一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的HPLC-MS/MS方法

摘要

本发明公开了一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的HPLC‑MS/MS方法，采用蛋白沉淀法提取血浆样品中的分析物，Agilent InfinityLab Poroshell 120EC‑C18色谱柱分离样品，以乙腈:水为流动相梯度洗脱，质谱条件采用在电喷雾离子源正离子模式下，联合多重离子监测模式。色谱分离的总时长为4分钟。本申请方法检测14种抗抑郁药在空白血浆中线性良好(R2＞0.99)，批内和批间精密度RSD为0.65％～13.18％，准确度为85.21％‑117.6％，而且基质效应、回收率、稳定性及稀释效应和残留效应等均符合要求，为优化临床药物治疗方案提供了大量有意义的临床数据。

说明书

技术领域

本发明涉及临床血药浓度监测技术领域，特别涉及一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的HPLC-MS/MS方法。

背景技术

近年来，随着心理卫生的发展，精神疾病防治越来越受到社会各界重视。然而精神疾病在治疗上极富挑战，主要体现在精神科患者服药依从性差，药物治疗窗窄，毒副作用较严重等方面。治疗药物监测(TDM)在精神疾病的治疗过程中起着至关重要的作用，已有大量证据表明监测血清或血浆药物浓度具有治疗和经济效益，不仅提供患者依从性、可能的疗效反应，药代动力学相关数据，同时也为药物相互作用以及潜在副作用的发生和预防提供有价值的信息。

为了准确、精确地测定血浆或血清中药物浓度，具有高特异性和高灵敏度的高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)已广泛应用于临床。当HPLC-MS/MS用于常规临床TDM时，一般需要至少两个离子跃迁用于鉴定每种化合物，并且血浆(或血清)中不同分析物响应存在明显差距。因此，高效地同时测量多种化合物仍面临巨大挑战。另外，虽然既往有大量文献报道的分析方法使用了液液萃取(LLE)或固相萃取(SPE)作为样品前处理方法，但这些分析方法耗时，试剂耗材昂贵。近期报道中开发了一些高效且环境友好的样品制备方法，例如液相微萃取(LPME)，固相微萃取(SPME)和串联分散液-液微萃取(TDLLME)法，这些方法提供了更好地纯化能力，但复杂且昂贵，不适用于常规临床检测。所以，申请人认为，基于神经精神药理学与药物精神病学协会(AGNP)发布的神经精神药理学治疗药物检测共识指南，建立了一种方便、快捷、全面的测定人血浆中抗抑郁药浓度的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法，是非常有必要的。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的HPLC-MS/MS方法。

本申请是采用以下技术方案得以实现的。

一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的HPLC-MS/MS方法，包括以下步骤：

S1.标准曲线的建立

a.溶液的制备：

对照品工作液：将盐酸舍曲林、盐酸度洛西汀、文拉法辛、西酞普兰、马来酸氟伏沙明、盐酸帕罗西汀、盐酸氟西汀、盐酸米安色林、盐酸氯米帕明、盐酸阿米替林、O-去甲文拉法辛、去甲替林、去甲氯米帕明，去甲氟西汀标准品分别溶于甲醇，配制得到对照品储备液；将14种对照品储备液混合并用甲醇定容，制备得到对照品混合储存液，再将混合储存液用甲醇稀释为系列混合对照品工作液；

内标工作液：将度洛西汀-d7、文拉法辛-d6、西酞普兰-d6和舍曲林-d3分别溶于甲醇，配制得到内标储存液；将4种内标储存液混合并用甲醇定容，配制得到混合内标工作液；

b.对照品溶液的测定

向空白血清中加入各浓度的混合对照品工作液、内标工作液，混匀后加入乙腈，涡旋震荡并离心，取上清液至96孔板中，采用HPLC-MS/MS进行分析；测得各对照品峰面积Ai、内标峰面积As，以Ai/As值F为纵坐标，以对应的对照品血清浓度C为横坐标绘制标准曲线；

色谱条件如下：

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18柱，规格为2.1×50mm，2.7μm；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；梯度洗脱程序如下：起始比例为30％B，0～4min，从30％B梯度洗脱到50％B，下一次进样前重新平衡色谱柱；

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；离子模式：正离子模式；数据采集模式：多重离子监测；干燥气流速：11L·min

表1 分析物、母离子、子离子、驻留时间、裂解电压和碰撞电压及极性

S2.血浆样品处理与检测

取血清样品加入内标工作液和乙腈，涡旋震荡并离心，取上清液至96孔板中，按步骤S2b的方法进行进样分析，再根据步骤S2b的标准曲线得到血浆样品中14种抗抑郁药的浓度。

进一步的，步骤S1a中，系列混合对照品工作液，浓度构成分别为：米安色林：0.04、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4μg/mL；西酞普兰：0.06、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6μg/mL；帕罗西汀/度洛西汀：0.08、0.8、1.6、3.2、4.8、6.4、8；舍曲林/阿米替林/去甲替林：0.1、1、2、4、6、8、10μg/mL；文拉法辛/O-去甲文拉法辛/氟伏沙明/氯米帕明/去甲氯米帕明：0.2、2、4、8、12、16、20μg/mL；氟西汀/去甲氟西汀：0.4、4、8、16、24、32、40μg/mL。

进一步的，步骤S1b中，色谱柱的流速：0.3mL·min

进一步的，步骤S1b和S2中，涡旋震荡3-5分钟，12000-13000r/min离心10-15分钟。

进一步的，步骤S2中，血清样品与乙腈的体积比为1：4。

本申请具有以下有益效果。

本申请为满足临床常规TDM需要，建立了一种同时测量14种临床常用抗抑郁的HPLC-MS/MS方法，并考察了方法的选择性、精密度和准确度、稳定性、基质效应和回收率等，所有验证指标均符合生物分析方法要求。本申请方法采用简单的蛋白沉淀处理血浆样品，经济、高效并节省了劳动力；制定了符合临床需求的线性范围，线性囊括了绝大部分的临床样品；通过优化液相条件将单个样品的分析时间缩短至4min，能够很好地满足临床高通量检测需求。本申请方法的建立为优化临床药物治疗方案提供了大量有意义的临床数据。

附图说明

图1是本发明标准血浆样品和空白人血浆样品的色谱图；其中，A：14种分析物在空白血浆+LLOQ(上)中以及4种内标物在空白血浆(下)中的总MRM图谱；B：14种分析物分别在空白血浆加标LLOQ(左)和空白血浆(右)中的MRM色谱图；C：4种内标分别在空白血浆加标LLOQ(左)和空白血浆(右)中的MRM色谱图。

具体实施方式

1.仪器与试剂

1.1主要仪器

Agilent 1260系列液相色谱，Agilent 6460三重串联四级杆质谱仪。

1.2试剂与材料

乙腈：Merck HPLC色谱纯；水：屈臣氏蒸馏水；甲酸：Merck HPLC色谱纯。

标准品及内标：盐酸舍曲林(批号：100702-201602)、盐酸度洛西汀(批号：510144-201701)、西酞普兰(批号：100885-201802)、马来酸氟伏沙明(批号：100792-201902)、盐酸帕罗西汀(批号：100357-201804)、盐酸氟西汀(批号：100513-201602)、盐酸米安色林(批号：100812-200501)、盐酸氯米帕明(批号：100843-201602)、盐酸阿米替林(批号：100518-201303)购自中国生物制品检定研究所。文拉法辛(批号：FS1603121)、O-去甲文拉法辛(批号：FS1606252)、去甲替林(批号：FS1612444)购自天津阿尔塔公司。去甲氯米帕明(批号：24-IG-117-2)，去甲氟西汀(批号：1-SGP-164-1)、度洛西汀-d7(批号：27-AZC-28-1)、文拉法辛-d6(批号：5-EQJ-4-3)、西酞普兰-d6(批号：16-XDD-61-1)和舍曲林-d3(批号：8-MJC-182-1)购自加拿大TRC公司。

2.方法与结果

2.1色谱和质谱条件

2.1.1色谱条件

色谱柱：Poroshell 120EC-C18柱(2.1×50mm，2.7μm，美国安捷伦公司)；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈。梯度洗脱程序如下：起始比例为30％B，0～4min，从30％B梯度洗脱到50％B，下一次进样前重新平衡色谱柱(2min)。流速：0.3mL·min

2.1.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；离子模式：正离子(positive)模式；数据采集模式：多重离子监测(MRM)；干燥气流速：11L·min

表1 分析物、母离子、子离子、驻留时间、裂解电压和碰撞电压及极性

2.2溶液制备

2.2.1对照品和内标储备液

对照品储备液：精密称取盐酸舍曲林、盐酸度洛西汀、文拉法辛、西酞普兰、马来酸氟伏沙明、盐酸帕罗西汀、盐酸氟西汀、盐酸米安色林、盐酸氯米帕明、盐酸阿米替林、O-去甲文拉法辛、去甲替林、去甲氯米帕明，去甲氟西汀标准品各10mg，置于10mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，配制成1mg/mL的标准品母液，1.5mL玻璃小瓶分装，-80℃保存。

内标储备液：度洛西汀-d7、文拉法辛-d6、西酞普兰-d6和舍曲林-d3分别溶于1mL甲醇中，配制成1mg/mL的内标母液-80℃保存。

2.2.2对照品和内标工作液

对照品工作液：精密量取14种对照品储备液于同一容量瓶中，甲醇定容制备成对照品混合储存液，每种对照品的浓度分别为40μg/mL(米安色林)、60μg/mL(西酞普兰)、80μg/mL(帕罗西汀、度洛西汀)、100μg/mL(舍曲林、阿米替林、去甲替林)、200μg/mL(文拉法辛、O-去甲文拉法辛、氟伏沙明、氯米帕明、去甲氯米帕明)、400μg/mL(氟西汀、去甲氟西汀)。混合储存液用甲醇稀释为系列混合对照品工作液，浓度构成分别为：0.04、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4μg/mL(米安色林)；0.06、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6μg/mL(西酞普兰)；0.08、0.8、1.6、3.2、4.8、6.4、8(帕罗西汀、度洛西汀)；0.1、1、2、4、6、8、10μg/mL(舍曲林、阿米替林、去甲替林)；0.2、2、4、8、12、16、20μg/mL(文拉法辛、O-去甲文拉法辛、氟伏沙明、氯米帕明、去甲氯米帕明)；0.4、4、8、16、24、32、40μg/mL(氟西汀、去甲氟西汀)。

内标工作液：精密量取4种内标储存液于容量瓶中，用甲醇配制成1μg/mL的混合内标工作液。

2.2.3标准曲线及质控样品的制备

取空白血清190μL置于1.5mL EP管中，加入各浓度的混合对照品工作液10μL，内标工作液10μL，涡旋5s，加乙腈800μL，涡旋震荡3分钟，13000r/min离心10分钟，取上清液200μL至96孔板中，按方法规定进样量进样。测得各对照品峰面积(Ai)、内标峰面积(As)，以Ai/As值F为纵坐标，以对应的对照品血清浓度C为横坐标绘制标准曲线，经最小二乘法线性回归，得各药品的标准曲线。

精密量取对照品工作液适量，置于空白血浆中，制成低、中、高3个浓度水平的质控(QC)样品，三种质控品分别为LLOQ的3倍(QC-L)，线性的中间浓度(QC-M)，线性最高浓度的75％(QC-H)。

2.2.4血浆样品处理

取血清样品200μL，置于1.5mL EP管，加内标工作液10μL，加入乙腈800μL，涡旋震荡3分钟，13000r/min离心10分钟，取上清液200μL至96孔板中，按方法规定进样量进样。

2.3方法验证

根据中国药典2015版生物样品定量分析方法指导原则(草案)和美国食品和药物管理局(FDA)的生物分析方法验证指南对方法进行验证。

2.3.1选择性

选取来自6个不同来源的空白血浆样品，分别按照“2.2.4”项下的方法处理、分析以考察方法的选择性。对于临床常规TDM，选择性评估中也包括特殊样品，如溶血样品，高脂样品的影响。

标准血浆样品和空白人血浆样品的典型色谱图见图1，实验结果表明，未在空白血浆中检测到目标化合物和内标干扰，溶血样品和高脂样品的峰型不受影响。

2.3.2线性范围

以混合空白血浆为基质，制备6条独立的混标标准曲线用于评估方法的线性，样品按照“2.2.4”项下的方法处理。通过峰面积比(分析物/ISTD)对理论浓度作图，生成各分析物的校准曲线，使用加权因子“1/X

14种抗抑郁药的内标、线性范围、线性方程、相关系数(R

表2 14种抗抑郁药的线性范围、线性方程和保留时间

2.3.3精密度与准确度

以混合空白血浆为基质，配置混标低、中、高个浓度质控样品(QC-L，QC-M和QC-H)以及LLOQ，各6份，分别在同一天内和不同日期内，按照“2.2.4”项下的方法处理样品，并用随行标准曲线计算浓度以评估日内和日间精密度及准确度。

精密度和准确度数据见表3，实验结果显示，所有化合物的LLOQ的日内和日间精密度均<20％，其他QC<15％，准确度在85.51％-114.77％之间。符合指南要求，表明本申请方法是准确且精确的。

表3 精密度和准确度

2.3.4基质效应和回收率

在空白血浆样品中以三种水平(QC-L，QC-M和QC-H)评估了基质效应(matrixeffects，ME)和提取回收率(extraction recovery，ER)。制备三组样品，每组制备6份样品，具体如下：

1)空白血浆样品中加标分析物，再按照“2.2.4”项下的方法处理样品为A组；

2)在按照“2.2.4”项下的方法处理空白血浆后，加入质控品为B组；

3)用流动相初始比例配置同浓度的质控品，直接进样为C组。

基质效应和回收率的计算公式分别如下：ME＝B/C*100％，ER＝A/B*100％，其中通过内标归一化法计算基质效应。

基质效应和回收率的结果见表4。实验结果显示，应用蛋白沉淀法测量14种抗抑郁药具有相对较高且稳定的回收率，回收率范围在79.02～107.12％之间。所有分析物的回收率及归一化的基质效应的变异系数(CV)均<15％，符合指南要求。

2.3.5稳定性考察

结合本实验室样本处理实际情况，分别考察低、中、高浓度质控品在四种条件下的稳定性：室温(20～25℃)保存24h的台式稳定性、-20℃保存30天的长期稳定性、-80℃反复冻融三次的冻融稳定性、提取后室温保存24h的制备后稳定性。

稳定性结果见表4，实验结果显示，在四种条件下，稳定性在86.01％～113.47％范围内，所有考察批次的RSD均不高于12.34％，符合指南要求。

表4 基质效应、回收率和稳定性

2.3.6稀释效应和残留效应

在进样定量上限(ULOQ)样品后马上进样空白样品来考察残留效应，稀释完整性则通过对高浓度样品(约为ULOQ的5倍)稀释10倍来评估。

稀释完整性的精密度(CV％)在7.52％以内，准确度为95.43-108.67％，均符合指南要求。另外，在本方法中未观察到明显的残留效应。

2.4临床应用

通过验证后，本方法已成功用于临床常规治疗药物监测，共测得674个样品，各监测药物的样本量及实测血药浓度范围见表5。长期临床实践显示本申请方法稳定、经济、高效。根据第三版AGNP指南制定临床使用的治疗参考范围和警戒浓度。因艾司西酞普兰为西酞普兰的右旋异构体，在本方法中无法区分，因此将两者一并统计分析。本申请检测的抗抑郁药样本大多来自门诊患者，样本中检测前三名的药品分别为舍曲林、(艾司)西酞普兰和度洛西汀。根据AGNP指南要求，文拉法辛、氟西汀、氯米帕明和阿米替林的有效血药浓度为母药与其活性代谢产物之和。到目前为止，所有检测样本均在线性范围内，未发现需稀释处理样品。

表5 患者血浆样品14种抗抑郁药血药浓度范围

*此项统计结果为西酞普兰(7例)和艾司西酞普兰(134例)样本之和

#文拉法辛、氟西汀、氯米帕明和阿米替林的有效血药浓度为母药与其活性代谢产物之和

3.结论

本申请方法使用简单的蛋白沉淀前处理，建立一种全面、稳定、高效地同时测量14种抗抑郁药的HPLC-MS/MS方法，以用于常规临床TDM监测。本方法监测的品种包括AGNP指南推荐应用TDM等级：I级(强烈推荐)药物5种(阿米替林、去甲替林、氯米帕明、去甲氯米帕明、西酞普兰)，II级(推荐)药物5种(度洛西汀、艾司西酞普兰、氟伏沙明、舍曲林、文拉法辛)，III级(有用)药物5种(米安色林、帕罗西汀、去甲文拉法辛、氟西汀、去甲氟西汀)，选择药物基本囊括了中国境内上市的大部分抗抑郁药，该方法经全面验证，符合指南各项指标要求，能够满足日常临床TDM需要。

阿米替林、去甲替林、氯米帕明和去甲氯米帕明等三环类抗抑郁药，虽然已较少用于临床(在既往临床应用中甚至没有临床样品)，但此类药物中毒浓度与治疗浓度范围非常接近，是指南强烈推荐进行TDM的药物，本申请将其保留在检测方法中以备中毒样本筛查。

在样品前处理方法的选择上，相较于SPE、LLE或其他前处理方法，本方法选择了简单、经济、快捷的蛋白沉淀法。蛋白沉淀可以除去蛋白质和其他潜在的干扰物，并且方便快捷，特别适合常规TDM等高通量生物分析。除此之外蛋白沉淀法最大程度地减少基质的离子抑制或离子增强作用，并能保护色谱柱。

在各药物的线性范围设定上，本申请方法充分结合指南推荐范围以及临床样本需要，线性范围包含了所有药物的有效血药浓度范围及实验室警戒浓度。考虑到临床应用中可能会出现中毒筛查等导致样品血浆药物浓度超线性的特殊样品，因此在方法学验证中本申请进行了稀释效应的考察。到目前为止的临床应用中，未发现超线性样品。

在稳定性的考察方面，结合本实验室实际情况考察了稳定性，四种稳定性条件分别为：室温保存24h、样品提取后放置于样品盘中24h，-80℃反复冻融三次和-20℃保存30天，这与实验室日常常规TDM操作流程相适应。

为保证分析方法的准确性，除实验室常规配置随行质控样品外，本实验室还与多家单位及机构进行室间质评，同时参与LGC治疗药物监测能力测试(LGC为英国国家指定的化学和生物分析测定研究所)并通过能力测试。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。