METs作为分子标志物在评估脑胶质瘤患者临床预后中的应用

摘要

本发明公开了METs作为分子标志物在评估脑胶质瘤(Glioblastoma，GBM)患者临床预后中的应用。本发明根据临床数据结合实验结果，发现METs在高级别脑胶质瘤中水平升高，METs能够促进GBM的增殖、侵袭、迁移能力，经METs刺激后，GBM细胞内DDX5的泛素化水平降低，β‑catenin入核增多，并且能够调控EMT相关指标的表达水平变化及GBM细胞恶性进展。通过免疫荧光、免疫印迹实验等技术方法检测生物样本中共定位的CD68和citH3，能够间接检测METs的水平进而评估GBM患者临床预后。本发明的提出为指导GBM患者的个体化诊疗，提高患者临床治疗效果，提高GBM患者的总体生存期提供了新的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种与疾病相关的分子标志物，特别涉及METs作为分子标志物在评估脑胶质瘤患者临床预后中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

脑胶质瘤是一种起源于颅内神经上皮细胞的恶性肿瘤，也是颅内最常见的原发恶性肿瘤，占中枢神经系统恶性肿瘤的50％。脑胶质瘤具有高度侵袭、恶性增殖等特点，往往导致患者生存期较短。目前，临床治疗方式是，手术治疗联合同步放化疗，但脑胶质瘤患者的5年生存率仍不足10％。

脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是脑胶质瘤中级别最高，预后最差的分型。目前，GBM治疗以手术切除为主，结合同步放化疗、免疫治疗、分子靶向治疗等多种治疗手段，但治疗效果欠佳。不同级别的脑胶质瘤的临床预后及分子生物学特点具有明显差异。GBM存在上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)进展，EMT进展预示着肿瘤向具有较高的恶性行为亚型转化，并具有高表达N-cadherin、Slug、β-catenin等间质标记物、低表达E-cadherin、Claudin-1等上皮标记物的特点。EMT进展参与调控GBM的侵袭、迁移和放化疗耐受等生物学活动。

GBM的EMT进展与肿瘤微环境密切相关。肿瘤微环境由多种非肿瘤细胞、分泌因子、信号分子和细胞外基质成分组成。肿瘤微环境中具有独特的髓系细胞亚群，如肿瘤相关树突状细胞、肿瘤相关中性粒细胞和肿瘤相关小胶质细胞,可通过抑制肿瘤微环境中的免疫细胞对肿瘤细胞的抑制作用，促进肿瘤的放疗耐受、化疗耐受及侵袭迁移等恶性表型。小胶质细胞是中枢神经系统内固有的巨噬细胞，可以通过胞外诱捕网的释放、细胞因子及趋化因子的释放等多种方式，参与肿瘤的EMT进展、免疫抑制、血管生成、细胞增殖、迁移和侵袭等生物学过程。

胞外诱捕网(Extracellulartraps,ETs)是细胞受到刺激之后，失去细胞内膜完整性染色质延伸、解凝聚，继而核膜崩解，释放到胞外的包含多种蛋白成分的DNA网状结构。常见胞外诱捕网来源于中性粒细胞，它不仅参与了免疫反应，在食道癌、肺癌、结肠癌等疾病中还能增强肿瘤细胞浸润能力，促进肿瘤的转移，调节循环肿瘤细胞与内皮细胞的粘附作用。而小胶质细胞胞外诱捕网(Macrophage/microglia extracellular traps，METs)功能与之相同,但对脑胶质瘤的作用机制有待进一步研究。

结合不同GBM免疫微环境对其影响并对患者的临床预后进行预测，可以指导患者的个体化治疗，优化治疗方案以达到最大的效益。

发明内容

本发明的目的之一是提供METs作为分子标志物在评估脑胶质瘤患者临床预后中的应用。

本发明的目的之二是提供用于检测METs的试剂在制备评估脑胶质母细胞瘤患者临床预后的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的目的之三是提供一种用于评估脑胶质瘤患者临床预后的检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明利用CD68蛋白作为小胶质细胞的标记蛋白，以及与citH3特异性标记的胞外诱捕网的共定位，来确定小胶质细胞胞外诱捕网(Macrophage/microgliaextracellular traps，METs)的水平。根据研究结果，结合临床数据和分子生物学实验，发现在脑胶质瘤中存在METs；随肿瘤级别升高，METs的水平升高；METs与脑胶质瘤细胞膜蛋白结合后，胞内DDX5的泛素化水平降低，促进β-catenin入核，调控GBM的上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。

在上述研究的基础上，本发明提出了小胶质细胞胞外诱捕网(Macrophage/microglia extracellular traps，METs)作为分子标志物在制备评估脑胶质母细胞瘤患者临床预后的试剂或试剂盒中的应用。

进一步的，本发明还提出了用于检测METs的试剂在制备评估脑胶质母细胞瘤患者临床预后的试剂或试剂盒中的应用。

其中，优选的，所述的用于检测METs的试剂由用于检测小胶质细胞标记物CD68的试剂以及用于检测METs特异性标记物citH3的试剂组成。

其中，优选的，所述的用于检测小胶质细胞标记物CD68的试剂为CD68小鼠单克隆抗体，所述的用于检测METs特异性标记物citH3的试剂为citH3兔单克隆抗体，通过免疫荧光、免疫印迹法检测生物样本中共定位的CD68和citH3，进而检测METs的水平。

更进一步的，本发明还提出了一种用于评估脑胶质瘤患者临床预后的检测试剂盒，所述的检测试剂盒是通过免疫荧光、免疫印迹法检测生物样本中共定位的CD68和citH3，进而检测METs的水平，所述该试剂盒的组成包括：CD68小鼠单克隆抗体，citH3兔单克隆抗体，山羊抗兔IgG抗体，山羊抗鼠IgG抗体，DAPI染色剂。

其中，优选的，所述的生物样品为脑胶质母细胞瘤新鲜病理组织。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明利用METs与GBM细胞的结合进行免疫共沉淀联合液相质谱分析，发现METs释放增加可以促进GBM的恶性进展。METs可作为评估脑胶质瘤分级和预后的标志物以及GBM术前评估的分子标志物，指导患者的个体化诊疗，提高患者临床治疗效果，有助于提高GBM患者的总体生存期，为我国精准医疗事业发展添砖加瓦。

附图说明

图1为以citH3和CD68为特征性标记物，利用METs试剂盒检测不同级别脑胶质瘤中METs水平的应用。高级别脑胶质瘤中METs的水平相比于低级别胶质瘤明显增高；

图2为METs中DNA片段结合细胞膜蛋白CD109；

其中：(A)通过超声破碎仪收获长短为200-1000bp的METs中的DNA片段；(B)为METs中的DNA片段与GBM细胞膜蛋白CD109结合的银染结果；(C)为METs中的DNA片段与GBM细胞膜蛋白CD109结合的DNApull-down结果；(D)细胞膜蛋白CD109与METs中DNA片段相结合的特异性氨基酸序列；

图3为METs与CD109结合后促进EMT进展的具体机制；

其中：(A)为CD109与DDX5免疫共沉淀的银染结果；(B)为DDX5的氨基酸序列中与CD109结合的氨基酸片段；(C)为CD109与脑胶质瘤细胞胞浆蛋白免疫共沉淀后质谱结果显示DDX5的氨基酸片段；(D)为免疫共沉淀显示CD109和DDX5结合；(E)为免疫共沉淀显示CD109同时和DDX5与USP34结合以及DDX5蛋白泛素化水平，验证DDX5的去泛素化；(F)为抑制USP34和CD109后，DDX5的去泛素化水平升高并且与USP34表达水平成负相关；(G)为外源性加入METs导致β-catenin水平升高；(H)为敲低CD109后β-catenin水平降低；

图4为GBM中METs影响肿瘤恶性进展；

其中：(A)为验证不同浓度的METs对脑胶质瘤侵袭的影响；(B)为外源性加入METs明显促进脑胶质瘤侵袭能力；(C)为外源性加入METs明显促进脑胶质瘤迁移能力。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法：所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1脑胶质母细胞瘤瘤周METs水平增多

1、检测试剂的制备

(1)荧光抗体的制备；

向1.5mL EP管中加入10mg牛血清白蛋白干粉，溶于1mL磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH＝7.4)中，并将1μg CD68小鼠单克隆抗体和2μg citH3兔单克隆抗体加入EP管中，移液器充分混合，于-20℃冰箱暂存；

(2)荧光二抗制备；

向1.5mL避光EP管中加入10mg牛血清白蛋白干粉，溶于1mL PBS中，在避光条件下取2μg山羊抗兔IgG(H+L)Alexa Fluor 488和2μg山羊抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 594加入避光EP管中，移液器充分混合，于-20℃冰箱避光暂存；

(3)DAPI染色剂的制备；

向1.5mL避光EP管中加入10mg牛血清白蛋白干粉，溶于1mL PBS中，并将5μgDAPI染色剂加入避光EP管中，移液器充分混合，于-20℃冰箱暂存。

2、实验方法

2.1组织切片荧光染色

(1)将已包埋的不同级别脑胶质瘤标本制作厚度为3μm的石蜡切片；

(2)将石蜡切片置于60℃烘箱内，烘片2-8h；

(3)将切片浸入二甲苯溶液中进行脱蜡2次，每次30min；

(4)将切片浸入以下浓度梯度的乙醇复水：100％乙醇10min，100％乙醇10min，95％乙醇10min，85％乙醇10min，75％乙醇10min，50％乙醇10min，蒸馏水10min，蒸馏水10min，PBST溶液10min；

(5)抗原修复：将切片置于0.1mol/L，pH＝6.0的柠檬酸修复液中，维持切片处于95-100℃中30min，完成抗原修复，自然冷却至室温；

(6)封闭：用PBST清洗切片3次，每次3min，滴加5％BSA封闭37℃，持续30min；

(7)一抗孵育：滴加荧光抗体后，将切片置于湿盒中4℃孵育过夜，过夜后使用PBST溶液清洗切片3次，每次3min；

(8)二抗孵育：滴加对应的荧光二抗，将切片置于湿盒中室温避光孵育1h，用PBST溶液清洗切3次，每次3min；

(9)细胞核染色：滴加DAPI染色液，将切片置于湿盒中室温避光20min，用PBST溶液清洗切3次，每次3min；

(10)封片：利用封片剂封片，并在荧光显微镜下立即观察。

2.2组织HE染色

(1)将已包埋的不同级别脑胶质瘤标本制作厚度为3μm的石蜡切片；

(2)将石蜡切片置于60℃烘箱内，烘片2-8h；

(3)将切片浸入二甲苯溶液中进行脱蜡2次，每次30min；

(4)将切片浸入以下浓度梯度的乙醇复水：100％乙醇10min，100％乙醇10min，95％乙醇10min，85％乙醇10min，75％乙醇10min，50％乙醇10min，蒸馏水10min，蒸馏水10min，PBST溶液10min；

(5)苏木素染细胞核：将切片浸入苏木素染液3-8min，自来水洗5min；

(6)伊红染细胞质：将切片浸入伊红染液中染色1-3min；

(7)脱水封片：将切片依次放入95％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇5min，100％乙醇5min，二甲苯溶液5min，二甲苯溶液5min中脱水透明，中性树胶封片。

3、结果

CD68作为小胶质细胞标记物，citH3作为胞外诱捕网特异性标记物，二者共定位可以明确METs的释放。我们发现在高级别脑胶质瘤中，CD68阳性的小胶质细胞和citH3在瘤周表达水平升高，结果见图1。

这些结果提示，CD68和citH3共定位的表达水平和脑胶质瘤分级和预后相关。因此，METs检测可以应用于评估脑胶质瘤患者临床预后。

实施例2METs中的DNA片段结合GBM细胞膜蛋白并促进下游信号通路

1、实验方法

1.1DNA提取及制备

(1)使用500nM佛波酯(PMA)加入LN229及HG7细胞培养基中放入细胞孵箱静置4h，弃去培养基，加入2mL预冷PBS溶液冲洗，1000g离心10min取上清；

(2)利用超声破碎仪(功率：50w，超声破碎：10s，间隔：30s，共计15个循环)对提取的MET-DNA进行破碎，获得长度约为200-1000bp的DNA片段。

1.2DNApull-down实验

(1)预先混合5μg生物素标记的DNA和500μgGBM细胞膜蛋白，置于冰上；

(2)取100μL Streptavidin-agarose G串珠，用0.5mL预冷PBS溶液清洗，5000g离心30秒；

(3)将DNA与蛋白的混合物加到串珠中，重悬珠子；

(4)4℃孵育1h；

(5)5000g，离心30秒，去除上清，收集沉淀；

(6)用冰冷PBS溶液清洗串珠3次，5000g离心1min，尽可能去除上清，收集沉淀；

(7)加入10μL非变性裂解液，应用BCA(Bicinchoninic acid)法测得蛋白质浓度；

(8)加入30μL蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮10min后取出待用。

1.3银染：

(1)电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5％浓缩胶和8-12％浓度分离胶；每孔上样40-60μg蛋白，开始电压为100v，到达分离胶后调为120v，电泳90min；

(2)PAGE电泳结束后，将PAGE蛋白胶转移至玻璃平皿或搪瓷盘中，用固定液固定30min；

(3)将PAGE胶转移至敏化液中，使染液没过PAGE胶，室温作用30min；

(4)弃去敏化液，用去离子水漂洗3次，每次10min；

(5)将PAGE胶转移至银染液中，使染液没过PAGE胶，室温摇晃40min；

(6)将PAGE胶转移至显色液中，使显色液没过PAGE胶，室温摇晃10min；

(7)选择合适的时间进行终止，弃去显色液，加入终止液即可。最后可进行信号收集保存。

1.4质谱检测

提取GBM膜蛋白，将生物素化的METs样本和无生物素链接的琼脂糖珠分别和膜蛋白混合，经DNApull-down实验获得样本，置于1.5mL EP管中。送往第三方检测机构进行检测。

2免疫共沉淀

(1)用预冷的PBS(phosphate buffered saline,磷酸盐缓冲盐溶液)洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；

(2)加入预冷的RIPABuffer(1mL/10

(3)将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，将细胞悬液转到1.5mL EP管中，4℃缓慢晃动15min；

(4)4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到新的离心管中；

(5)准备ProteinA琼脂糖珠，用PBS洗2遍珠子，然后用PBS配制成50％浓度溶液；

(6)每1mL总蛋白中加入100μLProteinA琼脂糖珠(50％)，4℃摇晃10min，以去除非特异性杂蛋白，降低背景；

(7)4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子；

(8)BCA(bicinchoninic acid)法做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响；

(9)用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μL，以降低裂解液中去垢剂的浓度；

(10)加入一定体积的一抗到500μL总蛋白中；

(11)4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育；

(12)加入100μLProteinA琼脂糖珠捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h；

(13)于14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，用预冷的RIPAbuffer清洗3次800μL/次；

(14)将琼脂糖珠-抗原抗体复合物重悬，轻轻混匀；

(15)将上样样品100℃5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，于-20℃冻存。

3蛋白质检测--Westernblot

(1)电泳：实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用浓度为5％浓缩胶(H

(2)转膜：转膜为恒流转膜，电流为200mA，时间根据目的蛋白分子量选择60-120min；

(3)封闭：蛋白膜放置到TBST(Tris Buffered Saline with Tween-20)溶液中，漂洗1-2min，以洗去膜上的转膜液；加入5％脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60min；

(4)孵育一抗：根据蛋白标记指示剂将PVDF(polyvinylidene fluoride)膜剪开，将PVDF膜分别放入一抗溶液中，4℃孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min；

(5)孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15min；

(6)显色：发光液(A液、B液)1：1配置(注意避光)，用移液器吸取合适量的发光液至覆盖PVDF膜，ECL发光仪上曝光并采集图像。

2、结果

经LC-MS/MS结果显示，METs中的DNA与GBM细胞膜上的CD109蛋白结合，并促进膜蛋白CD109和DDX5结合增强。经METs中的DNA刺激后，以CD109为桥接分子，促进去泛素化蛋白UPS34与DDX5的结合，DDX5去泛素化增多，维持DDX5蛋白水平稳定，不易降解。稳定表达的DDX5能够结合胞浆中的β-catenin，促进后者入核，从而促进EMT相关蛋白表达水平改变，提高GBM细胞侵袭及迁移能力，结果见图2、3。

实施例3METs可以促进GBM的恶性进展

1、方法

1.1通过对GBM细胞系LN229及原代细胞HG7，使用5μg ml

1.2使用Transwell技术检测加入METs后细胞系中细胞迁移和侵袭性的变化

(1)铺基质胶：4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基按照1：8比例稀释，取100μL均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5-1h；

(2)细胞培养：取对数生长期的待测细胞，并用PBS洗涤，用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1-10×10

(3)接种细胞：24孔板下室加入500μL含10％FBS的培养基，用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液200μL加入上室，放入培养箱中培养12-48h；

(4)细胞固定：取出小室，移除培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4％多聚甲醛600μL，固定20-30min；

(5)细胞染色及计数：弃固定液，0.2％结晶紫染色10min，PBS洗3遍，用棉签擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉。适当风干后，显微镜下观察细胞并计数；

1.3使用细胞划痕技术检测加入METs后细胞系中细胞迁移的变化。

(1)在六孔板每孔中加入约5×10

(2)枪头沿固定方向在孔板内部制作无细胞的空白划痕。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。

(3)放入37℃5％CO

1.4使用Image J软件进行结果统计分析

2、结果

GBM与其他的上皮源性肿瘤类似，存在上皮间质转化的现象，间质样生长的肿瘤细胞迁移、侵袭、转移等能力显著增强。EMT进展参与肿瘤的放化疗耐受、凋亡抵抗、侵袭复发等恶性表型。经过实验发现，加入METs后的GBM细胞迁移和侵袭的能力均增加，METs能够促进脑胶质瘤恶性进展，结果见图4。