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用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用

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本发明公开了一种用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用，所述MNP标记位点为在马铃薯基因组上筛选的在马铃薯种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括马铃薯基因组GCA_009827175.1上MNP‑1～MNP‑560的标记位点。所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.1120所示。所述MNP标记位点数目多、多态性高、品种区分能力强，满足马铃薯品种真实性鉴定和实质性派生品种鉴定需求；所述引物互不干扰，鉴定准确度高、结果重现性强，满足DNA指纹数据库构建的要求；可应用于大规模马铃薯品种鉴定，在农作物产品的市场监管、知识产权保护、新品种培育等方面具有极大的应用价值。

著录项

公开/公告号CN113817858A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-12-21

原文格式PDF
申请/专利权人江汉大学;
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申请/专利号CN202110977723.7
发明设计人彭海;周俊飞;李甜甜;方治伟;高利芬;陈利红;李论;肖华锋;
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申请日2021-08-24
分类号C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101);
代理机构11570 北京众达德权知识产权代理有限公司;
代理人张晓冬
地址 430056 湖北省武汉市沌口经济技术开发区新江大路8号
入库时间 2023-06-19 13:48:08

说明书

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用。

背景技术

马铃薯是茄科茄属多年生草本植物，仅次于小麦、稻谷和玉米，为全球第四大重要的粮食作物。2015年以来，在国家推进马铃薯主食化战略的背景下，我国马铃薯种植规模呈逐渐增长的形式，同时近年来马铃薯育成新品种数量增多。马铃薯栽培种多为四倍体，相比较于二倍体作物，利用分子标记技术进行鉴定的难度较大，因此在马铃薯品种管理中急需一种能准确、高效进行品种鉴定的方法，以保护品种权人的合法权益，推进马铃薯产业的健康发展。

目前广泛应用的分子标记类型有SSR(Simple Sequence Repeats)标记和SNP(Single Nucleotide Polymorphism)标记。SSR标记包含一段简单重复序列，其突出优势是多态性高，但SSR标记法一次PCR扩增一般不超过5个SSR位点，通量低，DNA聚合酶在扩增SSR位点时，存在滑动现象，容易产生不真实的滑脱基因型，滑脱基因型与样本中主基因型区分不开，导致SSR标记法难以用于多倍体植物的鉴定。全基因组重测序技术可以一次可检测大量的SSR位点，但基因组上仅～3％的序列为SSR位点，导致检测成本较高。因此，实际应用中往往只能检测有限的SSR位点，例如，马铃薯鉴定国家标准中，仅选用了12个SSR位点(马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记GB/T 28660-2012)，无法满足实质性派生品种鉴定对标记数量的要求。基因芯片法可以一次可检测成千上万、甚至几十万个SNP位点，通量大大高于SSR标记。然而，一个SNP标记位点仅有2种等位基因型，多态性远低于SSR标记，难以区分多倍体植株；检测SNP标记的探针固定在芯片上，芯片一旦合成，很难调整与改变，灵活性差。

因此，开发用于马铃薯品种鉴定的高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用，不仅可以对马铃薯品种进行品种真实性鉴定和实质性派生品种鉴定，也可以对马铃薯品种进行遗传分析，具有区分度强、通量高、准确度高的效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在马铃薯基因组上筛选的在马铃薯种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，所述MNP标记位点包括马铃薯基因组GCA_009827175.1上MNP-1～MNP-560的标记位点。

上述技术方案中，MNP-1～MNP-560的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于GCA_009827175.1序列确定的。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括560对引物，所述560对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.1120所示。

上述技术方案中，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示，其中，序号1的上引物为SEQ ID NO.1，序号1的下引物为SEQ ID NO.2，序号2的上引物为SEQ ID NO.3，序号1的下引物为SEQ ID NO.4，序号3的上引物为SEQ ID NO.5，序号1的下引物为SEQ ID NO.6，以此类推。

在本发明的第三方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。

在本发明的第四方面，提供了所述的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在马铃薯品种真实性鉴定中的应用。

在本发明的第五方面，提供了所述的用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在马铃薯实质性派生品种鉴定中的应用。

在本发明的第六方面，提供了所述的用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在马铃薯种质资源遗传多样性分析中的应用。

在本发明的第七方面，提供了所述的用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在构建马铃薯品种DNA指纹数据库中的应用。

以上所述的应用中，具体应用步骤为：

首先是获取待测品种的总DNA；利用本发明的试剂盒对所述待测样本DNA进行第一轮多重PCR扩增，循环数17个；对扩增产物进行纯化后，进行基于第二轮PCR扩增进行样本标签和二代测序接头的添加；对第二轮扩增产物纯化后定量；

检测多个马铃薯品种样本时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序；

对待测样本的测序数据进行数据质量控制和数据分析，将测序结果比对到所述的马铃薯参考序列上，获取所述待测样在所述MNP位点上的检出位点数目、覆盖每个所述MNP位点的测序序列数目和所述MNP位点基因型数据。

当用于品种鉴定和实质性派生品种鉴定时，制定了所述试剂盒和检测方法，评估所述试剂盒和检测方法的准确性和区分度；

当用于马铃薯个体遗传分析时，包括种群间和种群内部的遗传差异分析。利用所述的试剂盒和方法，获得待比较个体各自在560个MNP位点的基因型数据。通过基因型比对，分析待比较个体在所述560个MNP位点上的共同检出MNP位点，其中每个位点上的主基因型是否存在差异，并统计差异比例。通过差异比例来判定个体间的遗传差异分布情况。

当用于马铃薯品种DNA指纹数据库构建时，利用所述的试剂盒和方法，获得待测马铃薯品种在560个MNP位点的基因型数据。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供了一种用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用，所提供的马铃薯的560个MNP位点和其引物组合，可进行多重PCR扩增，结合二代测序平台进行扩增产物的测序，对马铃薯品种的检测具备通量高、区分度高、准确性高等特点，实验证明本发明提供的560个MNP标记位点、引物组合物和试剂盒不仅能满足马铃薯品种真实性鉴定和实质性派生鉴定的需求，同时能进行种质资源遗传多样性分析，实现了DNA指纹数据库中的品种数据的共享及自由比对；因此本发明所提供的560个MNP标记位点和引物组合可应用于马铃薯品种真实性鉴定、实质性派生鉴定、种质资源遗传多样性分析以及其他相关应用中，为我国马铃薯品种分子育种、品种权管理、市场监管、知识产权保护等方面提供有力的技术支撑，确保粮食安全，促进产业的健康发展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为马铃薯MNP标记检出位点数分布图

图2为马铃薯样品间MNP标记差异数目分布图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

筛选适用于检测群体生物的MNP标记作为检测目标；MNP标记是指在基因组上一段区域内由多个核苷酸引起的多态性标记。与其它相比，MNP标记具有以下优势：(1)等位基因丰富，多态性高，单个MNP位点上有2n种等位基因型，高于SSR和SNP标记；(2)品种区分能力强，由于MNP标记的等位基因型多，只需要少量的MNP标记就能实现品种鉴定，减少了检测错误率；(3)效率高，可以在单管PCR反应中同时进行扩增多个位点，比如现有国标GB/T 38551中可同时扩增317-1042个MNP标记；结合高通量测序，可以同时检测成百上千个样本。(4)准确度高，二代高通量测序仪对扩增标记产物进行测序数百次，输出结果为碱基序列，无需平行实验，可对数据进行任意比对，数据共享性强。

基于以上优点和特性，MNP标记技术已广泛应用于水稻、玉米、甜瓜、猕猴桃等作物中，目前在马铃薯中尚未有关于MNP标记的报道，也缺乏相应的技术。

因此，本发明基于马铃薯参考基因组并结合对主要马铃薯品种的测序数据，通过研发的标记筛选规则(具体见实施例1)，筛选了一套多态性高的马铃薯MNP标记位点，所述MNP标记位点为在马铃薯基因组上筛选的在马铃薯种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括马铃薯基因组GCA_009827175.1上MNP-1～MNP-560的标记位点。

接着，本发明设计出了扩增这些MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括560对引物，所述560对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.1120所示。所述引物互相间不冲突，可以通过多重PCR进行高效的扩增，鉴定准确度高、结果重现性强，满足DNA指纹数据库构建的要求；

所述多重PCR引物组合物可以用于检测所述MNP标记位点的检测试剂盒。所述引物和检测试剂盒应用于马铃薯品种真实性鉴定、实质性派生鉴定、种质资源遗传多样性分析以及其他相关领域中。

下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用进行详细说明。

实施例1、用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点的筛选和多重PCR扩增引物的设计

S1、用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点的筛选

以公开发布的马铃薯基因组序列GCA_009827175.1为参考基因组，结合从NCBI的SRA数据库中获得的71个马铃薯样本的基因组测序数据，首先采用Samtools(Version 1.2)和BCFtools(Version:1.2)进行序列分析获得马铃薯基因组上的SNP位点，并与NCBI的NT库进行比较分析，按以下原则进行MNP标记的筛选：(1)标记序列仅在马铃薯特有，不在其它物种中出现；(2)序列在基因组中单拷贝；(3)标记序列上有至少三个以上不连续SNP的差异；(4)标记序列长度小于250bp；进一步在已获马铃薯样本测序数据中比较筛选出的候选MNP标记的区分度，最终筛选出560个MNP标记位点。

表1-560个马铃薯MNP标记位点以及560对检测引物在参考序列上的起始位置

S2、多重PCR扩增引物的设计

通过引物设计软件设计所述MNP位点的多重PCR扩增引物，引物设计遵循引物间互不干扰，所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增，最终筛选出本发明表1所述的560个MNP位点的引物组合物。

实施例2、马铃薯品种鉴定的MNP标记、引物组合物及其试剂盒的评估

560对引物合成后，每条引物取5ul/条的等量进行混合组成F和R端引物1:1混合的引物mix。利用单位收集的27份马铃薯品种进行开发的MNP标记、引物以及试剂盒的评估，测试MNP标记位点的检出率、准确性和区分度。

(1)MNP标记检出率

按本发明所述试剂盒进行多重PCR扩增及测序文库的构建，对这27份马铃薯DNA样本进行了多重扩增、二代高通量测序与数据分析，实现了一次实验达到27×650＝17550个标记的检测，每个样品的测序平均覆盖倍数达858倍以上，显示了MNP标记检测的高效性。

马铃薯MNP标记检出位点数分布图如图1所示，在这27个样本的测序数据中统计MNP标记的检出数目，每个品种平均可以检出636个MNP标记，检出率达97.9％。检出标记数量远超现有SSR标记数量，且检出率高。

(2)马铃薯MNP标记法准确性分析

为了检验马铃薯MNP标记的准确性，对27个马铃薯品种按以下方法进行了重现性实验。用每个品种分别提取两份DNA分别于不同时间构建2次文库，编号-1、-2；2个文库于不同测序批次进行高通量测序。不同批次间文库相互比较，统计结果见表2。

表2-560个马铃薯MNP标记位点准确性评估信息表

同一样品的不同文库间检出相同的MNP标记基因型是可重现的，按照重现性计算公式r＝n/N，n:可重复的基因型对数，N：比较的基因型总对数。依据2次实验间可重现的基因型认为是准确的原则，准确率＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r。

由表2可知，本发明重现性试验中共比较的17181个标记位点中17173个标记在两次建库测序实验中都能重现，r＝99.95％，准确性为99.98％。

(3)马铃薯MNP标记品种区分度

统计27份马铃薯样品在这560个MNP标记位点上的基因型，进行两两比较，基于不同品种中同一MNP标记位点等位基因型上差异至少1个SNP判为有差异的原则，统计这27个样品两两比较间的差异MNP标记数目，结果如图2所示；

由图2可知，统计这27个样品两两比较间的差异MNP标记数目共得到351对比较结果，任意品种间MNP标记平均差异数量199.5个，351对样品的遗传距离的差异位于34.62％～59.66％之间，平均差异达48.60％，可以显著区分每个马铃薯品种，说明筛选出的马铃薯MNP标记多态性高、区分度高。

实施例3、马铃薯品种真实性鉴定和实质性派生品种判定

目前现有的《植物品种鉴定MNP标记法》国家标准以遗传相似系数作为品种鉴定的依据，而遗传相似系数的计算又是根据品种间具有差异和相同基因型的标记位点的数目进行计算的，因此品种鉴定的准确性最终取决于品种的基因型分型的准确性。

以实施例2中表2的分析为例，利用17181个标记位点分型结果表明，不论是重复性实验，还是重现性实验，此发明的560个马铃薯MNP标记法分型的结果的准确率达99.98％，准确性高表明在以后的应用中非平行实验即不同时间或实验室的检测结果对品种鉴定结论准确性的影响是很小的，基本可以忽略，因此可以应用于对准确性要求颇高的品种真实性鉴定中，同时由于不同时间做出的结果可以准确的进行比对，而不必在同一实验室做平行实验，对于管理机构及公司进行品种鉴定提供了极大的方便。

现有植物品种鉴定MNP标记法国家标准中，大田作物如水稻、玉米、棉花等规定遗传相似度小于96％时，判定待测品种与对照品种为“不同品种”；遗传相似度大于或等于96％且小于99％时，判定待测品种与对照品种为“近似品种”；遗传相似度大于或等于99％时，判定待测品种与对照品种为“极近似品种或相同品种”。

同一马铃薯品种生产的不同种薯个体间为相同品种，我们以此阈值对编号PO0010的马铃薯样本的5组种薯个体进行品种真实性鉴定，其中5组个体间MNP标记差异0-1个位点(遗传相似度为99.89％～100％)，真实性鉴定结论为：极近似品种或相同品种，正确率为100％。

采用MNP标记技术获得的品种DNA指纹数据是一条条的碱基序列，可以长期存储且数据溯源性强，因此每鉴定一个品种都可以将其测序数据保存下来形成DNA指纹数据库。进一步，我们可以将待测品种获得的等位基因型与DNA指纹数据库中的数据进行大量的比较，极大地方便了近似品种的准确筛选、品种权侵权对象的准确确定、以及实质性派生品种的准确鉴定等应用。这些应用需要将一个品种的分型结果与成千上万个品种的分型结果进行比对，假设采用传统鉴定方法平行实验就需要做成千上万次实验，不具有可行性，通过本发明的标记、引物及其试剂盒，只需要一次实验，然后把比对工作交给计算机处理即可，同时本发明中MNP标记数量达560个，鉴定的标记位点数目多也使得近似品种的准确筛选、品种权侵权对象的准确鉴定、以及实质性派生品种的准确鉴定等应用成为了可能。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 江汉大学

<120> 用于马铃薯品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用

<160> 1120

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA