一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法

摘要

本发明涉及一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法，将滚环扩增体系与血清混合后加入数字PCR芯片，通过优化血清稀释比例，生成粒径均一，单分散性良好的微液滴，血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中，微液滴作为独立的反应室，在反应室中进行滚环扩增，可直接检测血清标志物的拷贝数，该技术有别于传统的滚环扩增检测方法，能够对待测物质进行绝对定量，因此提高了滚环扩增的灵敏度，并且可直接用于血清标志物的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生化检测和分子诊断领域，具体涉及一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法。

背景技术

等温扩增反应温度单一，不受热循环的限制，因此在实际操作和设备要求上都相较简单，能够实现便携式的标志物快速检测。其中滚环扩增（rolling circleamplification，RCA）是发展最早，同时也是目前为止应用最广的等温扩增检测方法。滚环扩增的模板为环状DNA，该环状DNA与引物结合后，能在具有链置换特性的聚合酶，如phi29聚合酶（phi29 DNA Polymerase）、Phage T7以及Sequence等作用下扩增形成成千上万与其互补的序列。滚环扩增所需的设备简单、特异性高、通量大、反应温度温和，不会破坏生物分子的结构和功能，因此在全基因组检测、单核苷酸多态性分析、免疫分析及微阵列固相检测等方面都有着广阔的应用前景。然而滚环扩增的扩增效率有限，传统的线性滚环扩增在信号放大上存在局限，因此检测灵敏度不尽如人意，往往需要结合其他信号放大机制，例如荧光量子点、纳米电极复合材料等进行联合检测，这大大增加了前期材料准备时间和操作繁琐程度，降低了方法的稳定性和可重复性，不适用于临床。

发明内容

为解决传统的线性滚环扩增检测方法效率较低，无法对复杂体液环境中浓度较低的待测物质进行定量的问题，本发明提供了一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法，包括以下步骤：

（1）将滚环扩增体系与稀释后的血清加入数字PCR芯片，并在芯片对应的加样孔中加入数字PCR配套的液滴生成油，将芯片放置于数字PCR仪中生成微液滴；

（2）将微液滴作为独立的反应室等温孵育，进行滚轮扩增；

（3）通过芯片扫描仪对阳性反应单元进行计数，检测血清标志物的拷贝数。

本发明将滚环扩增体系与血清混合后加入数字PCR芯片，通过优化血清稀释比例，生成数量粒径均一，单分散性良好的微液滴，血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中，微液滴作为独立的反应室，在反应室中进行滚环扩增，可直接检测血清标志物的拷贝数。

作为本发明的一种改进，步骤（1）中，所述血清中血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中。

作为本发明的一种改进，步骤（1）中，所述血清的稀释倍数为50~1250倍。

作为本发明的一种改进，步骤（1）中，所述血清的稀释倍数为200~300倍。

作为本发明的一种改进，步骤（1）中，所述血清的稀释倍数为250倍。

作为本发明的一种改进，步骤（2）中，所述等温孵育的温度为25~37℃，等温孵育的时间为30~90min。

作为本发明的一种改进，所述等温孵育的温度为30℃，等温孵育的时间为45min。

本发明的有益效果为：

本发明将滚环扩增检测方法与数字微液滴技术结合，建立了一种数字滚环扩增检测方法，利用商业化的数字PCR仪生成成千上万个微液滴作为独立反应室，血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中，在反应室中进行滚环扩增，扩增结束后通过商业化的芯片扫描仪对阳性反应单元进行计数。

该方法不依赖于对照样品和标准曲线，可以进行精确的绝对定量检测，相较于传统的滚环扩增检测方法灵敏度和精确性更高，在待测物质浓度极低以及复杂体液环境中具有极大的优势。该技术通过对待测物质进行绝对定量，提高了滚环扩增的灵敏度，并且可直接用于血清标志物的检测。此外，相较于结合其他信号放大机制的联合检测，由于商业化的数字PCR仪稳定性和重复性更高，对操作人员的背景和熟练度要求较低，更适用于临床。

附图说明

图1为血清稀释倍数不同的情况下微液滴荧光成像图，其中，A~D稀释倍数分别依次为10倍、50倍、250倍、1250倍，左列为阳性组，右列为对照组；

图2为等温孵育时间不同的情况下微液滴荧光信号检测结果，其中，A为微液滴荧光信号检测结果，B为微液滴数量；

图3为最优实验条件下阳性组的微液滴荧光共聚焦成像，其中，左图为明场，中图为暗场，右图为明场暗场叠加图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法，将滚环扩增体系与血清混合后加入数字PCR芯片，通过优化血清稀释比例，生成粒径均一，单分散性良好的微液滴，血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中，微液滴作为独立的反应室，在反应室中进行滚环扩增，可直接检测血清标志物的拷贝数。

具体步骤如下：

（1）将滚环扩增体系与稀释后的血清加入数字PCR芯片，生成微液滴；

（2）将微液滴作为独立的反应室等温孵育，进行滚轮扩增；

（3）通过芯片扫描仪对阳性反应单元进行计数，检测血清标志物的拷贝数。

以下结合具体实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

将滚环扩增体系与稀释不同倍数的血清加入数字PCR芯片，生成微液滴；此处检测靶标为粘蛋白1（MUC1）。

分别取1 μL稀释10、50、250、1250倍数的血清，加入滚环扩增体系（0.5 μL探针，1μL环状模板、1 μL第二引物（2 μM）、2 μL 10×Phi 29 DNA聚合酶缓冲液、1 μL Phi 29聚合酶（10U/μL）、1 μL dNTP（10 mM）），加入DEPC处理水补足至20 μL，将上述溶液混合均匀后加入数字PCR芯片的样品槽，并在芯片对应的加样孔中加入75 μL数字PCR配套的液滴生成油，将芯片放置于数字PCR仪中生成微液滴。

其中探针序列为：5’-ATGTACTGCATGCACACCACTTCAACTATGCAGTACAT-3’，该探针能与粘蛋白1结合，并在与粘蛋白1结合的情况下与环状模板结合，充当滚环扩增的引物，当待测物质不存在时则无法与环状模板结合，滚环扩增无法进行。

环状模板序列为：

5’-ACTACGCGACTCTACTAGTTCTATCATTCTCATATGTACTGCATCTCGTTTGGTGGACCTGAATCATGT-3’。

第二引物序列为：5’-TACTAGTTCTATCATTCTCATA-3’。

将血清稀释倍数不同的情况下微液滴荧光成像，如图1所示，左列为阳性组（稀释后的胃癌患者血清），右列为对照组（同等比例稀释的正常人血清），从上到下依次为稀释倍数为10、50、250、1250，结果表明，不同的血清稀释倍数下，阳性和阴性液滴的荧光区别相差不同，低浓度稀释组由于血清比例较高，血清中的成分影响了探针稳定性，导致其在待测物质不存在的情况下也与环状模板结合并开启滚环扩增，导致实验组和对照组液滴均发出强烈荧光，而最高浓度稀释组由于待测物质浓度过低，最终实验和对照组均无荧光，在50倍稀释和1250倍稀释中，实验和对照组液滴荧光信号相差明显，由于50倍稀释中存在个别尺寸较大的液滴，从液滴均一性考虑，最终选择250倍稀释为最优实验条件。

实施例2

（1）将滚环扩增体系与稀释250倍的血清加入数字PCR芯片，生成微液滴（同实施例1）；

（2）将微液滴作为独立的反应室30℃等温孵育0~90min，进行滚轮扩增；

（3）通过芯片扫描仪对阳性反应单元进行计数，检测血清标志物的拷贝数。

等温孵育时间为0、30、45、60、75、90min的情况下微液滴荧光信号检测结果如图2所示，结果表明，随着孵育时间增长，阳性微液滴（即位于虚线上方的微液滴）数量增多，微液滴总数量下降，这是由于商业化的数字PCR仪是针对PCR开发，反应温度与反应缓冲液均与滚环扩增不同，此外血清也对反应体系产生了一定影响，因此时间越长，（W/O）的体系越不稳定，由于微液滴数量对检测方法至关重要，因此综合荧光信号强度和微液滴总量考虑，选择孵育时间45min为最优时间。

图3为最优实验条件下阳性组的微液滴荧光共聚焦成像，从左至右依次为明场、暗场以及明场暗场叠加图，结果表明，实验条件优化后形成的微液滴粒径分布均一，包含标志物的微液滴与不包含标志物的微液滴在暗场下对比明显。

需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。