一种利用解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的方法

摘要

本发明涉及紫苏酸生产方法领域，具体公开了解脂耶氏酵母菌利用柠檬烯生成紫苏酸的方法，通过将解脂耶氏酵母菌接种于改良沙保氏培养基中培养，并加入R‑(+)‑柠檬烯，然后转化，离心，萃取后蒸干浓缩，获得紫苏酸。本发明的方法简单，成本低，产量高，获得的紫苏酸为单一构型的，是生物合成的属于天然产物范畴的紫苏酸，具有较高的价值。

说明书

技术领域

本发明涉及紫苏酸生产方法领域，具体涉及一种利用解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的方法。

背景技术

紫苏酸是一种化学物质，分子式是C10H14O2，对于紫苏酸的生产，现有技术中已经有关于微生物可以将(+)-柠檬烯转化生成紫苏酸的相关记载，例如，有研究表明Pseudomonas putida GS1可以将(+)-柠檬烯生成紫苏酸，Arxula adeninivorans CSIR Y-1149和Yarrowia lipolytica CBS 599T均能生成紫苏酸。还有Pseudomonas putida DSM12264，采用流化床离子交换色谱柱进行产物原位分离技术进行连续化转化生产紫苏酸，但是对于能够转化柠檬烯生成紫苏酸的菌株单一，大部分产量也较低，且生产紫苏酸的成本相对较高。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的方法，通过解脂耶氏酵母在一定的条件下对于柠檬烯转化生产紫苏酸，产量高，成本低，工艺简单。

本发明提供了一种利用解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的方法，具体包括如下步骤：

S1，将解脂耶氏酵母菌进行活化和纯化；

所述解脂耶氏酵母菌的菌种保藏编号为CICC 1444；

S2，将纯化后的解脂耶氏酵母菌事先在50mL沙保氏培养基中在 30℃、200rpm下培养24h(OD

所述种子培养基配方为：40g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨，水1000 mL，pH4.0-6.0；

所述发酵培养基配方为：40g/L甘蔗糖蜜，10g/L蛋白胨，水 1000ml，pH4.0-6.0。

进一步地，S2中，解脂耶氏酵母菌接种于种子培养基中的培养条件为于 30℃，200rpm。

进一步地，S2中，解脂耶氏酵母菌接种于发酵培养基中的培养温度为 30℃。

进一步地，S2中，所述R-(+)-柠檬烯事先用等体积无水乙醇溶解。

进一步地，S2中，离心条件为：10,000转/分，离心时间10分钟。

进一步地，萃取过程取等量乙酸乙酯对离心获得的上清液进行萃取。

进一步地，S2中，蒸干浓缩过程具体为：真空度为0.1MPa下，蒸发温度为40℃。

进一步地，S2中，将纯化后的解脂耶氏酵母菌接种于发酵培养基中培养 48h，，转化时间为48h。

本发明还提供了一种由上述方法制备得到的紫苏酸。

本发明还提供了一种所述的紫苏酸在制备抑癌药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明中利用甘蔗糖蜜代替传统的葡萄糖制备培养基，有利于降低成本。

2、本发明中使用的解脂耶氏酵母菌(CICC 1444)能够转化柠檬烯生成紫苏酸的能力没有被发现，且获得的紫苏酸的产量高，获得的紫苏酸为单一构型的，是生物合成的属于天然产物范畴的紫苏酸，具有较高的价值。

3、本发明研究确定了解脂耶氏酵母菌在转化柠檬烯生成紫苏酸时最优的条件，在培养基为100mL，接种量为4％(vol/vol)时，培养时间48h，转化时间48h时紫苏酸产量最高，为407mg/L，远远高于其他条件。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1表示不同碳源对于解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的影响；

图1a表示甘蔗糖蜜作为碳源时解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的产量；

图1b表示葡萄糖作为碳源时解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的产量；

图2表示不同条件对解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的影响；

图2a表示当培养基为50ml，培养时间2d，转化时间2d时解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的产量；

图2b表示当培养基为50ml，培养时间2d，转化时间4d时解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的产量；

图2c表示当培养基为100ml，培养时间2d，转化时间4d时解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的产量；

图3表示采用不同碳源(葡萄糖和甘蔗糖蜜)时应用薄层层析法分析转化产物，其中100和50mL表示培养基体积。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、一种利用解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的方法，包括如下步骤：

S1，首先从冻存管中取解脂耶氏酵母菌在土豆培养基(PDA)中30℃下培养48h，然后通过划线法在PDA平板上转接3-4次完成活化步骤；

所述解脂耶氏酵母的菌种保藏编号为CICC 1444，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心；

S2，然后将所述活化后的解脂耶氏酵母菌事先在50mL种子培养基中于 30℃、200rpm下培养24h(OD

所述种子培养基配方为：40g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨，水1000 mL，pH 4.0-6.0；

所述发酵培养基配方为：40g/L甘蔗糖蜜，10g/L蛋白胨，水 1000mL，pH 4.0-6.0。

二、检测解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的产量

1、培养基碳源对转化的影响

检测实施例1中的紫苏酸的产量，然后将按照实施例1的步骤进行试验，将培养基中的甘蔗糖蜜用等量的葡萄糖替换，检测紫苏酸的产量。检测结果如图1所示。

图3为采用不同碳源(葡萄糖和甘蔗糖蜜)时应用薄层层析法分析转化产物，其中100和50mL表示培养基体积。

图1a为实施例1(甘蔗糖蜜作为碳源)中的解脂耶氏酵母菌转化柠檬烯生成紫苏酸的结果，检测发现，实施例1获得的紫苏酸的产量为407mg/L；

图1b为碳源替换为葡萄糖后生成紫苏酸的结果，结果表明，采用分析纯的葡萄糖和甘蔗糖蜜配置的培养基来培养酵母菌和转化(+)-柠檬烯，其产量区别不大，为366mg/L。

上述结果说明，在利用酵母菌转化柠檬烯生产紫苏酸的时能够用甘蔗糖蜜代替葡萄糖作为酵母菌的碳源，不会影响紫苏酸产量，并且可以降低培养基的制作成本。

2、转化时间和接种量：发酵培养基对转化的影响

按照实施例1中的实验操作步骤，将获得的解脂耶氏酵母菌种子液分别按照相同的接种量(4％)接种入50mL、100mL发酵培养基中，分别按照培养时间+转化时间为：(2d+2d)，(2d+4d)进行培养和转化，其他条件均都与实施例1相同。

本发明实施例1实质上的条件为接种量4％，发酵培养基100mL，培养时间48h，转化时间48h；

实验结果如图2所示，图2a中，培养基为50ml，培养时间2d，转化时间2d时紫苏酸产量为140mg/L；

图2b中，培养基为50ml，培养时间2d，转化时间4d时紫苏酸产量为 80mg/L；

图2c中，培养基为100ml，培养时间2d，转化时间4d时紫苏酸产量为 60mg/L；

因此，接种量与培养基添加量的比例对紫苏酸产量有极大的影响，培养时间和转化时间也对紫苏酸产量有较大影响。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。