，包括非小细胞肺癌 (NSCLC)；头和颈癌，包括食道癌；鳞状细胞癌；肝癌；多发性骨髓瘤 和结肠癌。在实施方案中，本发明可以在这种癌症，尤其肺和黑素瘤的 辅助(手术后)情况中用于治疗患者。本发明也可以用于治疗转移癌。

免疫疗法

适用于本发明的治疗患者的方法中的组合物是能提高MAGE-A3特 异性的免疫应答的那些。组合物将含有至少一个来自MAGE-A3基因产 物的表位。这种表位可以作为任选地共价连接到载体上的肽抗原而存 在。或者，可以使用更大的蛋白片段。但是，在合适呈递时，使用的片 段和肽必须能提高抗MAGE-A3的免疫应答，例如MAGE-A3-特异性的 免疫应答。

可以用于本发明中的肽的实例包括下述MAGE-A3肽：

 

SEQ ID NO肽序列SEQ ID NO：23FLWGPRALVSEQ ID NO：24MEVDPIGHLYSEQ ID NO：25VHFLLLKYRASEQ ID NO：26LVHFLLLKYRSEQ ID NO：27LKYRAREPVTSEQ ID NO：28ACYEFLWGPRALVETSSEQ ID NO：29TQHFVQENYLEY

在一个实施方案中，抗原可以包含连接到免疫融合或表达增强子配 偶体上的MAGE肽或蛋白。MAGE蛋白可以是全长MAGE-A3，或可以 包含MAGE3的片段，例如MAGE3的氨基酸3-314(共312个氨基酸)。

抗原和配偶体可以化学缀合，或表达为重组融合蛋白。在实施方案 中，其中所述抗原和配偶体表达为重组融合蛋白，这可以允许在表达系 统中产生比未融合的蛋白升高的水平。因而，融合配偶体可以辅助提供 T辅助细胞表位(免疫融合配偶体)，优选人识别的T辅助细胞表位，和/ 或以比天然重组蛋白更高的得率辅助表达蛋白(表达增强子)。在一个实 施方案中，融合配偶体可以是免疫融合配偶体和表达增强配偶体。

在本发明的一个实施方案中，可以使用的免疫融合配偶体源自蛋白 D，革兰氏阴性细菌B型流感嗜血菌(Haemophilus influenza)的表面蛋 白(WO91/18926)，或其衍生物。蛋白D衍生物可以包含该蛋白的前1/3、 或大致该蛋白的前1/3。在一个实施方案中，蛋白D的前109个残基可 以用作融合配偶体，以提供具有额外外源T细胞表位的MAGE-A3抗原 和增加在大肠杆菌(E.coli)中的表达水平(因而，也起表达增强子的作 用)。在替代实施方案中，蛋白D衍生物可以包含N-末端的前100-110 个氨基酸或大致N-末端的前100-110个氨基酸。在一个实施方案中，可 以脂质化(lipidate)蛋白D或其衍生物，且可以使用脂蛋白D：脂质尾 可以确保抗原向抗原呈递细胞的最佳呈递。

在一个实施方案中，MAGE-A3可以是蛋白D-MAGE-A3/His，432氨 基酸残基融合蛋白。该融合蛋白包含蛋白D的氨基酸1至109，在革兰 氏阴性细菌B型流感嗜血菌表面上存在的脂蛋白，来自MAGE-A3蛋白 的312个氨基酸(氨基酸3-314)，间隔物和在生产过程中可以便利融合蛋 白的纯化的聚组氨酸尾(His)，例如：

i)18残基信号序列和加工的蛋白D的前109个残基，所述信号序列 在生产过程中从融合蛋白切下，以留下前109个残基；

ii)2个无关的残基(甲硫氨酸和天冬氨酸)；

iii)天然MAGE-3蛋白的残基3-314；

iv)起铰链区功能的2个甘氨酸残基；

v)7个组氨酸残基；

在可替代实施方案中，可以使用上面的构建体，只是(i)可以替代为 包含蛋白D的N-末端前100-110个氨基酸或大致N-末端前100-110氨 基酸的序列。

MAGE-3可以表达为具有在N末端的蛋白D和在C末端的7个组 氨酸残基序列(His尾)的融合蛋白。蛋白D是暴露于革兰氏阴性细菌B 型流感嗜血菌表面上的42-kDa免疫球蛋白-D结合蛋白。

在另一个实施方案中，免疫融合配偶体蛋白D可以替代为称作LytA 的蛋白。LytA源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，其合成 N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LytA，(由LytA基因编码(Gene，43 (1986)第265-272页))，即特异性地降解肽聚糖主链中的某些键的自溶 素。LytA蛋白的C-末端结构域负责对胆碱或有些胆碱类似物例如DEAE 的亲和力。已经将该性质用于开发大肠杆菌C-LytA表达质粒，后者可 用于融合蛋白的表达。已经描述了在它的氨基末端含有C-LytA片段的 杂种蛋白的纯化(Biotechnology：10，(1992)第795-798页)。在一个实 施方案中，可以使用分子的C末端部分。该实施方案可以利用从残基 178开始在C末端发现的LytA分子的重复部分。在一个实施方案中， LytA部分可以包含残基188-305。

在本发明的一个实施方案中，MAGE-A3蛋白可以包含衍生化的游 离巯基。这种抗原已经描述在WO99/40188中。具体地，可以使用羧基 酰胺化的或羧甲基化的衍生物。

在本发明的一个实施方案中，肿瘤相关抗原包含MAGE-A3-蛋白D 分子。该分子的核苷酸和氨基酸序列示于图9(SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36)。该抗原和下面概述的那些更详细地描述在WO99/40188。

在本发明的其它实施方案中，肿瘤相关抗原可以包含任一种下述的 融合蛋白：

NS1-MAGE3和组氨酸尾的融合蛋白，例如如图10和11所示(SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38)；CLYTA-MAGE3-组氨酸的融合蛋白， 例如如图12和13所示(SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40)。

本发明的另一个实施方案包含，利用包含核酸分子的核酸免疫治疗 剂，所述核酸分子编码本文所述的MAGE-A3特异性的肿瘤相关抗原。 在本发明的一个实施方案中，所述序列可以插入合适的表达载体中，并 用于DNA/RNA接种疫苗。表达该核酸的微生物载体也可以用作载体化 递送的免疫治疗剂。

合适的病毒载体的实例包括基于反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺 伴随病毒、疱疹病毒包括单纯疱疹病毒、甲病毒、痘病毒例如金丝雀痘 病毒和痘苗病毒的系统。使用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人 员已知的。例如反转录病毒载体可以用于本发明的多核苷酸向宿主基因 组中的稳定整合，尽管这种重组不是优选的。相反，复制缺陷的腺病毒 载体仍然是附加型的，且因此允许瞬时表达。可以使用能驱动在昆虫细 胞(例如杆状病毒载体)、人细胞、酵母或细菌中的表达的载体，以生成 一定量的由本发明的多核苷酸编码的MAGE-A3蛋白，例如用作亚单位 疫苗或用于免疫测定中。

在优选的实施方案中，用作活载体的腺病毒是复制缺陷的猿腺病 毒。通常这些病毒含有E1缺失，且可以在用E1基因转化的细胞系上生 长。优选的猿腺病毒是从黑猩猩分离的病毒。具体地，C68(也称作Pan 9)(参见美国专利号6083716)和Pan5、6和Pan7(WO 03/046124)优选 用于本发明中。因而，可以操纵这些载体，以插入本发明的异源基因， 从而可表达基因产物。在WO 03/046142中详细阐述了这种重组腺病毒 载体的用途、制剂和生产。

在Maniatis等人，Molecular Cloning-A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor，1982-1989中，描述了用于得到核酸序列和生产表达载体 的常规重组技术。

对于基于蛋白的免疫治疗剂，以在液体中可溶的形式或冻干形式提 供本发明的蛋白。

每个人剂量可以包含1至1000μg蛋白。在一个实施方案中，剂量 可以包含30-300μg蛋白。

本文所述的免疫治疗剂还可以包含疫苗佐剂，和/或免疫刺激性的细 胞因子或趋化因子。

用于本发明的合适的疫苗佐剂可商业上得到，例如，弗氏不完全佐 剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia， PA)；铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化的 酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化的糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷 腈(polyphosphazenes)；生物可降解的小球体；单磷酰脂质A和quilA。 细胞因子，例如GM-CSF或白细胞介素-2、-7或-12和趋化因子也可以 用作佐剂。

在本发明的制剂中，可能需要佐剂组合物主要诱导Th1型免疫应 答。高水平的Th1-型细胞因子(例如，IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾 向于有利于针对施用的抗原的细胞介导的免疫应答的诱导。根据其中应 答主要是Th1-型的一个实施方案，Th1-型细胞因子的水平将增加至比 Th2-型细胞因子的水平更高的程度。这些细胞因子的水平可以使用标准 测定容易地评定。关于细胞因子家族的综述，参见Mosmann和Coffman， Ann.Rev.Immunol.7：145-173，1989。

因此，可以用于主要引起Th1-型应答的合适的佐剂包括，例如，单 磷酰脂质A例如3-脱-O-酰单磷酰脂质A(3D-MPL)与铝盐的组合。也可 以单独使用3D-MPL或其它toll样受体4(TLR4)配体，例如在 WO9850399、WO0134617和WO03065806中公开的氨烷基氨基葡糖苷 磷酸酯，以主要产生Th1-型应答。

优先诱导TH1型免疫应答的其它已知的佐剂包括TLR9拮抗剂， 例如未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。寡核苷酸的特征在于，CpG二 核苷酸未甲基化。这种寡核苷酸是众所周知的，且描述在例如WO 96/02555中。

合适的寡核苷酸包括：

 

SEQ ID NO：30TCC ATG ACG TTC CTG ACG TTCpG1826SEQ ID NO：31TCT CCC AGC GTG CGC CATCpG1758SEQ ID NO：32ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGSEQ ID NO：33TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTTCpG2006，CpG7909SEQ ID NO：34TCC ATG ACG TTC CTG ATG CTCpG1668

含有CpG的寡核苷酸也可以单独使用，或与其它佐剂组合使用。例 如，增强的系统包含含有CpG的寡核苷酸和皂苷衍生物的组合，尤其是 在WO00/09159和WO00/62800中公开的CpG和QS21的组合。

该制剂可以额外包含水包油乳剂和/或生育酚。

另一种合适的佐剂是皂苷，例如QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)，其可以单独使用，或与其它佐剂组合使用。例 如，增强的系统包含单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，例如在WO 94/00153中描述的QS21和3D-MPL的组合，或在WO96/33739中描述 的更低反应原性的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。其它合适的制剂 包含水包油乳剂和生育酚。在WO95/17210中描述了特别有效的佐剂制 剂，其包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。

在另一个实施方案中，可以在脂质体组合物中配制佐剂。使用的3D MPL的量通常小，但是，依赖于免疫治疗剂制剂，可以在1-1000μg/剂、 优选1-500μg/剂和更优选1-100μg/剂的范围内。

在一个实施方案中，佐剂系统包含3种免疫刺激物：CpG寡核苷酸、 3D-MPL和QS21，它们存在于脂质体制剂或例如在WO95/17210中描 述的水包油乳剂中。

在本发明的佐剂或免疫治疗剂中的CpG或免疫刺激性寡核苷酸的 量通常小，但是，依赖于免疫治疗剂制剂，可以在1-1000μg/剂、优选 1-500μg/剂和更优选1-100μg/剂的范围内。

用于本发明的佐剂中的皂苷的量可以在1-1000μg/剂、优选1-500μg/ 剂、更优选1-250μg/剂和最优选1-100μg/剂的范围内。

通常，每个人剂量可以包含0.1-1000μg抗原，例如0.1-500μg、 0.1-100μg或0.1-50μg。通过包含观察接种疫苗的受试者中的适当免疫 应答的标准研究，可以确定特定免疫治疗剂的最佳量。在初始接种疫苗 后，受试者可以接受一次或几次适当隔开的加强免疫。

其它合适的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，法国)、SAF (Chiron，California，美国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、Ribi Detox、 RC-529(GSK，Hamilton，MT)和其它氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯 (AGPs)。

因此，提供了用于本发明方法中的免疫原性的组合物，其包含本文 公开的抗原和佐剂，其中所述佐剂包含下述的一种或多种：3D-MPL、 QS21、CpG寡核苷酸、聚乙烯醚或酯或这些佐剂中两种或更多种的组 合。免疫原性的组合物内的抗原可以存在于水包油或油包水乳剂载体中 或脂质体制剂中。

在一个实施方案中，佐剂可以包含下述的一种或多种：3D-MPL、 QS21和免疫刺激性CpG寡核苷酸。在实施方案中，所有3种免疫刺激 物都存在。在另一个实施方案中，3D MPL和Qs21存在于水包油乳剂中， 且不存在CpG寡核苷酸。

用于本发明方法中的组合物可以包含药物组合物，后者含有在药学 上可接受的赋形剂中的本文所述的肿瘤相关抗原或融合蛋白。

在本说明书和下面的权利要求书全文中，除非上下文另有要求，词 语“包含”和变体应当理解为暗示包括所述整数或步骤、或所述整数或步 骤的组，但是不排除包括任何其它整数或步骤、或整数或步骤的组。

参考下面的非限制性实施例进一步描述本发明，其中RT-PCR是指 反转录聚合酶链反应：

实施例

实施例1

半定量PCR-冷冻的组织样品

引物：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2

RNA提取：液氮RNA纯化方法

将组织小片骤冻在液氮中，然后置于研钵中，用研杵机械研磨。将 100mg得到的粉末加入100ul TriPure分离试剂中，且根据生产商的说 明书(Qiagen，Venlo，荷兰)提取RNA。从在260nm的光密度值，测定 RNA浓度。

半-定量MAGE-A3 RT-PCR

如De Plaen等人(Immunogenetics 40：360，1994)所述进行半定量 RT-PCR。在42℃，在含有1x第一链缓冲液、0.5mM每种dNTP、10mM 二硫苏糖醇、20U rRNA酶抑制剂、2μM寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))15 和200U M-MLV反转录酶的20μl混合物中从2μg总RNA合成cDNA 1.5小时。在含有对MAGE-A3特异性的引物(SEQ ID NOs1和2)的25μl 混合物中，通过PCR扩增50ng cDNA。在1％琼脂糖凝胶电泳上运行每 个反应的10μl等分试样，且用溴化乙锭荧光显现。当分别扩增mRNA 和基因组DNA(gDNA)时，扩增子的大小是725bp和805bp。

半-定量MAGE-A3RT-PCR的阳性对照：

为这些实验引入3个阳性对照：

(i)将克隆的MAGE-A3基因组DNA的片段加入每种PCR反应混 合物。这产生805bp的片段(比从cDNA产生的片段大80bp)，且总是 在没有PCR抑制时存在。这作为阳性对照，以检查MAGE-A3阴性样品 中的PCR效率；

(ii)对于每个MAGE-A3测定，在肿瘤样品和从“Gerl”黑素瘤细胞 系MZ-2-3.0提取的RNA上平行进行cDNA合成。为了被视作“阳性的”， 肿瘤样品必须在Gerl细胞系MZ-2-3.0cDNA水平的1％产生信号。

(iii)在每个样品上进行β-肌动蛋白PCR(表1)，以检测含有强烈降 解的RNA的样品。如果从MAGE-A3阴性的肿瘤样品产生的β-肌动蛋 白信号比从MZ-2-3.0产生的信号弱，则为临床样品调整循环数目，从而 使得β-肌动蛋白扩增子的强度达到要求的水平。

半-定量MAGE-A3RT-PCR的阴性对照

为这些实验引入3个阴性对照：

(i)从已知MAGE-A3阴性的细胞培养物LB23-1/2提取的RNA；

(ii)在RT-反应中的水对照；和

(iii)在PCR步骤中的水对照。

数据的解释

当725bp的扩增子的量等于或大于使用0.5ng来自Gerl细胞系 MZ-2-3.0RNA的RNA(即等价于0.1％Gerl RNA；参见阳性对照)得到的 扩增子的量时，将50ng来自肿瘤样品的mRNA样品视作MAGE-A3阳 性的。通过溴化乙锭荧光，估计量。加入阳性和阴性对照。

半定量MAGE-A3RT-PCR的分类：将5个标准类别(De Plaen等 人，1994)分配给半定量MAGE-A3RT-PCR测定。它们是主观度量，从 最低到最高表达是-、-/+、+、++、+++。在图16中显示了如何分配的 这些类别的实例：在该图中，根据下面表6所示的阳性对照产生的带， 分配类别：

表6

实施例2：实时Taqman定量RT-PCR-冷冻组织样品

实时Taqman定量RT-PCR：

引物：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；探针：SEQ ID NO：13 (外显子)

引物：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；探针：SEQ ID NO：14 (内含子)

半-定量PCR(用于对比研究)：

引物：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2

材料和方法

患者和样品收集

通过外科手术得到来自IB和II期非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤的活 组织检查。患者已经在2个临床试验中登记，即GSK 249553/004 (MAGE3-AS02B-004)和Epidemio-MAGE3-153；患者已经签署知情同意 书，并被解释了研究的性质和可能的后果。在外科手术切除后，将活组 织检查直接浸入RNA-稳定溶液(RNA-later，Ambion，Cambridge，UK)，且 在-20℃储存。RNAlater是稳定且保护完整的、未冷冻的组织样品中的 细胞RNA的组织储存试剂。RNAlater消除了立即在液氮中冷冻样品的 需要。

RNA提取：混合器磨(Mixer mill)RNA纯化方法

从RNALater取出肿瘤组织，且加入到TriPure分离试剂(Roche， Vilvoorde，比利时)。然后将组织加入含有钨球的混合器磨。在混合器磨 中破裂后，根据生产商的说明书(Qiagen，Venlo，荷兰)，使用TriPure试 剂从最多100mg组织提取总细胞RNA。从260nm的光密度值测定RNA 浓度。

MAGE-A3TaqMan RT-PCR测定-冷冻组织

在含有TaqMan缓冲液、5mM MgCl₂、0.4mM dUTP、0.2mM每种 核苷酸、0.625U Ampli Taq Gold DNA聚合酶、0.05U UNG、0.2μM每 种寡核苷酸引物和0.2μM TaqMan探针的25μl混合物中，通过PCR 扩增与50ng总RNA相对应的cDNA。使用特异性的寡核苷酸引物和探 针(表2；SEQ IDs3、4和13和SEQ IDs5、6和14。探针用染料FAM^TM、 NED^TM和VIC^TM(Applied Biosystems，CA，USA)标记，并具有小沟结合 部分(MGB^TM；也来自Applied Biosystems，CA，USA)。对于MAGE特异 性的探针，现在使用染料FAM替代NED进行其它实验。

在7700或7900系统(PE Applied Biosystems，Warrington，UK)上使 用TaqMan化学法(chemistry)，通过定量PCR扩增MAGE-A3外显子 和β-肌动蛋白基因。也在MAGE-A3基因的内含子中进行PCR扩增，以 检查基因组DNA污染的不存在。扩增概况是，1个在50℃2分钟的循 环，1个在95℃12分钟的循环，和35个在95℃15秒和在60℃1分钟 的循环。在所有延伸步骤过程中，实时检测TaqMan探针降解产生的荧 光信号。

用于测定对MAGE-A3的特异性的TaqMan RT-PCR测定的验证

引物：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；探针：SEQ ID NO：13 (外显子)-Taqman RT-PCR

引物：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(半定量PCR-用于对比研 究)

质粒和细胞系

采用的质粒含有基因MAGE-A1(MAGE-1；Genbank accession NM 004988)、MAGE-A2(MAGE-2；Genbank accession L18920)、 MAGE-A3(MAGE-A3；Genbank accession NM_005362)、MAGE-A4 (MAGE-4；Genbank accession 002362)、MAGE-A6(MAGE-6；Genbank accession NM_005363)、MAGE-A8(MAGE-8；Genbank accession NM_005364)、MAGE-A9(MAGE-9；Genbank accession NM_005365)、 MAGE-A10(MAGE-10；Genbank accession NM_021048)、MAGE-A11 (MAGE-11；Genbank accession NM_005366)和MAGE-A12(MAGE-12； Genbank accession NM_005367)的全长cDNA。细胞系MZ-2-3.0 (MAGE-A3阳性的)和LB23-1/2(MAGE-A3阴性的)是比利时布鲁塞尔 Ludwig研究所(Ludwig institute，Brussels，Belgium)的Thierry Boon教 授的友好赠品。

使用含有MAGE-A1、2、3、4、6、8、9、10、11和12基因的全长 cDNA的质粒的1 x 10⁴、1 x 10⁵和1 x 10⁶拷贝，测试MAGE-A3TaqMan方 法的特异性。

在图14中显示了在设计的MAGE-A3PCR引物和探针区域的 MAGE-A基因(MAGE1、2、3、4、6、8、9、10、11和12)的序列对 比。正向和反向MAGE-A3引物的序列标有下划线；MAGE-A3探针的 序列是加框的。反向引物与它们识别的序列区域互补，即A与T互补； G与C互补；T与A互补；C与G互补。

MAGE-A3 TaqMan RT-PCR阳性对照：(i)MAGE-A3基因组DNA 的片段和(ii)已知量的从Gerl细胞系MZ-2-3.0提取的RNA(MAGE-A3 阳性的黑素瘤细胞系)。

MAGE-A3 TaqMan RT-PCR阴性对照：(i)从已知MAGE-A3阴性 的细胞培养物LB23-1/2提取的RNA，(ii)在RT反应中的水空白，和(iii) PCR步骤中的水空白。进行40个循环的RT-PCR。阴性对照必须≥ 35。有些TaqMan实验的结果已经表示为1/Ct。

统计学：2种PCR技术的对比

使用本文所述的技术，生成2x2列联表，以对比来自半定量 RT-PCR(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物)和实时定量Taqman PCR(引物：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；探针：SEQ ID NO：13) 的结果(表3)。公称值(nominal scale)变量表征2种值：阳性的和阴性 的。阴性值包括零和边界线分等(rating)；边界线分等是指分等在来自 半定量RT-PCR的0.8％至1.2％ Gerl和来自TaqMan测定的低于1％的所 有结果之间。基于与半定量RT-PCR方法的β-肌动蛋白表达有关的凝胶 带可见评分，对阳性值分级，且其包括来自TaqMan测定的≥1％的所有 结果。将2种方法的一致计算为(双阴性样品数+双阳性样品数)/样品 总数。使用McNemar检验来对比不一致对(阴性的-阳性的)的比例。计 算置信区间(CI)。

定量TaqManRT-PCR的最优化

使用Sybr绿的MAGE-A3的TaqManRT-PCR。

Sybr绿是非选择性地结合扩增子的组分，没有序列特异性的探针。 使用MAGE-A克隆的4个不同稀度(20pg、2pg、0.2pg和0.02pg)，在 MAGE-A家族的基因克隆上进行实时RT-PCR(图1，其中结果显示为在 Y-轴上的1/CT)。得到MAGE-A3在14Ct的阳性结果，且得到MAGE-A6 的16Ct值(在20pg质粒)。MAGE-A4、A8和A9显示出30的Ct水 平，其它MAGE基因在35Ct和以上显示出非常有限的表达。

使用序列-特异性探针的MAGE-A3的TaqMan RT-PCR

使用相同的MAGE-A3引物(SEQ ID 3和4)、但是用探针(SEQ ID No 13)，使用MAGE-A家族成员的有关克隆的不同稀度，测试将MAGE-A3 与A6区分开的有效性(图2)。首先，MAGE-A3Ct在每个稀度具有预期 的降低。当使用探针时，MAGE-A6克隆没有表现出高1/Ct，表明没有 交叉反应性。

如图3所示的1 x 10⁶MAGE-A6质粒向MAGE-A3质粒稀释物中的 掺加，不具有任何作用，且结果反映了MAGE-A3质粒滴定结果。这表 明使用TaqMan PCR在有MAGE-A3存在下没有MAGE-A6的竞争作用。

结果

MAGE-A3的肿瘤表达，半定量和定量方法的对比

针对MAGE-A3的标准半定量RT-PCR，进一步验证TaqMan-特异 性的定量PCR(使用引物SEQ ID No1和2)。使用来自NSCLC患者的 71个肿瘤样品，以直接对比MAGE-A3表达的定量(使用引物SEQ ID NO：3和4和探针SEQ ID NO：13)和半定量方法(使用引物SEQ ID NO： 1和2)。

结果表明2种方法之间95.8％的良好一致性(表3)，68/71是一致 的。3个样品的定量TaqMan RT-PCR和半定量RT-PCR测定是不一致的， 其中半定量RT-PCR测定过高估计了结果的阳性。但是，McNemar检验 揭示这3个不一致结果的对称再分配(p＝0.25)，表明任一种技术都不倾 向于生成比另一种技术更不一致的结果。在更近的研究中，这些样品的 β-肌动蛋白表达的变量水平导致半定量RT-PCR方法的假阳性。

使用框图(图4)来表示为半定量RT-PCR定义的每个类别的TaqMan PCR数据的分散。尽管基于2 x 2列联表的2种方法之间的一致性极好， 但框图揭示出不同类别之间的一些重叠，表明半定量分等不与定量 TaqMan RT-PCR测量完全一致。重叠可能是由于在不同场合由不同操作 者进行分等的事实，这可能增加可变性。在那个意义上，定量TaqMan RT-PCR试验更大程度地独立于那些因素，且因此再现性更高。

实施例3：通过RT-PCR分析石蜡固定的组织(FFPE)

材料和方法

使用并入本文作为参考的美国专利US6,613,518；US6,610,488； US6,428,963；US6,248,535公开的Response Genetics Inc.的专利方法， 从FFPE样品提取RNA。或者，根据任意的合适的公开方法，可以从石 蜡固定的组织得到RNA。例如，使用d-柠檬烯或另一种裂解缓冲液，可 以从石蜡取出组织切片，然后在基于乙醇的溶液中洗涤。然后用蛋白酶 K处理切片过夜，再洗涤，且可以使用柱层析纯化RNA。使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4和探针SEQ ID NO：13，为用于冷冻组织 开发的引物和探针，在样品上进行实时Taqman RT-PCR(参见上面实施 例2)。

结果：Mage-A3表达

表4显示了福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织的表达为Ct 值的结果。Y-轴的数字代表人肿瘤样品990118-990784。在分析中也包 含阳性对照：TC1(Mage3)；Gerl(MAGE-A3黑素瘤细胞系)；和CRL1675 (黑素瘤细胞系)。Ct值比基于冷冻组织的半定量RT-PCR MAGE-A3引 物的预期值更高。认为36-37Ct的水平是这些实验目的的灵敏度最上限。 Gerl MAGE-A3阳性对照是在31Ct，且刚好在灵敏度限度内，但是从 半定量RT-PCR测定显著降低。使用这些水平，冷冻组织的MAGE-A3 定量的引物和探针(表2，外显子3MAGE-A3特异性引物SEQ ID NO： 3和SEQ ID NO：4和探针SEQ ID NO：13)的灵敏度可能不足以检测 FFPE-肿瘤样品内的MAGE-A3表达：不能检测到MAGE-A3阳性的、 但是仅在低水平表达MAGE-A3的样品。

在实验中包含来自FFPE组织的阳性对照样品：TC1(Mage3)和Gerl (MAGE-A3阳性对照)和CRL1675。使用来自石蜡组织的RNA，使用冷 冻组织引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4和探针SEQ ID NO：13， 通过Taqman定量RT-PCR分析人肿瘤990118-990784。该分析的结果 如图5所示。

用于FFPE组织的MAGE-A3 TaqMan引物的再设计

基于冷冻组织RNALater的MAGE-A3测定(如实施例2所述)的扩增 子大小是超过100bp。为了得到在FFPE样品中发现的降解的RNA的更 灵敏的结果，设计新引物来减小扩增子大小，以增加MAGE-A3测定的 灵敏度(表5)。对于在实施例2和3中所述的测定，使用MGB^TM(小沟 结合)探针来增加测定的特异性。MGB探针结合进DNA的小沟，形成 非常稳定的双链体，从而导致引物特异性的增加。

测试新MAGE-A3引物的特异性和灵敏度

在Mage-A基因家族成员的cDNA(图6a)上测试新设计的引物集合 (表5)，其中集合1是引物：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，探针： SEQ ID NO：15；集合2是引物：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10，探 针：SEQ ID NO：16；集合3是引物：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO： 12，探针：SEQ ID NO：17；且集合4是引物：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，探针：SEQ ID NO：13。

如图6a所示，就MAGE-A3而言，引物SEQ ID NO：7和8具有 高Ct水平，但是对于Mage-2和Mage-12也是如此。就MAGE-A3而言， 引物SEQ ID NO：9和10具有高Ct水平，且就MAGE-A6而言，具有 微小的Ct，但是这在MAGE-A3表达的正常范围之外。引物SEQ ID NO： 11和12的灵敏度比SEQ ID NO：9和10略低。因而，在本实验中，选 择引物SEQ ID NO：9和10来在FFPE组织中进一步测试。在RNA的 系列稀释物中进一步测试这些SEQ ID NO：9和10引物，且在更低的稀 度之前表现出良好的线性范围，从而表明引物应具有良好的灵敏度，且 适用于测定(图6b)。

MAGE-A3的冷冻和FFPE TaqMan测定的对比

使用引物SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和探针SEQ ID NO：16 对比了42个FFPE肿瘤样品，使用引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4 和探针SEQ ID NO：13在冷冻组织中完成相同测定(图7)。测定的阳 性水平设定在1％ gerl(阳性对照)，且直接对比表明2个测定之间似乎具 有一定的一致性。有些MAGE-A3阳性患者MAGE-A3不与MAGE-A3 冷冻组织测定一致；这可以通过造成表达MAGE-A3的肿瘤细胞的纯度 的增加的肿瘤区域的大解剖(macro dissection)来解释。大多数稀释正 常细胞的去除产生阳性MAGE-A3结果。在FFPE组织和RNA later冷 冻组织之间表现出0.92的R²值(线性相关的统计学检验)，从而表明2 种方法之间的良好相关(图8)。

实施例4-COBAS^TM Taqman MAGE-A3试验

表7

COBAS^TM TaqMan MAGE-A3引物和探针序列

E＝FAM报道染料，F＝5-甲基dC，Q＝BHQ2猝灭剂，L＝5-丙炔 基dU，

P＝磷酸酯，I＝HEX报道分子

MAGEA3F-646MOD探针序列包含下述修饰的核苷酸(SEQ ID NO： 54)：

5′-TCTTTCCTGTGATCTTCAGCAAAGCTTC-3′

表8

COBASTaqManβ-肌动蛋白引物和探针序列

E＝FAM报道染料，F＝5-甲基dC，Q＝BHQ2猝灭剂，L＝5-丙炔 基dU，

P＝磷酸酯，I＝HEX报道分子

表9

样品&对照有效CT范围

 

对照有效Ct范围FFPET样品Mage基因50ng FAM<35.2FFPET样品B肌动蛋白基因50n HEX<32.1100％ Gerl Mage基因50ng FAM26.0-29.5100％ Gerl B肌动蛋白基因50ng HEX24.0-27.01％ Gerl Mage基因0.5ng FAM33.0-35.51％ Gerl B月几动蛋白基因0.5ng HEX29.0-32.5100％ UHR Mage基因50ng FAM25.0-28.0100％ UHR B肌动蛋白基因50ng HEX22.0-25.01％ UHR Mage基因0.5ng FAM31.0-33.01％ UHR B肌动蛋白基因0.5ng HEX27.0-29.0P53阳性对照DNA20ng FAM26.5-29.0阴性对照(NC)>38.0

表10

热循环概况

MAGE-A3排他性实验的PCR热概况

表11

线性和RT-PCR效率、分析灵敏度(检测限度)、方法关联、和再现 性实验的RT-PCR热概况

执行63℃的相对高的退火温度，以提高相对于其它MAGE-A家族 成员的MAGE-A3特异性。

数据分析

在COBAS^TM TaqMan 48分析仪工作站(Roche，CA，USA)上使用 AMPLILINK^TM3.1软件(Roche，CA，USA)，基于在试验定义文件中定 义的测定参数，计算MAGE-A3和β-肌动蛋白的Ct值。如下进行基因 表达的数据分析：从AMPLILINK^TM求出MAGE-A3和β-肌动蛋白的Ct 值用于下游计算，以测定相对于β-肌动蛋白基因的MAGE-A3基因表 达。对于每次运行，将包含对照以确立需要满足或超过的阈MAGE-A3 表达水平，以使样品称作MAGE-A3阳性的。使用来自细胞系GERL的 RNA作为阳性对照。在水中1：100稀释GERL RNA(1％GERL)，并测 定MAGE-A3Ct。另外，对于β-肌动蛋白Ct测量，没稀释地测试未稀 释的GERL RNA(100％GERL)。计算来自100％GERL对照的β-肌动蛋 白Ct减去来自1％GERL对照的MAGE-A3Ct的ΔCt值，且基于下面的 计算，确定MAGE-A3的相对表达：

MAGE-A3阈表达＝2^^{(来自100％GERL的β-肌动蛋白Ct-来自1％GERL的MAGE-A3Ct)}

对于石蜡包埋的样品，将使用相同的对照策略，除了使用QIAGEN FFPE方法从GERL FFPE异种移植物提取的RNA将替代GERL细胞系 RNA，用于确立阈表达。

由于COBAS^TM Taqman MAGE-A3试验是多重反应，所以MAGE-A3 和β-肌动蛋白Ct值源自相同的反应管。通过下面的方程式，为各试验 样品计算MAGE-A3相对表达：

试验样品的MAGE-A3表达＝2^^{(来自样品的β-肌动蛋白Ct-来自样品的MAGE-A3Ct)}

如果试验样品的MAGE-A3表达大于或等于从GERL RNA对照确立 的MAGE-A3阈水平，则该样品称作MAGE-A3阳性的。如果试验样品 的MAGE-A3表达小于从对照确立的MAGE-A3阈水平，则该样品称作 MAGE-A3阴性的。

通过取来自每个样品的复制品的MAGE-A3Ct和β-肌动蛋白Ct值 的平均值，用于计算ΔCt(β-肌动蛋白Ct-MAGE-A3Ct)，来确定 MAGE-A3表达。如果一个复制品具有小于试验Ct截止值的MAGE-A3 Ct或β-肌动蛋白Ct，但是另一个复制品具有大于Ct截止值的MAGE-A3 Ct或β-肌动蛋白Ct，则再测试该样品。如果两个复制品具有大于Ct截 止值的β-肌动蛋白Ct，则将该样品标记为在范围之外的β-肌动蛋白Ct， 且不给出结果。如果两个复制品具有大于MAGE-A3Ct截止值的 MAGE-A3Ct值，但是MAGE-A3表达超过阈，则将该样品标记为在范 围之外的MAGE-A3Ct，且不给出结果。该数据分析策略与在下面的“方 法关联”部分所述的方法关联进行的交叉验证研究一致。

对于COBAS^TM Taqman MAGE-A3试验，可以执行来自Stratagene 的人QPCR人参照总RNA(UHR)作为阳性对照，并基于该良好表征的 RNA中的MAGE-A3表达来设定表达阈。每次运行可以与GERL RNA 对照一起测试稀释的UHR，以用UHR对照确立适当的表达阈。

样品和试剂保存条件

在-80℃保存所有RNA和DNA，包括质粒、P53阳性的对照DNA、 临床FFPET RNA、UHR、GERL和STAC。在2-8℃保存所有试验试剂， 包括通用RNA主混合物、引物/探针掺合物、辅因子掺合物、和样品稀 释剂/阴性对照。

MAGE-A3排他性

用含有MAGE-A家族成员的DNA质粒进行引物和探针的实验测试

目的：为了确定试验特异性扩增MAGE-A3基因、同时排除其它有 关基因的显著共扩增/检测的能力。

样品材料：将测试含有MAGE-A3和有关的家族成员的质粒DNA (质粒的细节参见上面的实施例2)。

程序：使用含有MAGE-A家族成员的DNA质粒进行COBAS TaqMan MAGE-A3试验的实验测试，以确定是否以显著量扩增和检测有 关的基因。

在4个不同的DNA浓度(20、2、0.2、0.02pg)，一式三份地测试每 个质粒DNA样品。修改表10所示的热循环概况，以去除在60℃20分 钟的反转录步骤。通过Nanodrop分析，测定质粒DNA的浓度。

分析：

测定MAGE-A3质粒的Ct值，并与MAGE-A1、MAGE-A2、 MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11 和MAGE-A12质粒的Ct值对比。通过从MAGE-AX Ct(每个有关的家 族成员)减去MAGE-A3Ct，计算ΔCt。将来自4个复制品的Ct平均值用 于计算Ct和ΔCt。

接收标准：

·在MAGE-A3和除了MAGE-A6以外的所有其它质粒之间，ΔCt 值必须大于等于10。

MAGE-A3排他性结果

在本文的表和图中，在有些场合，术语“CURIE”用于替代“MAGE”； 但是，在所有情况下意指术语“MAGE”。

在下面所示的表12和图17中，显示了测试的所有MAGE质粒的 Ct值。对于没有扩增的质粒，分配55的Ct值，因为在热循环概况中存 在55个循环。如预期的，MAGE-A3 Ct是测试的所有水平中最早的(表12 和图17)。在MAGE-A3和除了MAGE-A6之外的所有其它质粒之间， ΔCt值大于10个循环(表13和图18)。不需要MAGE-A3和MAGE-A6 之间的ΔCt，因为95％的表达MAGE-A6的患者也表达MAGE-A3。

20pg、2pg、0.2pg和0.02pg质粒DNA输入的MAGE-A3和 MAGE-A6之间的ΔCt分别是9.3、8.4、7.8和8.2个循环。因为显示来 自FFPE样品的RNA的大多数MAGE-A3Ct值大于测试的FFPE样品 的27.2，所以来自MAGE-A6的信号将是最小的，因为8.2个循环的延 迟会产生在测定范围之外的Ct值。

满足了排他性的接收标准。

表14显示了MAGE-A3排他性实验验证；对照Ct在验证的范围内。 实验通过验证。表15和16显示了MAGE-A3排他性实验细节。

线性和RT-PCR效率

目的：测定实验的线性和反转录效率。

样品材料：将FFPE异种移植物GERL RNA的系列稀释物用于线性 和RT-PCR效率研究。

程序：将FFPE异种移植物GERL RNA从100ng2倍系列稀释至0.1 ng，并使用COBAS TaqMan MAGE-A3试验进行测试，以确定测定的线 性范围。在每个浓度水平，测试10个复制品。

分析：

相对于RNA的输入浓度的log(底数2)，绘制MAGE-A3和β-肌动 蛋白的每个复制品的Ct值的图，以计算线的斜率和RT-PCR的效率。 使用下面的方程式，计算RT-PCR扩增效率：

斜率＝-1/log(底数2)*扩增效率(AE)。

2的扩增效率等同于100％。相对于RNA的输入浓度的log(底数2)， 绘制每个复制品的ΔCt值(MAGE-A3Ct-β肌动蛋白Ct)的图，以测定 ΔCt斜率。从所有10个复制品计算MAGE-A3Ct、β-肌动蛋白Ct和ΔCt 的平均值、标准差和变异系数百分比(％CV)。

接收标准线性：

基于下述标准，确定测定的线性范围：

MAGE-A3Ct CV<5％

β-肌动蛋白Ct CV<5％

ΔCt CV<20％

-0.10<ΔCt斜率<0.10

R2>0.95

接收标准RT-PCR效率：

MAGE-A3RT-PCR扩增效率>80％

β-肌动蛋白RT-PCR扩增效率>80％

MAGE-A3和β-肌动蛋白之间的RT-PCR扩增效率差异在10％内。

线性/RT-PCR效率结果

图20显示了RNA输入的log(底数2)相对于MAGE-A3和β-肌动 蛋白的Ct值的图。使用基于R2值的QIAGEN方法，COBAS TaqMan MAGE-A3试验在100-0.1ng从FFPE异种移植物提取的GERL RNA 的输入值之间是线性的。MAGE-A3的R2值是0.983，且β-肌动蛋白的 R2值是0.998。这些值超过R2>0.95的规格。另外，在测试的每个水 平所有10个复制品的MAGE-A3和β-肌动蛋白Ct都低于表17所示的 CV<5％的规格。

从图19所示的RNA输入的log(底数2)相对于MAGE-A3和β-肌动 蛋白的Ct值的绘图产生的线的斜率，计算MAGE-A3和β-肌动蛋白的 RT-PCR扩增效率。可以用下述方程式，计算RT-PCR的扩增效率：

斜率＝-1/Log(底数2)*扩增效率(AE)。

MAGE-A3和β-肌动蛋白的扩增效率分别是2.14(107％)和2.06 (103.1％)。AE超过MAGE-A3和β-肌动蛋白的80％的规格。2个基因之 间的AE的差异是3.9％，它也在+10％的规格内。

图20显示了RNA输入的log(底数2)相对于MAGE-A3和β-肌动 蛋白之间的ΔCt的图。ΔCt斜率是0.0474，充分在-0.10至0.10的斜率 规格内。在测试的RNA输入的2个最低水平(0.2&0.1ng)，ΔCt的％CV 超过20％的规格。结果，最后2个RNA输入水平没有包含在测定的线 性范围内。使用GERL异种移植物RNA的测定的线性范围是100ng- 0.39ng RNA。

基于这些数据，满足了线性和RT-PCR效率的接收标准。

表18显示了MAGE-A3和β-肌动蛋白的RT-PCR扩增效率；表19 是线性/RT-PCR效率实验验证。

对照Ct在验证的范围内。实验通过验证。

表20、21和22提供了线性/RT-PCR效率实验细节。

分析灵敏度(检测限度)

目的：确立在至少95％时间通过COBAS^TMTaqMan MAGE-A3试验 可以检测MAGE-A3基因表达的最低RNA浓度

样品材料：使用QIAGEN RNeasy FFPE试剂盒，具有额外的DNA 酶步骤，使用从FFPE异种移植物组织分离出的RNA，评价分析灵敏度。 从源自2个不同RNA细胞系的2个FFPE异种移植物提取RNA。一个 异种移植物称作表达MAGE-A3的GERL。另一个异种移植物称作不表 达MAGE-A3的STAC。将来自这2个异种移植物的RNA用于混合物实 验，以在95％ STAC RNA背景下测试5％ GERL RNA，在99％ STAC RNA 背景下测试1％ GERL RNA，且在99.5％ STAC RNA背景下测试0.5％ GERL RNA。在4个不同的总RNA水平，测试GERL和STAC RNA的 这3种不同混合物。

程序：从GERL和STAC RNA混合物的4个独立稀释系列，生成 24个试验结果。测试了RNA输入的4个水平(100、50、25和12.5ng)。 测试每个水平的6个复制品。

分析：基于在验证的测定范围内的Ct值，确定得到MAGE-A3的> 95％阳性率的RNA水平。

接收标准：对于1％GERL的检测，LOD<50ng输入总RNA

检测限度结果

命中率定义为基于在该报告中所述的线性实验在测定的线性范围 内的Ct值。为了确定Ct范围的末端，取来自线性研究的0.39ng RNA 输入水平(线性范围末端)的MAGE-A3和β-肌动蛋白Cts的平均值，且 为MAGE-A3和β-肌动蛋白Ct计算95％置信限度。基于这些计算，就 要被视作命中的样品而言，MAGE-A3Ct必须小于或等于35.2，且β-肌 动蛋白Ct必须小于32.1。在表23和表25中显示了MAGE-A3和β-肌 动蛋白的命中率。在表24和表26中显示了MAGE-A3和β-肌动蛋白的 命中率百分比。

检测限度是50ng输入RNA，这时基于落入验证的测定范围内的 MAGE-A3Ct，在>95％的时间检测出在99％STAC RNA中稀释的1％ GERL RNA。满足了分析灵敏度(检测限度)的接收标准。

检测限度实验验证。MAGE基因FAM对照Cts如表27所示；β- 肌动蛋白HEX对照Cts如表28所示。对照Cts在验证的范围内。实验 通过验证。

表29；表30；和表31显示了检测限度实验细节。

方法关联

目的：在临床FFPET样品上关联和交叉验证COBAS^TMTaqMan MAGE-A3试验和原型测定。

样品材料：使用COBAS TaqMan MAGE-A3试验和使用原型测定， 分析约120个优质的临床FFPET样品。

程序：使用具有额外DNA酶步骤的QIAGEN^TMRNeasy FFPE试剂 盒，提取RNA。为每个FFPET样品进行一次提取，将样品分开，且通 过COBAS TaqMan MAGE-A3试验测试一个等分试样，使用原型测定测 试一个等分试样。为2个测定运行相同的对照，以确立MAGE-A3表达 阈。

分析：

基于由GERL RNA对照产生的MAGE-A3表达阈，将每个样品的 MAGE-A3调用(call)报告为阳性的或阴性的。对比2个测定之间的结 果，以通过RMS试验的比较器百分比一致值确立阳性的和阴性的。

对于百分比一致计算，以前使用冷冻组织的2步RT-PCR测定得到 的结果用于解析不一致的结果。

通过比较器百分比一致得到的阳性＝正确地调用的MAGE-A3表达 子(expressor)的样品数/测试的样品数*100

通过比较器百分比一致得到的阴性＝正确地调用的MAGE-A3非 表达子的样品数/测试的样品数*100

接收标准：

通过比较器百分比一致得到的阳性>85％

通过比较器百分比一致得到的阴性>85％

对来自NSCLC临床试验的临床样品进行交叉验证，以通过COBAS TaqMan MAGE-A3试验的比较器百分比一致评估阳性和阴性。 MAGE-A3原型RT-PCR测定用作这些研究的比较器。在结果不一致的 情况下，以前从与非手工显微切割的新鲜冷冻组织相同的样品产生的结 果用于不一致结果解析。

使用具有DNA酶I消化步骤的QIAGEN RNeasy FFPE方法，从131 个手工显微切割的临床FFPE样品提取RNA。然后将每个样品在测试的 RMS和RGI之间平均分配，所述测试使用RMS COBAS TaqMan MAGE-A3试验和RGI原型测定。如部分3所述进行数据分析，在该报 告中，基于1％GERL RNA对照测定MAGE-A3表达阈。

方法关联/交叉验证结果

从131个NSCLC FFPE临床样品提取RNA样品。基于RGI’s RT 对照反应，7个样品具有大于25％的基因组DNA污染。通过比较器百 分比一致计算，将这些样品从阳性和阴性中排除。另外，有6个来自 COBAS测定的不确定结果，和15个来自原型测定的不确定结果，其中 基于在测定线性范围外的β-肌动蛋白Ct，样品不具有足够的材料，或者 样品的MAGE-A3表达超过阈，但是，MAGE-A3Ct在线性范围外。结 果，有117个来自COBAS测定的结果和108个来自原型测定的结果具 有可以用于对比2个不同试验的交叉验证的数据(表32)。COBAS和原 型测定之间的总一致性是98/107或91.6％(表33)。使用原型测定作为 “金标准”的COBAS试验的比较器百分比一致的阳性是59/64或92.2％， 而比较器百分比一致的阴性是39/43或90.7％(表33)。在COBAS和原 型测定之间不一致结果的情况下，由冷冻组织样品分析产生的结果用于 解析不一致性(表34)。

在COBAS和原型测定之间具有不一致结果的9个样品中，7个在 COBAS和冷冻测定之间表现出一致性，而2个在原型和冷冻测定之间 表现出一致性。结果，当使用冷冻结果来解析不一致性时，COBAS测 定的比较器百分比一致的阳性增加至63/64或98.4％，比较器百分比一 致的阴性增加至42/43或97.7％(表34)。

COBAS TaqMan MAGE-A3试验的比较器百分比一致的阳性和阴性 超过了大于或等于85％的规格。满足了比较器百分比一致的阳性和阴性 的接收标准。

方法关联/交叉验证对照验证

实验对照MAGE基因Cts如表30所示；实验对照β-肌动蛋白基因 Cts如表31所示。对照Cts在验证的范围内。实验通过验证。

方法关联/交叉验证实验细节如表37、38和39所示。

再现性

目的：证明由多个操作员用多个试剂批次和多个仪器经多天产生的 数据集合之间试验的再现性和稳健性。

样品材料：

使用具有DNA酶I消化步骤的QIAGEN RNeasy FFPE试剂盒，提 取12个来自手工显微切割的NSCLC FFPE临床样品的样品，并使用 COBAS TaqMan MAGE-A3试验进行扩增/检测。

程序：

该研究由每个样品的2个复制品组成。

为QIAGEN样品制剂和TaqMan试剂测试了2个试剂批次。

由2个不同的操作员在2个不同天使用2个不同的COBAS TaqMan 48分析仪进行实验。

分析：

从2个RT-PCR复制品的平均值计算每个临床样品的MAGE-A3表 达。另外，为来自每个样品的每个复制品评估MAGE-A3调用。再现性 也基于从MAGE-A3和β-肌动蛋白基因之间的ΔCt值计算出的MAGE-A3 基因表达的对比。使用Pearson关联，对比使用不同试剂批次、仪器、 操作员和不同天测试的样品的MAGE-A3表达。

接收标准：

运行之间和运行复制品之间是试验检测限度的至少3X(3％GERL) 的样品之间>90％ MAGE-A3调用一致性。

样品之间的Pearson关联>90％

再现性结果

MAGE-A3表达阈是确定患者是否将接受MAGE-A3特异性免疫疗 法的MAGE-A3表达截止值水平。具有等于或大于阈的MAGE-A3表达 的患者将具有MAGE-A3阳性调用并接受治疗。具有小于阈的MAGE-A3 表达的患者将具有MAGE-A3阴性调用并不接受治疗。试验的再现性研 究基于使用下述方程式的每个样品的MAGE-A3表达调用：

MAGE-A3表达阈＝2＾(100％GERL对照的β-肌动蛋白Ct- MAGE-A3Ct1％GERL对照)

临床样品的MAGE-A3表达＝2^(样品的β-肌动蛋白Ct-样品的 MAGE-A3Ct)

另外，通过用Pearson Product-Moment相关系数(r)对比2个运行之 间MAGE-A3表达的关联，评估测定再现性。表40和表37显示了基 于β-肌动蛋白和MAGE-A3之间的ΔCt用运行1和2测试的GERL RNA 对照产生的MAGE-A3表达阈。表41和表43显示了在运行1和2中 测试的12个样品中每一个的MAGE-A3调用。

表42显示了运行2—来自GERL RNA对照的MAGE-A3表达阈； 表43显示了运行2—再现性样品的MAGE-A3表达调用

对于测试的所有样品，2个运行之间存在MAGE-A3表达调用的 100％关联。另外，通过用Pearson Product-Moment相关系数(r)对比2 个运行之间MAGE-A3表达的关联，评估测定再现性。当对比2个不同 运行之间的MAGE-A3表达时，Pearson相关系数是0.987。满足了再现 性的接收标准。

表44显示了再现性验证；对照Cts在验证的范围内。实验通过验 证。

再现性实验细节如表45、46和47所示。