一种白菜种子引发剂及其研究方法

摘要

本发明公开了一种白菜种子引发剂及其研究方法，白菜种子引发剂包括聚谷氨酸、5‑氨基乙酰丙酸、氨基丁酸、复硝酚钠四种成份，研究方法包括以下步骤：S1：设置正常引发实验环境和逆境胁迫环境实验；S2：种子生长指标测定；其中包括种子萌发指标的测定和生理生化指标的测定；S3：分析种子生长指标；引发剂成分为聚谷氨酸、5‑氨基乙酰丙酸、氨基丁酸、复硝酚钠；本发明通过以大白菜陈种子为试材，进行种子引发处理试验，可以筛选出合适的引发剂及适合的浓度组合；为提高种子活力，缩短发芽时间，增加种子抗逆性，培育壮苗等生产应用以及研究收集数据，为增加种子抗逆性，培育壮苗、实验研究等生产应用做铺垫。

说明书

技术领域

本发明涉及种子引发技术领域，具体涉及一种白菜种子引发剂及其研究方法。

背景技术

种子引发技术因能够缩短种子发芽时间并提高发芽率，成为一项可有效提高种子质量的种子处理技术，并具有广阔的应用前景。引发后，种子发生了一系列复杂的生理过程，包括激素、酶活性及营养物质均发生变化，种子活力提高，从而提高了种子活力、种子发芽率和整齐度，与此同时，发芽时间也明显缩短。但目前对于种子引发的研究仍以传统技术为主，研究不够深入，对不同引发剂的引发机理研究还很薄弱。不同类型的种子对引发方法、引发时间温度、引发剂浓度等要求不同，需要经过一系列试验验证，才能在生产实践中广泛推广。因此，进一步研发适合不同种属植物、适合不同生理状态的种子引发技术，是今后种子引发研究的重要任务。

目前有关引发技术对陈种子活力修复的研究较少。虽然种子在生理成熟后可以保持较长时间的活性，但随着贮藏时间加长，其膜系统受损，酶活性降低，遗传物质完整性下降，并表现出发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数降低，幼芽和幼根生长受到抑制。这直接给农业生产带来巨大的经济损失，并且给育种材料的筛选和改良也带来一定难度。大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中国，属十字花科植物，又称“结球白菜”、“包心白”，是我国的特产蔬菜之一，种植地区遍布我国各地植，是我国目前种植面积最大的蔬菜作物之一。其品质柔嫩，耐运输和贮藏，体内富含大量营养元素及粗纤维可以消食健胃，具有预防心血管疾病等药用功效，成为我国大部分地区冬春季食用的主要蔬菜。因此研究白菜陈种子及其他蔬菜陈种子的引发研究尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白菜种子引发剂及其研究方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种白菜种子引发剂，所述引发剂成分为聚谷氨酸、5-氨基乙酰丙酸、氨基丁酸、复硝酚钠。

进一步的，所述聚谷氨酸的含量为500mg/L，所述5-氨基乙酰丙酸的含量为10mg/L，所述氨基丁酸的摩尔浓度为10mmol/L，所述复硝酚钠的含量为10mg/L。

进一步的，本发明提供了一种白菜种子引发剂的研究方法，包括以下步骤：

S1：设置正常引发实验环境和逆境胁迫环境实验；

S11：正常环境引发实验的种子处理流程包括以下步骤；

S111：选择大小和饱满度一致的种子置于含有引发剂的试管中，每个试管内种子数量一致；引发剂引发，引发结束后用蒸馏水冲洗种子，冲净表面残留溶液后吸干表面水分，之后回干至初始含水量；

S112：完成步骤S111后，将种子播到含有单层湿润滤纸的培养皿中，每个培养皿种子数量相等；每天定时补充水分，保持滤纸湿润；

S12：逆境胁迫环境引发实验的种子处理流程包括以下步骤；

S121：设置若干组实验组，包括清水对照组、引发处理组；干旱胁迫组、干旱胁迫+引发处理组；盐胁迫组、盐胁迫+引发处理组；

S122：将步骤S121中的实验组放置到在恒温培养箱进行发芽；

S2：种子生长指标测定；其中包括种子萌发指标的测定和生理生化指标的测定；

S3：分析种子生长指标。

进一步的，步骤S111中，引发剂引发时间为2h。

进一步的，步骤S112中，发芽温度保持在白天22℃，持续16h；黑夜18℃，持续8h。

进一步的，所述NaCl溶液的摩尔浓度为75mmol/L。

进一步的，步骤S122中，发芽温度保持在白天22℃，持续16h；黑夜18℃，持续8h；每8h向对照组和干旱胁迫组添加蒸馏水至初始状态，每8h向盐胁迫组内添加NaCl溶液至初始状态，每8h向各个标准添加引发剂至初始状态。

进一步的，步骤S2中，种子萌发指标的测定方法为；从每个培养皿中选取若干株幼苗，用蒸馏水洗净，并用滤纸吸干后，测定不同引发处理后的下胚轴长和根长；发芽标准为下胚轴长为种子长度的1/2，每天早晚定时观察，并记录种子的发芽个数，第3天统计发芽势，第7天统计发芽率，并测量发芽种子的下胚轴长；根据种子发芽数和下胚轴长计算以下指标；

发芽势＝(Gt/T)×100％

发芽率＝(Gt/T)×100％

发芽指数＝∑Gt/Dt

活力指数＝发芽指数×S

其中Gt为发芽开始后第t天的发芽数；Dt为相应的发芽天数(d)；S为幼苗根长(cm)；T为每个培养皿内的供试种子数。

进一步的，步骤S2中，生理生化指标的测定方法为；取生长第7天的幼苗测定生理指标；生理指标包括；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定、过氧化物酶(POD)活性测定、过氧化氢酶(CAT)活性测定、丙二醛(MDA)含量测定、可溶性蛋白测定。

进一步的，所述超氧化物歧化酶(SOD)活性测定使用氮蓝四唑(NBT)光还原法；过氧化物酶(POD)活性测定使用愈创木酚法；过氧化氢酶(CAT)活性的测定使用紫外吸收法；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法；可溶性蛋白测定使用考马斯亮蓝G－250法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过以大白菜陈种子为试材，进行种子引发处理试验，可以筛选出合适的引发剂及适合的浓度组合；为提高种子活力，缩短发芽时间，增加种子抗逆性，培育壮苗等生产应用以及研究收集数据，为增加种子抗逆性，培育壮苗、实验研究等生产应用做铺垫。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明正交最优组合逆境胁迫下白菜种子萌发和生长示意图。

具体实施方式：

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。

因此，以下本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。

如图1所示，一种白菜种子引发剂，所述引发剂成分为聚谷氨酸、5-氨基乙酰丙酸、氨基丁酸、复硝酚钠。

进一步的，所述聚谷氨酸的含量为500mg/L，所述5-氨基乙酰丙酸的含量为10mg/L，所述氨基丁酸的摩尔浓度为10mmol/L，所述复硝酚钠的含量为10mg/L。

本发明的白菜种子引发剂的研究方法，包括以下步骤：

S1：设置正常引发实验环境和逆境胁迫环境实验；

S11：正常环境引发实验的种子处理流程包括以下步骤；

S111：选择大小和饱满度一致的种子置于含有引发剂的试管中，每个试管内种子数量一致；引发剂引发，引发结束后用蒸馏水冲洗种子，冲净表面残留溶液后吸干表面水分，之后回干至初始含水量；

S112：完成步骤S111后，将种子播到含有单层湿润滤纸的培养皿中，每个培养皿种子数量相等；每天定时补充水分，保持滤纸湿润；

S12：逆境胁迫环境引发实验的种子处理流程包括以下步骤；

S121：设置若干组实验组，包括清水对照组、引发处理组；干旱胁迫组、干旱胁迫+引发处理组；盐胁迫组、盐胁迫+引发处理组；

S122：将步骤S121中的实验组放置到在恒温培养箱进行发芽；

S2：种子生长指标测定；其中包括种子萌发指标的测定和生理生化指标的测定；

S3：分析种子生长指标。

本实施例中，步骤S111中，引发剂引发时间为2h。

本实施例中，步骤S112中，发芽温度保持在白天22℃，持续16h；黑夜18℃，持续8h。

本实施例中，步骤S121中，各个实验组的处理方法为；对照组和干旱胁迫组不使用引发剂，对照组添加和其他对照组引发剂等质量的蒸馏水，干旱胁迫组添加对照组蒸馏水质量的80％，盐胁迫组添加和对照组等质量的NaCl溶液，若干标准对照组分别添加组分含量不同的引发剂。

本实施例中，所述NaCl溶液的摩尔浓度为75mmol/L。

本实施例中，步骤S122中，发芽温度保持在白天22℃，持续16h；黑夜18℃，持续8h；每8h向对照组和干旱胁迫组添加蒸馏水至初始状态，每8h向盐胁迫组内添加NaCl溶液至初始状态，每8h向各个标准添加引发剂至初始状态。

本实施例中，步骤S2中，种子萌发指标的测定方法为；从每个培养皿中选取若干株幼苗，用蒸馏水洗净，并用滤纸吸干后，测定不同引发处理后的下胚轴长和根长；发芽标准为下胚轴长为种子长度的1/2，每天早晚定时观察，并记录种子的发芽个数，第3天统计发芽势，第7天统计发芽率，并测量发芽种子的下胚轴长；根据种子发芽数和下胚轴长计算以下指标；

发芽势＝(Gt/T)×100％

发芽率＝(Gt/T)×100％

发芽指数＝∑Gt/Dt

活力指数＝发芽指数×S

其中Gt为发芽开始后第t天的发芽数；Dt为相应的发芽天数(d)；S为幼苗根长(cm)；T为每个培养皿内的供试种子数。

本实施例中，步骤S2中，生理生化指标的测定方法为；取生长第7天的幼苗测定生理指标；生理指标包括；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定、过氧化物酶(POD)活性测定、过氧化氢酶(CAT)活性测定、丙二醛(MDA)含量测定、可溶性蛋白测定。

本实施例中，所述超氧化物歧化酶(SOD)活性测定使用氮蓝四唑(NBT)光还原法；过氧化物酶(POD)活性测定使用愈创木酚法；过氧化氢酶(CAT)活性的测定使用紫外吸收法；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法；可溶性蛋白测定使用考马斯亮蓝G－250法。

本发明具体实施方案如下：

1、材料与试剂的选择：

试验材料是实验室室温自然储藏5年的陈白菜种子，品种为太原二青(选自山西金农种业有限公司)；试验试剂聚谷氨酸(γ-PGA)购自瑞林生物科技有限公司；5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)购自西安天丰生物科技股份有限公司；氨基丁酸(GABA)购自SIGMA公司；复硝酚钠购自山东汉高生物工程有限公司。

2、种子引发处理：

2.1、正常处理下的种子引发处理方法：

选择大小和饱满度一致的种子置于含有引发剂的试管中，每个试管处理100粒种子；引发时间2h，引发结束后用蒸馏水冲洗种子，冲净表面残留溶液后吸干表面水分，之后回干至初始含水量；完成上述操作后，将种子播到含有单层湿润滤纸的培养皿中，每个培养皿30粒种子，3次重复，白菜发芽温度保持在白天22℃并持续16h，黑夜18℃并持续8h；每天定时补充水分，保持滤纸湿润。

2.2、逆境胁迫处理下的种子引发处理方法：

根据前期试验结果，采用试剂配比T9处理(即500mg/Lγ-PGA、10mg/L5-ALA、10mmol/L GABA、10mg/L复硝酚钠试剂)对白菜种子进行引发处理，设置蒸馏水处理作为对照T0，其余同上。

发芽试验在恒温培养箱进行，经预实验筛选设定三个发芽条件：(1)干旱胁迫D，相对含水量为对照处理的80％；(2)盐胁迫S，设置盐浓度为75mmol/L；(3)标准发芽条件CK；将T9和T0处理的种子分别置于上述三种发芽条件下，每隔8h向培养皿中补充所需水分(干旱胁迫D加入水分为CK的80％，盐胁迫S加入等量相应浓度的NaCl溶液)。

3、生长指标的测定

3.1种子萌发指标的测定：

发芽标准为下胚轴长为种子长度的1/2，每天早晚定时观察，并记录种子的发芽个数，第3天统计发芽势，第7天统计发芽率，并测量发芽种子的下胚轴长。根据种子发芽数和下胚轴长计算如下指标。

发芽势＝(Gt/T)×100％

发芽率＝(Gt/T)×100％

发芽指数＝∑Gt/Dt

活力指数＝发芽指数×S

其中Gt为发芽开始后第t天的发芽数；Dt为相应的发芽天数(d)；S为幼苗根长(cm)；T为每个培养皿内的供试种子数。

3.2白菜幼苗下胚轴长与根长的测定：

试验结束后，从每个培养皿中选取5株白菜幼苗，用蒸馏水洗净，并用滤纸吸干后，测定不同引发处理后的下胚轴长和根长。

3.3生理生化指标的测定：

取生长第7天的白菜幼苗测定生理指标。其中，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照高俊凤等的氮蓝四唑(NBT)光还原法；过氧化物酶(POD)活性测定参照高俊凤等的愈创木酚法；过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照郝再彬等的紫外吸收法；丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法；可溶性蛋白测定参照张志良等的考马斯亮蓝G－250法。

4、结果与分析

4.1正交组合处理对白菜种子萌发的影响

表1试验因素及水平

在单一引发剂试验提高白菜陈种子萌发和幼苗生长的基础上，选择各试剂引发效果最好的3个浓度进行混配，根据L9(34)正交表设计四因素三水平试验(表1)；通过测定各处理对白菜种子萌发特性的影响，确定γ-PGA(A)、5-ALA(B)、GABA(C)、复硝酚钠(D)对提高白菜种子发芽的最佳浓度配比，一方面筛选对白菜种子萌发有显著增效作用的试剂组合配比；另一方面也为挖掘各试剂间的互作奠定基础。

表2不同引发剂组合处理对白菜萌发和生长的影响

将不同浓度的γ-PGA、5-ALA、GABA、复硝酚钠组合进行引发，白菜种子的各项萌发指标均表现出明显差异(表2)；T6、T7、T9的发芽势显著高于对照处理，较对照分别提高32.13％、35.67％和46.40％，；T6、T7、T9的活力指数显著高于对照处理，较对照分别提高22.35％、17.35％和45.68％；除T5和T8外，其它各处理的发芽率均显著高于对照，其中T6、T7、T9对发芽率的提高效果最为明显，比对照处理分别提高23.84％、19.23％和24.62％；仅有T6和T9的发芽指数显著高于对照，较对照提高19.49％和31.51％，其余各处理对发芽指数的促进作用不明显；在下胚轴长方面，除T3、T5、T8处理外，其余处理均显著高于对照，并以T1和T2最为显著，较对照均增长16.19％；在根长方面，各处理差异较大，T1、T2和T3对根长的抑制作用显著，T4、T6、T7、T8和T9对根长的促进作用显著；综上所述，T9处理，即500mg/Lγ-PGA、10mg/L 5-ALA、10mmol/L GABA、10mg/L复硝酚钠试剂组合引发效果显著优于其他组合，其发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数和根长较T0处理分别提高46.40％、24.62％、31.51％、45.68％和10.77％。

表3不同引发剂组合处理对白菜幼苗抗氧化酶活性的影响

由表3可知，使用不同浓度的γ-PGA、5-ALA、GABA、复硝酚钠组合进行引发，白菜幼苗的可溶性蛋白、MDA及抗氧化物酶活性也存在较大区别；T9可溶性蛋白含量较对照显著提高，约70％，其他处理则降低了可溶性蛋白含量；除T5、T7和T8外的其他处理显著降低了MDA含量，表明试剂处理可有效修复膜损伤；除T2和T4外的其他处理SOD活性显著提高；T2、T6、T7和T9处理POD活性显著提高；T2、T6和T9处理CAT活性显著提高；POD、SOD、CAT活性作为抗氧化酶系统较为重要的3种酶结构，酶活性提高，可有效减小过氧化程度，促进代谢过程，进而提高种子活力；综上所述，T9处理，即500mg/Lγ-PGA、10mg/L ALA、10mmol/L GABA、10mg/L复硝酚钠试剂组合处理后，白菜幼苗中可溶性蛋白及抗氧化物酶活性有显著提升。

综上所述，通过比较不同试剂组合处理对白菜种子萌发和幼苗生长的影响，发现T9处理的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数和根长较T0处理分别提高46.40％、24.62％、31.51％、45.68％和10.77％；此外，T9处理可溶性蛋白含量、POD、SOD以及CAT等抗氧化酶活性也显著高于T0处理；总之，T9处理对种子的萌发指标和幼苗生长均存在明显促进作用。

4.2正交处理最优组合对逆境胁迫下白菜种子萌发的影响：

正交处理所得的最优组合T9处理对干旱胁迫和盐胁迫下种子萌发和幼苗生长有一定的促进作用(图1)；图1A可知，在CK、D和S条件下，T9处理种子发芽势较T0处理分别提高36.65％、15.44％和16.73％，但差异不显著；图1B可知，T9处理种子发芽率较T0处理分别提高8.62％、6.28％和6.91％；采用T9处理后种子发芽指数和活力指数变化比较明显(图1C、1D)，在CK、D和S条件下，经T9处理后发芽指数显著升高，较T0处理分别增加15.19％、20.81％和27.86％；在CK和D条件下，T9处理后活力指数显著高于T0处理，但在S条件下差异不显著；在根长方面(图1E)，采用T9处理和T0处理差异不显著，D和S条件下差异也不显著；在根长方面(图1F)，各个条件下使用T9处理和T0处理差异不显著，且在D条件下采用T0处理根长显著减小，但T9处理根长变化不明显。

表4正交最优组合逆境胁迫下白菜幼苗抗氧化酶活性的影响

通过采用试剂正交最优组合进行种子处理，比较不同时间T9与T0处理对白菜幼苗可溶性蛋白含量、MDA含量及抗氧化酶活性，发现各处理间的差异及在6d的变化趋势(表4)；在CK条件下T9与T0处理对可溶性蛋白含量的变化趋势均为先升高后减低，其中在0d和6d使用T9与T0处理对可溶性蛋白含量影响不大，在3d时T9处理后可溶性蛋白含量较T0处理升高14.61％；在D和S条件下T9与T0处理可溶性蛋白含量明显升高并且变化趋势同CK条件一致，在3d和6d时T9处理后可溶性蛋白含量较T0处理升高但不显著；不同处理MDA含量随着时间变化呈现先升高后降低的趋势，在CK条件下0d和3d使用T9处理后MDA含量较T0处理分别升高23.33％和23.33％，在6d无明显差异；在D条件下3d时T9处理后MDA含量较T0处理升高10.81％，但在6d时T9与T0处理MDA含量处于相同水平；在S条件下，T9处理随着时间变化对MDA含量无显著影响；不同处理SOD活性与时间变化呈正相关关系，随着时间增长活性显著加强；在CK条件下在0d和6d使用T9与T0处理对SOD活性影响不大，但在3d时T9处理后SOD活性较T0处理升高17.52％；在D条件下3d和6d时T9处理SOD活性较T0处理分别升高20.12％和10.73％；6d时T9处理SOD活性较3d时无明显差异，但6d时T0处理SOD活性较3d时升高8.59％；在S条件下3d时T9处理SOD活性较T0处理升高7.75％，3d时T9处理和T0处理SOD活性相差不大；不同处理POD活性随时间变化而先升高后降低，除T9处理S条件外，其他处理POD活性在3d到6d变化不明显；在CK条件下在0d和6d使用T9与T0处理对POD活性影响不大，但在3d时T9处理后POD活性较T0处理升高5.58％；D条件下3d和6d时T9处理POD活性较T0处理分别升高4.48％和6.31％；S条件下3d时T9处理POD活性较T0处理升高4.83％，6d时T9与T0处理对POD活性影响不大；在CK条件下0d使用T9与T0处理对CAT活性影响不大，但在3d和6d时T9处理CAT活性较T0处理分别升高9.74％和3.61％；在D条件下3d和6d时T9处理CAT活性较T0处理分别升高5.66％和2.74％，且在3d到6d各处理变化不明显；在S条件下3d和6d时T9和T0处理CAT活性相差不大。

综上可知，在D和S条件下，T0处理种子的萌发指标较CK条件相比均有所下降；幼苗中的可溶性蛋白、MDA含量以及抗氧化酶活性均有所增加，并随胁迫程度严重而逐渐升高；此外，随胁迫时间增长和胁迫程度加深，幼苗中的可溶性蛋白、MDA含量以及抗氧化酶活性大致呈现先升高后降低的趋势；胁迫条件下T9处理则在一定程度上提高了种子的萌发指标，但其仍低于CK条件下T9处理后的萌发指标；在各个阶段，T9处理幼苗中可溶性蛋白、MDA含量以及抗氧化酶活性较T0处理水平有所增加；说明采用T9处理可以缓解逆境胁迫对种子的伤害，提高幼苗的抗逆性。

5、结论

(1)不同组合配比T9处理，即500mg/Lγ-PGA、10mg/L 5-ALA、10mmol/L GABA、10mg/L复硝酚钠试剂组合引发效果显著优于其他组合，其可溶性蛋白含量和POD、SOD和CAT活性也显著高于T0处理，对种子萌发和幼苗生长存在促进作用。

(2)在干旱胁迫和盐胁迫下，未处理白菜种子的萌发指标较CK条件发芽指数下降；幼苗中的可溶性蛋白、MDA含量以及抗氧化酶活性均有所增加，并随胁迫程度严重而逐渐升高；此外，随胁迫时间延长，幼苗中的可溶性蛋白、MDA含量以及抗氧化酶活性还大致呈现先升高后降低的趋势；在干旱和盐胁迫处理下尽管采用T9处理种子萌发指标仍低于无胁迫处理下引发处理后的萌发指标，但在一定程度上提高了种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数，其各项萌发指标高于无胁迫条件下未处理的萌发指标；幼苗中可溶性蛋白、MDA含量以及抗氧化酶活性较未处理水平有所增加；说明采用T9处理可以缓解逆境胁迫对种子的伤害，提高幼苗的抗逆性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。