荔枝核皂苷在制备治疗脂肪肝药物中的应用

摘要

本发明公开了荔枝核皂苷在制备治疗脂肪肝药物中的应用，属于医药技术领域。本发明具体公开了荔枝核单体Arjunglucoside I在制备治疗非酒精性脂肪肝炎药物中的应用。本发明通过试验验证了，荔枝核单体Arjunglucoside I作为激活剂激活SIRT6‑Nrf2通路，实现治疗非酒精性脂肪肝的作用，这为临床上开发治疗非酒精性脂肪肝炎的新药物提供了方向和依据，为非酒精性脂肪肝炎的治疗提供了数据支持。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种荔枝核皂苷在制备治疗脂肪肝药物中的应用。

背景技术

脂肪肝(fatty liver)是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。而非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。非酒精性脂肪肝在临床上非常常见，也有很多用于治疗该病的药物，比如烯磷脂酞胆碱、维生素E、水飞蓟素等，但是并没有哪种药能够有效的根治非酒精性脂肪肝，所以亟需开发新的药物以用于该病的治疗。

荔枝核为荔枝的干燥成熟种子，其内含有多种成分，主要有皂苷、黄酮、多糖、脂肪酸等。有研究记载，荔枝核可用于降血糖、降血脂、提高抗氧化功能、抑制病毒表面抗原的作用。而目前荔枝核提取物在临床上已用于糖尿病及代谢综合征中，并且能够取得有效的治疗效果，对糖尿病患者的治疗带去福音。但是，目前还没有将荔枝核提取物用于非酒精性脂肪肝炎上的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种荔枝核皂苷在制备治疗脂肪肝药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，荔枝核皂苷作为激活剂激活SIRT6-Nrf2通路，实现治疗非酒精性脂肪肝的作用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供荔枝核皂苷在制备治疗脂肪肝药物中的应用。

优选的是，所述荔枝核皂苷包括荔枝核单体Arjunglucoside I。

优选的是，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝炎。

优选的是，所述荔枝核单体Arjunglucoside I作为激活剂激活SIRT6-Nrf2通路，实现治疗非酒精性脂肪肝的作用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明在细胞水平和动物水平上，通过试验验证了，荔枝核单体ArjunglucosideI改善非酒精性脂肪肝炎(NAFLD)的作用及机制，明确了荔枝核单体Arjunglucoside I作为激活SIRT6-Nrf2轴的有效激活剂，改善了非酒精性脂肪肝炎的作用和物质基础，起到治疗非酒精性脂肪肝炎的作用。本发明明确了荔枝皂苷治疗非酒精性脂肪肝炎的作用机理，这为开发用于非酒精性脂肪肝炎的治疗手段提供了方向和依据。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1.荔枝核提取物改善NAFLD的物质基础

1.1荔枝核提取成分鉴定：

采用课题组已获授权专利(郭洁文，钟世顺，叶碧波，一种荔枝核有效部位群提取物的制备方法，2013-04-24，中国，ZL201210012522.4；郭洁文，邓志军，曲喜玲，测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法，2015-08-05，中国，ZL20131079692.7)方法，鉴定荔枝核皂苷提取物成分。

1.2荔枝核提取物改善NAFLD的作用及物质基础

(1)6w龄正常野生型小鼠，采用灌胃给药方式给予荔枝核皂苷提取物，分对照组、高剂量组(1g/kg)、中剂量组(0.5g/kg)、低剂量组(0.25g/kg)。采集血清，检测ALT、AST等指标，检测不同剂量肝脏毒性；检测小鼠体重、进食、能量代谢、血清甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、FFA、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性等指标。取材后，比较肝比体重、肝脏HE和油红、肝脏甘油三酯含量等指标变化。利用代谢组联合转录组、菌群测序等(均按照常规方法测定)，分析荔枝核皂苷提取物对正常小鼠代谢指标影响的物质基础。

(2)6w龄正常野生型小鼠高脂刺激12w后分组，采用灌胃给药方式给予荔枝核皂苷提取物，分对照组、高剂量组(1.0g/kg)、中剂量组(0.5g/kg)、低剂量组(0.25g/kg)。采集血清，检测ALT、AST等指标，检测不同剂量肝脏毒性；检测小鼠体重、进食、能量代谢、血清TG、TC、FFA、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性等指标。取材后，比较肝比体重、肝脏HE和油红、肝脏甘油三酯含量等指标变化；利用代谢组联合转录组、菌群测序等，分析荔枝核皂苷提取物对HFD小鼠代谢指标影响的物质基础。

通过上述试验说明荔枝核皂苷提取物能够改善NAFLD，因此本发明具体以荔枝核单体Arjunglucoside I为例，研究了该荔枝核单体在细胞水平和动物水平上的药理作用。以下将以具体实施例的方式对其具体作用机理进行更详细的说明。

实施例2

1.荔枝核单体Arjunglucoside I(简写：Arj I)对NAFLD的治疗作用

(1)细胞水平

以野生型小鼠肝脏原代细胞为研究对象，1640培养基培养6h换液后：①给予不同浓度Arj I(0-1mM)处理，利用CCK8试剂盒检测细胞活力以确定不同浓度Arj I的肝细胞毒性。②利用油酸和棕榈酸[OA(300μM)&PA(100μM)]联合刺激24h造模后给予上述安全浓度范围内多个浓度Arj I处理24h，利用油红实验直接观察肝脏细胞中脂质堆积情况、提取肝脏细胞检测甘油三酯含量、提取肝脏细胞蛋白和RNA利用qPCR、WB检测PPARα、SREBP-1c等脂代谢关键基因变化(测试方法均按照常规方法测定)。

(2)动物水平

6w龄正常野生型小鼠或HFD刺激12w的HFD小鼠，采用腹腔注射方法给予5mg/kg/day、10mg/kg/day、20mg/kg/day Arj I和生理盐水处理4w，检测小鼠体重、进食、能量代谢、血清TG、TC、FFA、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性等指标。取材后，比较肝比体重、肝脏HE和油红、肝脏甘油三酯含量等指标变化；提取肝脏蛋白和RNA利用qPCR、WB检测PPARα、SREBP-1c等脂代谢关键基因变化；小动物活体成像方法检测小鼠肝脏中ROS变化及电镜观察肝脏线粒体状态，检测相关基因变化。

(3)机制研究

以上述Arj I处理的各组肝脏组织为研究对象，利用转录组结合蛋白质组等组学方法筛选并分析Arj I调控的关键基因及通路，利用qPCR、WB、免疫荧光、CoIP等常规实验方法加以验证。

2.鉴定Sirt6对荔枝核单体Arjunglucoside I治疗效果的介导作用

(1)细胞水平

以Sirt6特异性敲除小鼠肝脏原代细胞为研究对象，1640培养基培养6h换液：①给予不同浓度Arj I(0-100μM)处理，利用CCK8试剂盒检测细胞活力确定SIRT6对不同浓度ArjI肝细胞毒性影响。②利用油酸和棕榈酸[OA(300μM)&PA(100μM)]联合刺激24h造模后给予上述安全浓度范围内多个浓度Arj I处理24h后，利用油红实验直接观察肝脏细胞中脂质堆积情况、提取肝脏细胞检测甘油三酯含量、提取肝脏细胞蛋白和RNA，利用qPCR、WB检测PPARα、SREBP-1c等脂代谢关键基因变化。

(2)机制研究

Arjunglucoside I-SIRT6蛋白结合能力。合成SIRT6蛋白和突变SIRT6蛋白，在磷酸盐缓冲液中用NT-647-NHS荧光染料对SIRT6蛋白进行定量荧光标记(使用Monolith NTProtein Labelling Kit，按说明书进行)，确保SIRT6蛋白浓度恒定在100nmol/L，相同缓冲液稀释激素，Arj I浓度分别为0.1-100μmol/L，将标记的SIRT6溶液与不同浓度Arj I按1：1(v/v)混合，10min后，利用NT.115毛细管(NanoTemper Technologies，Munich，Germany)填充反应溶液，随即在LED功率50％和40％微泳热泳动仪(MST)功率下测量热泳。使用NTA分析软件(NanoTemper)确定解离常数(Kd)，测定Arj I与SIRT6分子结合情况。

构建Arjunglucoside I-biotin，通过体外磷酸盐缓冲液中进行ArjunglucosideI与SIRT6蛋白孵育，采用pull-down实验、MALDI-TOF/MS等测定Arjunglucoside I-SIRT6相互作用，并鉴定结合位点。利用点突变方法，构建特定位点突变的SIRT6蛋白，验证单体-蛋白结合能力显著下降。

采用小鼠原代肝细胞和Sirt6特异性敲除小鼠肝脏原代细胞为研究对象，1640培养基培养6h换液后，给予不同浓度Arj I(0-100μM)处理，利用qPCR、WB、免疫荧光、CoIP等实验方法检测Arj I对脂代谢相关基因调控作用是否依赖于SIRT6。

(3)动物水平

以肝脏组织特异性敲除Sirt6敲除小鼠为研究对象。采用腹腔注射方法给予5mg/kg/day、10mg/kg/day、20mg/kg/day Arj I和生理盐水处理4w，检测小鼠体重、进食、能量代谢、血清TG、TC、FFA、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性等指标。取材后，比较肝比体重、肝脏HE和油红、肝脏甘油三酯含量等指标变化；提取肝脏蛋白和RNA利用qPCR、WB检测PPARα、SREBP-1c等脂代谢关键基因变化；小动物活体成像方法检测小鼠肝脏中ROS变化及电镜观察肝脏线粒体状态，检测相关基因变化。

3.探索氧化应激关键因子Nrf2介导Arjunglucoside I-Sirt6效应作用及机制

(1)以野生型和Sirt6特异性敲除小鼠肝脏原代细胞为研究对象，给予不同浓度Arj I处理，通过免疫荧光、核质分离-WB，Co-IP等实验方法研究Arj I对SIRT6-Nrf2互作、Nrf2表达及Nrf2细胞核移位影响和SIRT6依赖性。

(2)以Nrf2敲除小鼠肝脏原代细胞为研究对象，1640培养基培养6h换液后：

①给予不同浓度Arj I(0-1mM)处理，利用CCK8试剂盒检测细胞活力以确定Nrf2对不同浓度Arj I肝细胞毒性影响。

②利用油酸和棕榈酸[OA(300μM)&PA(100μM)]联合刺激24h，造模后给予上述安全浓度范围内多个浓度Arj I处理24h后，利用油红实验直接观察肝脏细胞中脂质堆积情况、提取肝脏细胞检测甘油三酯含量、提取肝脏细胞蛋白和RNA，利用qPCR、WB检测PPARα、SREBP-1c等脂代谢关键基因变化。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。