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检测甘薯单倍型的成套引物在甘薯母系溯源和品种鉴定中的应用

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本发明公开了检测甘薯单倍型的成套引物在甘薯母系溯源和品种鉴定中的应用。本发明发现由甘薯叶绿体基因组DNA的位点1‑8的核苷酸确定的甘薯单倍型H1、H6和H9以及配套成套引物可以对甘薯进行母系溯源和品种鉴定，且检测稳定可靠、简单快速，可用于甘薯品种鉴定和母系溯源，以及甘薯的育种，具有广泛的应用前景。

著录项

公开/公告号CN113801955A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-12-17

原文格式PDF
申请/专利权人湖北省农业科学院粮食作物研究所;
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申请/专利号CN202111079032.1
发明设计人王连军;杨新笋;王崇;柴沙沙;雷剑;宋峥;杨园园;程贤亮;
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申请日2021-09-15
分类号C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101);
代理机构11245 北京纪凯知识产权代理有限公司;
代理人魏少伟
地址 430064 湖北省武汉市洪山区南湖大道3号
入库时间 2023-06-19 13:45:04

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，检测甘薯单倍型的成套引物在甘薯母系溯源和品种鉴定中的应用。

背景技术

甘薯是一种重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物。甘薯种薯的真实性和纯度是衡量种薯质量的重要指标，直接影响甘薯的产量和品质。生产上如何快速、准确鉴定甘薯种薯真实性是一个突出的问题。传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，稳定性差，误鉴率较高。分子标记技术具有丰富的多态性和环境稳定性，且操作简便，已开始广泛应用于作物品种鉴定与纯度检测中。放任授粉和定向杂交是甘薯新品种选育的主要手段，其中通过放任授粉(集团杂交)方式选育的新品种数量也最多。

叶绿体DNA(cpDNA)是植物体内的三大遗传系统之一，与核基因组相比，cpDNA具有分子量小、序列保守、进化缓慢、结构简单和单亲遗传等特点，且不易受外界环境的干扰。叶绿体基因是母系遗传，不同个体间基因的交流和融合很少发生，叶绿体各基因间有很好的共线性。cpDNA中包含的众多保守序列，可为植物的系统分类和条形码提供参考。cpDNA多态性位点的应用拓宽了甘薯可用标记位点，对于甘薯品种鉴定和母系溯源具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何对甘薯进行母系溯源和品种鉴定。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测甘薯单倍型或其基因型的物质在甘薯母系溯源中的应用；

所述甘薯单倍型根据位点1-8的核苷酸确定，位点1为甘薯基因组DNA中对应于序列7的第250位的核苷酸；

位点2为甘薯基因组DNA中对应于序列表中序列12的第83位的核苷酸；

位点3为甘薯基因组DNA中对应于序列表中序列12的第94-96位的核苷酸；

位点4为甘薯基因组DNA中对应于序列表中序列12的第97位的核苷酸；

位点5为甘薯基因组DNA中对应于序列表中序列12的第188-194位的核苷酸；

位点6为甘薯基因组DNA中对应于序列表中序列13的第334-345位的核苷酸；

位点7为甘薯基因组DNA中对应于序列表中序列13的第394-405位的核苷酸；

位点8为甘薯基因组DNA中对应于序列表中序列13的第855位的核苷酸。

上述应用中，所述基因组DNA可为叶绿体基因组DNA。

上述应用中，所述位点1的核苷酸可为T或C；

所述位点2的核苷酸可为A或C；

所述位点3的核苷酸可为TTT或缺失TTT；

所述位点4的核苷酸可为T或缺失T；

所述位点5的核苷酸可为AAAAAAA或AAAAAAAAA；

所述位点6的核苷酸可为TTTTTTTTTTTT或TTTTTTTTTT；

所述位点7的核苷酸可为TTTTTTTTTTTT或TTTTTTTTTTTTT；

所述位点8的核苷酸可为G或T。

上述应用中，所述甘薯单倍型可为单倍型H1、H6和H9，

单倍型H1的所述位点1的核苷酸为T，所述位点2的核苷酸为A，所述位点3的核苷酸缺失TTT，所述位点4的核苷酸缺失T，所述位点5的核苷酸为AAAAAAAAA，所述位点6的核苷酸为TTTTTTTTTTTT，所述位点7的核苷酸为TTTTTTTTTTTT，所述位点8的核苷酸为G；

单倍型H6的所述位点1的核苷酸为C，所述位点2的核苷酸为C，所述位点3的核苷酸为TTT，所述位点4的核苷酸缺失T，所述位点5的核苷酸为AAAAAAA，所述位点6的核苷酸为TTTTTTTTTT，所述位点7的核苷酸为TTTTTTTTTTTTT，所述位点8的核苷酸为T；

单倍型H9的所述位点1的核苷酸为C，所述位点2的核苷酸为C，所述位点3的核苷酸为TTT，所述位点4的核苷酸为T，所述位点5的核苷酸为AAAAAAA，所述位点6的核苷酸为TTTTTTTTTT，所述位点7的核苷酸为TTTTTTTTTTTTT，所述位点8的核苷酸为T。

本发明还提供了检测所述甘薯单倍型或其基因型的物质在制备甘薯母系溯源产品中的应用。

本发明还提供了检测所述甘薯单倍型或其基因型的物质在甘薯品种鉴定或制备甘薯品种鉴定产品中的应用。

本发明还提供了检测所述甘薯单倍型或其基因型的物质在甘薯育种或制备甘薯育种产品中的应用。

上述应用中，所述检测甘薯单倍型或其基因型的物质可为序列表中序列1-6所示的六条单链DNA组成的成套引物。

本发明还提供了甘薯母系溯源的方法，所述方法包括：检测两个待测甘薯的所述甘薯单倍型，根据所述甘薯单倍型的基因型确定两个待测甘薯是否有共同的母系来源，具有相同基因型的待测甘薯间具有或候选共同的母系来源，具有不同基因型的待测甘薯间不具有或候选不具有共同的母系来源。

上述方法中，检测待测甘薯的单倍型可采用序列表中序列1-6所示的六条单链DNA进行。

由序列表中序列1-6所示的六条单链DNA组成的成套引物，也属于本发明的保护范围。

本发明中，所检测甘薯可为鄂薯6号、鄂薯7号、浙薯13、烟薯29、冀薯99、徐薯25、商薯12、冀薯98、冀薯982、苏薯24和/或苏薯28，或这些甘薯的母系亲本，或以这些甘薯为母本的后代。

实验证明，本发明的甘薯单倍型以及配套成套引物可以对甘薯进行母系溯源和品种鉴定，且检测稳定可靠、简单快速，可用于甘薯品种鉴定和母系溯源，以及甘薯的育种，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1、检测甘薯单倍型的成套引物在甘薯母系溯源中的应用

本实施例发现了一组甘薯单倍型可以用于甘薯品种鉴定和母系溯源，该组甘薯单倍型共涉及甘薯叶绿体DNA的8个位点，即单倍型H1、H6、H9，具体如表1所示。

表1

表1中，“.”表示核苷酸的缺失。

表1中，位点1为甘薯叶绿体DNA对应于序列7的第250位的核苷酸，为T或C；

位点2为甘薯叶绿体DNA对应于序列12的第83位的核苷酸，为A或C；

位点3为甘薯叶绿体DNA对应于序列12的第94-96位的核苷酸，为TTT或缺失TTT；

位点4为甘薯叶绿体DNA对应于序列12的第97位的核苷酸，为T或缺失T；

位点5为甘薯叶绿体DNA对应于序列12的第188-194位的核苷酸，为AAAAAAA或AAAAAAAAA；

位点6为甘薯叶绿体DNA对应于序列13的第334-345位的核苷酸，为TTTTTTTTTTTT或TTTTTTTTTT；

位点7为甘薯叶绿体DNA对应于序列13的第394-405位的核苷酸，为TTTTTTTTTTTT或TTTTTTTTTTTTT；

位点8为甘薯叶绿体DNA对应于序列13的第855位的核苷酸，为G或T；

本实施例还提供了一种用于检测甘薯单倍型的成套引物为引物对A、引物对B和引物对C，各引物对的信息如表2所示。

表2、

表2中，F表示正向引物，R表示反向引物。

本实施例利用上述成套引物对甘薯进行了母系溯源，实验步骤如下：

1、实验材料

试验材料：

鄂薯6号。

鄂薯7号、浙薯13、烟薯29、冀薯99、徐薯25、商薯12。鄂薯7号的母本是浙薯13；徐薯25与商薯12的母本均是徐薯18；烟薯29母本是烟薯24，烟薯24的母本是冀薯21-2，冀薯99的母本是冀薯21-2。

冀薯98、冀薯982、苏薯24、苏薯28。冀薯98与冀薯982的母本均是Y-6。苏薯24与苏薯28的母本是南薯99。

苏薯24记载在“贾赵东,马佩勇,边小峰,等.2016.高产优质淀粉型甘薯新品种‘苏薯24号’的选育研究.中国农学通报,32(12):42-48.”一文中；

苏薯28记载在“马佩勇,贾赵东,边小峰,等.2016.甘薯新品种苏薯28的选育研究.江苏师范大学学报(自然科学版),34(3):35-39.”一文中；

鄂薯6号、鄂薯7号、冀薯98、冀薯982、徐薯18、商薯12记载在“赵路宽，苏一钧，戴习彬，等.2019.中国甘薯登记品种SSR标记遗传多样性分析.西北植物学报,39(7):1212-1220.”一文中；

浙薯13记载在“陈玲玲,曹如霞,徐舒,等.2020.甘薯块根在不同温度贮藏过程中游离糖及膳食纤维的变化.植物生理学报,56(4):871-878.”一文中；

烟薯29记载在“辛国胜,邱鹏飞,贾礼聪,等.2019.优质高淀粉型甘薯品种烟薯29号选育及品质特征和栽培要点.江苏师范大学学报(自然科学版),37(3):48-50.”一文中；

冀薯99记载在“王连军，雷剑，苏文瑾，等.2015.2005-2014年甘薯品种国家鉴定情况分析.湖北农业科学，54(12):2844-2849.”一文中；

徐薯25记载在“李秀英,马代夫,李洪民,等.2009.高淀粉多抗甘薯新品种徐薯25的选育及特性评价.植物遗传资源学报,10(2):309-313.”一文中；

南薯99记载在“罗凯,卢会翔,吴正丹,等.2016.中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析.中国农业科学,49(3):593-608.”一文中；

烟薯24记载在“辛国胜,林祖军,韩俊杰,等.2013.高产高淀粉甘薯新品种‘烟薯24号’选育及覆膜栽培技术研究.中国农学通报,29(21):72-77.”一文中；

冀薯21-2与烟薯29记载在“辛国胜,邱鹏飞,贾礼聪,等.2019.优质高淀粉型甘薯品种烟薯29号选育及品质特征和栽培要点.江苏师范大学学报(自然科学版),37(3):48-50.”一文中；

2、基因组DNA提取

提取步骤1各材料叶片的全基因组DNA，稀释到50-60ng/μl，置于-20℃的冰箱中保存备用。

3、PCR扩增

以各材料的基因组DNA为模板，利用上述成套引物进行PCR扩增，引物对A、B、C的PCR扩增体系均相同。

PCR扩增体系均如下：10×PAGE Buffer(Mg

PCR扩增程序均为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度下退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，在4℃条件下保存5min。

4、结果分析

对各材料所得PCR产物进行电泳，各PCR产物均为单一条带。对各PCR产物进行测序。

结果显示，鄂薯7号与浙薯13、烟薯29与冀薯99、徐薯25与商薯12的三个引物对的PCR产物的序列均相同，引物对A的PCR产物的序列均为序列表中序列8，引物对B的PCR产物的序列均为序列表中序列11，引物对C的PCR产物的序列均为序列表中序列14，即鄂薯7号与浙薯13、烟薯29与冀薯99、徐薯25、商薯12均为单倍型H6的纯合型，这六个材料有共同的母系来源，与各材料已知信息一致；

冀薯98、冀薯982的三个引物对的PCR产物的序列均相同，引物对A的PCR产物的序列均为序列表中序列9，引物对B的PCR产物的序列均为序列表中序列12，引物对C的PCR产物的序列均为序列表中序列15，即冀薯98、冀薯982均为单倍型H9的纯合型，这两个材料有共同的母系来源，与各材料已知信息一致；

苏薯24、苏薯28的三个引物对的PCR产物的序列均相同，引物对A的PCR产物的序列均为序列表中序列9，引物对B的PCR产物的序列均为序列表中序列12，引物对C的PCR产物的序列均为序列表中序列15，即苏薯24、苏薯28均为单倍型H9的纯合型，这两个材料有共同的母系来源，与各材料已知信息一致；

鄂薯6号的引物对A的PCR产物的序列均为序列表中序列7，引物对B的PCR产物的序列均为序列表中序列10，引物对C的PCR产物的序列均为序列表中序列13，为单倍型H1的纯合型，与其他材料的母系来源均不同，与各材料已知信息一致。

综上所述，本实施例的甘薯单倍型H1、H6、H9以及用于检测甘薯单倍型的成套引物可以用于甘薯的母系溯源。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> 检测甘薯单倍型的成套引物在甘薯母系溯源和品种鉴定中的应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

cgaaatcggt agacgctacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

atttgaactg gtgacacgag 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cgcgcatggt ggattcacaa tcc 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

tgcatggttc cttggtaact tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

cattacaaat gcgatgctct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

tctaccgatt tcgccatatc 20

<210> 7

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

cgaaatcggt agacgctacg gacttaattg gattgagcct tggtatggaa acttactaag 60

tgataacttt caaattcaga gaaaccctgg aattaaaaaa atgggcaatc ctgagccaaa 120

tcctgttttc cgaaaacaaa caaaagttca gaaaaaaagg ataggtgcag agactcaatg 180

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agttcaaat 849

<210> 8

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

cgaaatcggt agacgctacg gacttaattg gattgagcct tggtatggaa acttactaag 60

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