一种分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白及其用途

摘要

本发明公开了一种分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白及其用途，所述重建胶原蛋白分子结构具有三螺旋构象，圆二色谱分析在波长220±10nm处有正峰；分子量分布呈多分散特性，其相对分子质量范围为1KD～300KD；本发明公开的重建胶原蛋白结构保留了典型胶原蛋白分子的生物活性，既具有高分子量胶原蛋白保湿、美白、营养、修复等特性，又赋予低分子量特有溶解性及渗透性等新功能，实验发现能渗透皮肤组织，重建胶原蛋白可应用于美容和皮肤修复领域。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗美容技术领域，特别是一种分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白、组合物及其用途。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，皮肤的角质层覆盖着生物体并进行着水分的保持及防护外界异物的入侵。皮肤的天然屏障指由角质层细胞和细胞之间的“脂质”和“天然保湿因子”组成的“砖墙结构”，其表面附有“皮脂膜”，由此共同形成了一道人体天然保护屏障。皮肤屏障不仅阻止了病原体的入侵，而且对角质层、角质形成细胞结构组成及免疫细胞抗原的介导进行了整合。皮肤的屏障功能具有双向性，一方面保护机体内各种器官和组织免受外界环境中机械、物理、化学和生物的有害因素的侵袭而引发疾病，另一方面防止体内的各种营养物质、水分、电解质和其他物质的丧失，维持皮肤的含水量，使皮肤滋润。由于皮肤的屏障作用使外界环境中的物质很难通过皮肤。

胶原蛋白是动物结缔组织细胞外基质的主要成分，存在于多种组织与器官中，如动物皮肤、骨骼、肌腱、心包等。胶原蛋白是细胞外的结构蛋白，它不仅为细胞提供了营养代谢的场所,也影响细胞的形态结构、细胞运动及生长代谢。胶原蛋白分子结构特征是具有三螺旋结构，由3条左手螺旋链相互缠绕拧成一股紧密的右手螺旋结构，其分子非常稳定。迄今为止已发现20多种不同类型的胶原蛋白。Ⅰ型胶原是动物体内含量最多的一类胶原蛋白，其在组织工程领域的应用也最为广泛。不同类型的胶原蛋白的氨基酸组成大致相同，只因来源和类型不同而有所差异。分子生物学的不断发展，使人们逐渐认识到胶原蛋白良好的物理性能和生物学特性，并将其广泛应用于生物医学、材料、化工、食品及农业等领域。

分子量及其分布直接影响着生物高分子的生物学效应。大分子的胶原分子可以通过体外重建成胶原纤维，因此具有良好的细胞相容性和促进血小板凝聚等生理功能；明胶的分子量稍小，可以部分重建胶原分子的三螺旋结构，因此也能用于止血；而更小分子量的胶原蛋白肽组成复杂，一些特殊多肽发挥着不同的作用。文献研究也发现较高分子量的胶原多肽在小鼠动物实验中表现出止血、促凝血和促进外伤愈合的功能；而较低分子量的胶原多肽则对烫伤修复有显著的促进作用。可见胶原蛋白的分子量及其分布与其具有的生理功能具有重要联系。因此，针对皮肤和生物高分子的特性，急需开发一种具有胶原蛋白的生物活性及良好水溶性与渗透性的重建胶原蛋白。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种具有三螺旋构象、分子量分布呈多分散特性的重建胶原蛋白；

本发明的另一目的在于提供此种重建胶原蛋白的用途，重建胶原蛋白可应用于美容和皮肤修复领域。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白，所述重建胶原蛋白分子结构具有三螺旋构象，圆二色谱分析在波长220±10nm处有正峰；分子量分布呈多分散特性，其相对分子质量范围为1KD～300KD。

进一步地，所述重建胶原蛋白由哺乳动物组织制备而成。动物组织通过一系列生物化学反应及单元过程得到本发明的重建胶原蛋白。

作为优选方案，所述的动物组织为皮肤、肌腱、骨骼、心包或腹膜。

进一步地，所述重建胶原蛋白蛋白质含量不小于90 g/100g。

进一步地，所述重建胶原蛋白中羟脯氨酸含量不小于3.0 g/100g。

进一步地，所述重建胶原蛋白在37℃±1℃的水中完全溶解时间不大于10min。

一种组合物，包含上述的重建胶原蛋白。

本发明所述的重建胶原蛋白在美容和皮肤修复领域中的应用。

进一步地，所述重建胶原蛋白能渗透皮肤组织。

进一步地，包括美容制品和皮肤修复制品，所述美容制品包括皮肤保湿品、皮肤营养品或皮肤美白品。

本发明所述的美容制品和皮肤修复制品，除含有本发明所述的重建胶原蛋白外，还含有化妆品学上可接受的辅料，所述制品可以是霜、喷雾、面膜、凝胶、露、乳液等。

本发明具有以下优点：本发明公开了一种重建胶原蛋白，该重建胶原蛋白结构既保留典型胶原蛋白三螺旋构象又具有分子量呈多分散分布的特点，本发明公开的重建胶原蛋白结构保留了典型胶原蛋白分子的生物活性，既具有高分子量胶原蛋白保湿、美白、营养、修复等特性，又赋予低分子量特有溶解性及渗透性等新功能，实验发现能渗透皮肤组织，重建胶原蛋白可应用于美容和皮肤修复领域。

附图说明

图1为胶原蛋白圆二色谱图，其中，A为典型大分子胶原蛋白，B为本发明重建胶原蛋白。

图2为本发明重建胶原蛋白相对分子量范围分布图。

图3为本发明重建胶原蛋白小鼠皮肤渗透双光子共聚焦显微照片，其中，图3-1、3-2分别为阴性对照皮肤单层图像和全层图像；图3-3、3-4分别为阳性对照皮肤单层图像和全层图像；图3-5、3-6分别为市售重组胶原多肽对照品的皮肤单层图像和全层图像；图3-7、3-8分别为本发明重建胶原蛋白涂抹1h皮肤单层图像和全层图像；图3-9、3-10分别为本发明重建胶原蛋白涂抹2h皮肤单层图像和全层图像。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：

一种具有三螺旋结构的分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白，采用符合法规要求的哺乳动物皮肤经一系列生化反应及单元过程制备而成，主要成分为胶原蛋白，蛋白质含量为91(g/100g)，羟脯氨酸含量为3.5(g/100g)，相对分子质量范围为1KD～300KD，圆二色谱检测在波长220±10nm处有正峰，在37℃±1℃水中的完全溶解时间不大于10min。

实施例2：

一种具有三螺旋结构的分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白，采用符合法规要求的哺乳动物骨骼经一系列生化反应及单元过程提取而成，主要成分为胶原蛋白，蛋白质含量为93(g/100g)，羟脯氨酸含量为4.1(g/100g)，相对分子质量范围为6KD～250KD，圆二色谱检测在波长220±10nm处有正峰，在37℃±1℃水中的完全溶解时间不大于10min。

实施例3：

一种具有三螺旋结构的分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白，采用符合法规要求的哺乳动物心包经一系列生化反应及单元过程提取而成，主要成分为胶原蛋白。蛋白质含量为95(g/100g)，羟脯氨酸含量为3.8(g/100g)，相对分子质量范围为1KD～200KD，圆二色谱检测在波长220±10nm处有正峰，在37℃±1℃水中的完全溶解时间不大于10min。

实施例4：

一种具有三螺旋结构的分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白，采用符合法规要求的哺乳动物腹膜经一系列生化反应及单元过程提取而成，主要成分为胶原蛋白。蛋白质含量为97(g/100g)，羟脯氨酸含量为5.3(g/100g)，相对分子质量范围为6KD～180KD，圆二色谱检测在波长220±10nm处有正峰，在37℃±1℃水中的完全溶解时间不大于10min。

实施例5：

一种具有三螺旋结构的分子量具有多分散特性的重建胶原蛋白，采用符合法规要求的哺乳动物皮肤经一系列生化反应及单元过程提取而成，主要成分为胶原蛋白。蛋白质含量为95(g/100g)，羟脯氨酸含量为5.7(g/100g)，相对分子质量范围为3KD～150KD，圆二色谱检测在波长220±10nm处有正峰，在37℃±1℃水中的完全溶解时间不大于10min。

实施例6：

一种组合物，包含实施例1制备的重建胶原蛋白，其含量为0.1-99%。

实施例7：

一种美容制品，为霜剂，含有实施例2制备的重建胶原蛋白，含量为20%，还含有保湿成分及化妆品学上可接受的辅料。

实施例8：

一种美容制品，为喷雾，含有实施例3制备的重建胶原蛋白，含量为18%，还含有皮肤营养成分及化妆品学上可接受的辅料。

实施例9：

一种美容制品，为面膜，面膜上含有实施例4制备的重建胶原蛋白，含量为55%，还含有美白成分及化妆品学上可接受的辅料。

实施例10：

一种美容制品，为凝胶，含有实施例5制备的重建胶原蛋白，含量为70%，还含有保湿成分及化妆品学上可接受的辅料。

实施例11：

一种美容制品，为露剂，含有实施例2制备的重建胶原蛋白，含量为38%，还含有皮肤营养成分及化妆品学上可接受的辅料。

实施例12：

一种美容制品，为乳液，含有实施例4制备的重建胶原蛋白，含量为85%，还含有皮肤修复成分及化妆品学上可接受的辅料。

实施例13：

一种美容制品，为喷雾，含有实施例1制备的重建胶原蛋白，含量为2%，还含有皮肤保湿成分及化妆品学上可接受的辅料。

实施例14：

一种皮肤修复制品，含有实施例5制备的重建胶原蛋白，含量为99%，还含有皮肤修复成分及化妆品学上可接受的辅料。

以下通过实验说明本发明的有益效果：

1. 圆二色谱实验

实验对象：A-典型大分子胶原蛋白，B-本发明实施例1制备的重建胶原蛋白；

A-典型大分子胶原蛋白采用以下方法制备：

1.新生犊牛皮的前处理

将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切，取200g切细的皮加入醇∶卤代烷＝0.5体积比的混合溶液2000ml，浸泡脱脂，每隔5小时更换一次上述溶液，15小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液2000ml浸泡，5小时更换一次，10小时倒掉；用浓度为20％的乙醇水溶液2000ml清洗一次；再用0.1mol/L EDTA 溶液，pH＝10.5～11.5，于温度4℃浸泡6小时，然后，用超纯水2000ml洗涤3次；再用浓度为10％的NaCl水溶液2000ml浸泡，4小时更换一次，8小时倒掉溶液，用超纯水2000ml清洗2次，再将牛皮置入2000ml超纯水中浸泡过夜，将水倒掉。

2.胃蛋白酶酶解

在上述固体物质中，加入浓度为0.4mol/L的醋酸水溶液2000ml，然后加入湿牛皮∶胃蛋白酶＝2000质量比的胃蛋白酶0.1g，置于温度4℃冰箱中放置5天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液pH＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液pH＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣。

3.盐析

在上述清液加入固体NaCl至浓度为15％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐，或者将上述清液用浓度为0.01mol/L的Na

实验仪器：采用圆二色谱仪；

实验结果：两种蛋白的圆二色谱图如图1所示，从图1可知圆二色谱图显示两种胶原蛋白在198nm左右有较强的负峰，在220nm左右有较弱的正峰，这是典型的胶原蛋白圆二色谱峰。

凝胶渗透色谱实验

实验对象：实施例1制备的重建胶原蛋白；

实验方法：采用流动相0.1N NaN

实验结果：本发明的重建胶原蛋白相对分子量范围分布图如图2所示，其中相对分子质量范围为1KD～300KD。

皮肤渗透实验：

小鼠，体重20±2g，剃去背部毛发后，用脱毛膏将毛发脱除干净；将已荧光标记的本发明实施例1制备的重建胶原蛋白溶液均匀的涂抹于已暴露的小鼠背部皮肤组织，避光，室温条件下待其皮肤自然吸收1h、2h后取下2cm×2cm全层皮肤组织，液氮冷冻；将该组织解冻后置于双光子扫描共聚焦显微镜下进行图像采集，组织做全层z轴扫描，步进5um，观察本发明重建胶原蛋白溶液小鼠皮肤渗透情况。组织胶原蛋白SHG（二次谐波）成像激发波长950nm，采用红色标记，本发明重建胶原蛋白双光子荧光激发波长750nm，采用蓝色标记。同时设置对照组（市售重组胶原多肽，分子量55kDa）、阴性对照（PBS溶液）和阳性对照（荧光染料PBS稀释液）。

实验结果如图3所示，图中，图3-1、3-2分别为阴性对照皮肤单层图像和全层图像；图3-3、3-4分别为阳性对照皮肤单层图像和全层图像；图3-5、3-6分别为市售重组胶原多肽对照品的皮肤单层图像和全层图像；图3-7、3-8分别为本发明重建胶原蛋白涂抹1h皮肤单层图像和全层图像；图3-9、3-10分别为本发明重建胶原蛋白涂抹2h皮肤单层图像和全层图像。由图3可知：

（1）阴性对照只检测到组织胶原蛋白的红色信号，涂抹的PBS溶液未检测到干扰信号，皮肤及其附属物也未检测到干扰信号，说明750nm激发检测双光子荧光信号无干扰；

（2）阳性对照在750nm激发光下检测到与组织胶原蛋白红色信号同层的蓝色荧光信号说明荧光染料PBS稀释液作为阳性对照品可以进入皮肤真皮胶原蛋白层；

（3）对照组样品在涂抹1小时后已经进入皮肤真皮中胶原蛋白层，只有少量浮于表皮层；

（4）本发明重建胶原蛋白在涂抹1小时后只有少量已经进入皮肤真皮中胶原蛋白层，大部分浮于表皮上；在涂抹2小时后进入皮肤真皮中胶原蛋白层的逐渐增多，还有部分浮于表皮上。说明本发明胶原蛋白的低分子量部分能渗透入皮肤真皮层，而高分子量部分在涂抹2小时后仍然保留在皮肤表面。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。