一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法

摘要

本发明公开了一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法，包括：将枯草芽孢杆菌发酵液离心得到枯草芽孢杆菌发酵上清液；采用乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系；将枯草芽孢杆菌发酵上清液加入到双水相萃取体系，调节双水相萃取体系pH为2‑8，搅拌混合均匀，静置萃取分相，收集上相萃取液；向上相萃取液中加入其体积1‑3倍的乙醇，析出硫酸铵沉淀，将硫酸铵沉淀过滤，收集滤液；滤液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后，得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物。与现有技术相比，本发明提取速度快，抗菌脂肽类化合物的收率高，且萃取后的乙醇和硫酸铵可循环使用，不会造成环境污染问题。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法。

背景技术

抗菌脂肽类化合物是芽孢杆菌在生长过程中通过非核糖体途径产生的一类天然蛋白类抗菌物质，因具有无毒、无残留、无抗药性等特点，使其作为有潜力的抗生素替代品受到国内外广泛关注。目前为止，人们研究比较透彻的抗菌脂肽类化合物主要有芬荠素(Fengycin)、表面活性素(Surfaction)和伊枯草菌素(Iturin)三大类，其大多是低分子量的(300-3000Da)脂肽类化合物，具有毒性小、可被降解、不污染环境和耐酸碱等独特的理化特性。

经研究表明，芬荠素是一类抗真菌抑制剂，可用于治疗皮肤真菌病，由于它具有广谱抗真菌性、低毒和低变态反应等特点,使其成为了一种极具价值的抗真菌药物。表面活性素是一种能降低表面张力的两亲性分子，具有乳化、洗涤、杀菌、润湿、分散、低刺激性和高皮肤相容性等特性，广泛应用在日用品和化妆品领域，比如洗面奶、洗发水和牙膏等。伊枯草菌素是一种具有环脂肽结构的两亲化合物,由非极性的脂肪酸链通过结合极性的氨基酸脂肪链组成，具有表面活性、溶血、抗真菌、抗肿瘤等作用以及独特的多重耐药能力。伊枯草菌素也是最早发现的具有抗菌活性的抗生素之一，其同系物杆菌霉素D(Bacillomycin D)对黄曲霉等霉菌具有显著的抑制作用，也是目前唯一从微生物中得到且对黄曲霉具有显著抑制作用的活性物质。此外，抗菌脂肽类化合物在生物医学、水产养殖、食品防腐、分子探针等领域也具有潜在的应用价值。

目前有关抗菌脂肽类化合物的提取工艺，大多采用酸化沉淀、有机溶剂萃取、吸附法和泡沫分离法等提取工艺，这些提取工艺一般都需要花费很长的时间。而且，酸化沉淀需要使用大量的酸，不仅污染环境、还需进行后续处理增大生产成本；有机溶剂萃取使用大量有毒试剂对人体和环境危害极大。因此，迫切需要一种工艺简单易行，适合工业化生产，快速分离抗菌脂肽的方法。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种提取速度快、收率高的提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法，包括以下步骤：

S1、枯草芽孢杆菌发酵培养，将枯草芽孢杆菌发酵液离心得到枯草芽孢杆菌发酵上清液；

S2、采用乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系，其中双水相萃取体系中乙醇的体积分数为20-40％，硫酸铵的质量分数为10-30％；

S3、将枯草芽孢杆菌发酵上清液加入到双水相萃取体系得到混合液，调节双水相萃取体系pH为2-8，所述混合液中枯草芽孢杆菌发酵上清液的体积分数为50-70％，搅拌混合均匀，静置萃取分相，收集上相萃取液；

S4、向上相萃取液中加入其体积1-3倍的乙醇，析出硫酸铵沉淀，将硫酸铵沉淀过滤，收集滤液；

S5、将步骤S4中的滤液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后，得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物。

进一步地，所述步骤S1中枯草芽孢杆菌发酵培养所用的发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，磷酸氢二钾5.0g，其余为水，所述发酵培养基的pH为7.0。

进一步地，所述步骤S1中，枯草芽孢杆菌发酵液离心是在转数为8000r/min的离心机中进行固液分离，离心时间10min。

进一步地，所述步骤S3中，萃取温度为20-40℃，搅拌时间为10-20min，搅拌机转速为100-200rpm，静置分相时间为10-30min。

优选地，所述步骤S5中，旋转蒸发仪温度为60℃，压力为0.1Mpa。

优选地，所述步骤S2中，双水相萃取体系中乙醇的体积分数为35％，硫酸铵的质量分数为20％，双水相萃取体系的pH为6。

本发明的原理为：采用了双水相萃取技术，选择乙醇/硫酸铵体系作为成相组分，乙醇/硫酸铵体系能提供正负离子，影响溶液中正负离子在两相间的分配，进而改变分配系数，从而影响抗菌脂肽在两相间的选择性分配，同时使用乙醇作为成相组分，能有效降低乳化现象，成相后的滤液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后，得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明与现有抗菌脂肽类化合物提取技术相比，可保持生物活性物质的活性及构象，在天然产物提取方面具有广阔的应用前景。

本发明避免了挥发性有机溶剂的使用，提取速度快，抗菌脂肽类化合物的收率高，且萃取后的乙醇和硫酸铵可循环使用，不会造成环境污染问题。

本发明无需特殊设备，易于连续化操作，生产成本低，适合不同规模的工业化生产要求。

附图说明

图1为硫酸铵(质量分数为20％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))。

图2为硫酸铵(质量分数为25％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))。

图3为硫酸铵(质量分数为30％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))。

图4为不同pH双水相萃取体系对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))。

图5为双水相萃取枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物的高效液相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1

(1)使用发酵培养基发酵培养枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌发酵液，所用发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，磷酸氢二钾5.0g，其余为水，所述发酵培养基的pH为7.0；枯草芽孢杆菌发酵液在8000rpm离心10min，除去沉淀的菌体，收集上清液备用；

(2)按比例向步骤(1)制备的发酵上清液中少量多次添加硫酸铵，磁力搅拌至硫酸铵完全溶解，再缓慢流加乙醇，使得双水相萃取体系总体积为100mL。其中硫酸铵的质量分数为20％，乙醇的体积分数分别为20％、25％、30％、35％、40％，建立双水相萃取体系，调节双水相萃取体系的pH为7，室温下磁力搅拌10min，静置分相15min，抗菌脂肽类化合物溶解于上相；分液去除下相盐溶液，保留上相萃取液。

(3)将步骤(2)得到的上相萃取液加入3倍体积的乙醇，有硫酸铵沉淀析出；将硫酸铵沉淀过滤，滤液在60℃、0.1Mpa下减压旋蒸，蒸干乙醇和水，即得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物产品。

图1为硫酸铵(质量分数为20％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响，由图1可知，硫酸铵和乙醇的浓度对抗菌脂肽类化合物的收率具有一定的影响，其中当硫酸铵的质量分数为20％，乙醇的体积分数为35％时为最佳的萃取体系，此时抗菌脂肽类化合物的萃取率达到91.78％。

实施例2

(1)使用发酵培养基发酵培养枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌发酵液，所用发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，磷酸氢二钾5.0g，其余为水，所述发酵培养基的pH为7.0；枯草芽孢杆菌发酵液在8000rpm离心10min，除去沉淀的菌体，收集上清液备用；

(2)按比例向步骤(1)制备的发酵上清液中少量多次添加硫酸铵，磁力搅拌至硫酸铵完全溶解，再缓慢流加乙醇，使得双水相萃取体系总体积为100mL。其中硫酸铵的质量分数为25％，乙醇的体积分数分别为20％、25％、30％、35％、40％，建立双水相萃取体系，调节双水相萃取体系的pH为7，室温下磁力搅拌10min，静置分相15min，抗菌脂肽类化合物溶解于上相；分液去除下相盐溶液，保留上相萃取液。

(3)将步骤(2)得到的上相萃取液加入3倍体积的乙醇，有硫酸铵沉淀析出；将硫酸铵沉淀过滤，滤液在60℃、0.1Mpa下减压旋蒸，蒸干乙醇和水，即得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物产品。

图2为硫酸铵(质量分数为25％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))，由图2可知，硫酸铵和乙醇的浓度对抗菌脂肽类化合物收率具有一定的影响，其中当硫酸铵的质量分数为25％，乙醇的质量分数为30％时为最佳的萃取体系，此时抗菌脂肽类化合物的萃取率为87.12％。

实施例3

(1)使用发酵培养基发酵培养枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌发酵液，所用发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，磷酸氢二钾5.0g，其余为水，所述发酵培养基的pH为7.0；枯草芽孢杆菌发酵液在8000rpm离心10min，除去沉淀的菌体，收集上清液备用；

(2)按比例向步骤(1)制备的发酵上清液中少量多次添加硫酸铵，磁力搅拌至硫酸铵完全溶解，再缓慢流加乙醇，使得双水相萃取体系总体积为100mL。其中硫酸铵的质量分数为30％，乙醇的体积分数分别为20％、25％、30％、35％、40％，建立双水相萃取体系，调节双水相萃取体系的pH为7，室温下磁力搅拌10min，静置分相15min，抗菌脂肽类化合物溶解于上相；分液去除下相盐溶液，保留上相萃取液；

(3)将步骤(2)得到的上相萃取液加入3倍体积的乙醇，有硫酸铵沉淀析出；将硫酸铵沉淀过滤，滤液在60℃、0.1Mpa下减压旋蒸，蒸干乙醇和水，即得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物产品。

图3为硫酸铵(质量分数为30％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))，由图3可知，硫酸铵和乙醇的浓度对抗菌脂肽类化合物收率具有一定的影响，其中当硫酸铵的质量分数为30％，乙醇的体积分数为25％时为最佳的萃取体系，此时抗菌脂肽类化合物的萃取率为83.86％。

由实施例1、实施例2、实施例3得出的抗菌脂肽类化合物的萃取率可知，在其他条相同的情况下，当硫酸铵的质量分数为20％，乙醇的体积分数为35％时为最佳的萃取体系，此时抗菌脂肽类化合物的萃取率最高。

实施例4

(1)使用发酵培养基发酵培养枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌发酵液，所用发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，磷酸氢二钾5.0g，其余为水，所述发酵培养基的pH为7.0；枯草芽孢杆菌发酵液在8000rpm离心10min，除去沉淀的菌体，收集上清液备用；

(2)按比例向步骤(1)制备的发酵上清液中少量多次添加硫酸铵，磁力搅拌至硫酸铵完全溶解，再缓慢流加乙醇，使整个双水相萃取体系总体积为100mL。其中硫酸铵的质量分数为20％，乙醇的体积分数分别为35％，建立双水相萃取体系；

(3)调节步骤(2)制备的乙醇/硫酸铵双水相萃取体系的pH在2～8之间，磁力搅拌10min，静置分相15min，抗菌脂肽类化合物溶解于上相，分液去除下相盐溶液，保留上相萃取液；

(4)将步骤(3)得到的上相萃取液加入3倍体积的乙醇，有硫酸铵沉淀析出；将硫酸铵沉淀过滤，滤液在60℃、0.1Mpa下减压旋蒸，蒸干乙醇和水，即得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物产品。

图4为不同pH双水相萃取体系对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))，由图4可知，双水相萃取体系的pH对抗菌脂肽类化合物收率具有一定的影响，其中当整个体系的pH为6时为最佳的萃取体系，此时抗菌脂肽类化合物的萃取率为94.34％。

因此，结合实施例1、实施例2、实施例3、实施例4，可知：在其他条相同的情况下，当硫酸铵的质量分数为20％，乙醇的体积分数为35％，pH为6.0时为最佳的双水相萃取体系，此时抗菌脂肽类化合物的萃取率最高。

实施例5

(1)使用发酵培养基发酵培养枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌发酵液，所用发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，磷酸氢二钾5.0g，其余为水，所述发酵培养基的pH为7.0；枯草芽孢杆菌发酵液在8000rpm离心10min，除去沉淀的菌体，收集上清液备用；

(2)按比例向步骤(1)制备的发酵上清液中少量多次添加硫酸铵，磁力搅拌至硫酸铵完全溶解，再缓慢流加乙醇，使整个双水相萃取体系总体积为100mL。其中硫酸铵的质量分数为20％，乙醇的体积分数分别为35％，建立双水相萃取体系；

(3)调节步骤(2)制备的乙醇/硫酸铵双水相萃取体系的pH在6之间，磁力搅拌10min，静置分相15min，抗菌脂肽类化合物溶解于上相，分液去除下相盐溶液，保留上相萃取液；

(4)将步骤(3)得到的上相萃取液加入3倍体积的乙醇，有硫酸铵沉淀析出；将硫酸铵沉淀过滤，滤液在60℃、0.1Mpa下减压旋蒸，蒸干乙醇和水，即得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物产品，本实施例中抗菌脂肽类化合物的萃取率为94.34％。

进一步，为了比较本发明提取抗菌脂肽类化合物的方法与现有提取方法的优势，以实施例5为例，设计对比例1进行比较。

对比例1

已有酸化沉淀提取抗菌脂肽类化合物的方法：取发酵上清液1L，使用6moL/L的稀盐酸调节发酵上清液的pH至2.0，搅拌均匀，4℃静置12h，8000rpm离心10min，收集沉淀；再用甲醇浸提，抽滤得到滤液，40℃减压旋蒸，烘干后称重，得到抗菌脂肽类化合物产品。

实施例5与对比例1提取抗菌脂肽类化合物质量的比较结果见表1。

表1

由表1可知，利用酸化沉淀法提取抗菌脂肽类化合物的产量为0.61g/L，而采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取，抗菌脂肽类化合物的产量达到0.93g/L，收率提高52.46％。

取实施例5提取的枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物进行高效液相色谱分析：

(1)取10mg抗菌脂肽类化合物产品，加入1mL色谱级的甲醇使其完全溶解，取700μL加500μL超纯水，过0.22μm有机滤膜。

(2)抗菌脂肽类化合物高效液相色谱检测条件为：采用C18(4.6×250mm UnitaryC18柱)柱，流动相为乙腈和水，检测波长为200nm，流速为1mL/min。采用梯度洗脱方式，其中乙腈由5％逐步增加到95％。

双水相萃取枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物的高效液相色谱图如图5所示，从图5可知，高效液相色谱在0～4min内出现的吸收峰为溶剂峰；16～20min内出现两个强吸收峰，经LC-MS分析鉴定其主要成分为伊枯草菌素中的杆菌霉素D的C14-C15同系物；23～28min内出现较多的吸收峰，经鉴定主要为溶杆菌素、芬荠素和伊枯草菌素。通过峰面积归一化法计算可得，脂肽类化合物的峰团占总面积超过90％，且杆菌霉素D的峰团占脂肽类化合物总峰团面积的一半以上，这有利于杆菌霉素D的进一步分离纯化。

为了验证本发明提取的枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物对不同指示菌的抑制效果，以下进行抑菌谱测定：

称取实施例5制备的抗菌脂肽类化合物产品10mg，加无菌水溶解，配成10mg/mL的抗菌脂肽溶液备用。选取食品和水产养殖过程等常见的致病菌作为指示菌，采用牛津杯法测定抗菌脂肽类化合物对其抑菌活性。指示菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和霉菌。抗菌脂肽类化合物对不同指示菌的抑制效果见表2。

表2

表2中：-，表示无抑菌效果；+，表示抑菌圈直径＜10mm；++，表示抑菌圈直径10-15mm；+++，表示抑菌圈直径＞15mm。

由表2可知，抗菌脂肽类化合物对腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、溶壁微球菌和黄曲霉有良好的抑制作用，展现了其在食品、饲料和水产养殖等领域均有应用前景。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。