补骨脂酚在制备用于治疗急性心肌梗死后的药物中的应用

摘要

本发明涉及补骨脂酚在制备用于治疗急性心肌梗死后的药物中的应用。本发明证明了补骨脂酚能够抑制成纤维细胞的增殖、迁移和分化，改善心肌梗死后早期心肌纤维化和左心室重构，提升心脏射血分数和收缩能力，从而可改善心肌梗死后心功能障碍；提示了中药单体补骨脂酚可能是急性心肌梗死临床治疗的一种潜在治疗药物，其有望成为改善急诊心肌梗死患者心功能障碍的一种潜在治疗措施之一。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及补骨脂酚在制备用于治疗急性心肌梗死后的药物中的应用。

背景技术

心肌梗死已然是全球引起患者发生心功能障碍、继而发生心力衰竭和死亡的主要原因之一。心脏重构在应对心肌梗死损伤后结构的紊乱和维持心脏泵血功能上有着重要的作用。其中，在心脏重构的渐进过程中，心肌纤维化的严重程度与心力衰竭的进行性发展密切相关，可导致心脏的功能从代偿向失代偿发展。过度纤维化最后导致心力衰竭的发生发展；当前临床上尚无有效的减少或逆转心脏纤维化的药物。

在心脏遭受缺血损害发生心肌梗死后，心脏成纤维细胞在心肌纤维化的发展中起至关重要的作用。非梗死区的成纤维细胞此时会迁移至梗死区，替代坏死的心肌细胞以维持心脏结构的完整帮助心脏功能的代偿。在应对如化学、机械信号等多种信号的持续刺激时，心脏成纤维细胞将通过激活后的迁移、增殖和分化，实现对心脏功能的代偿以及对心脏结构的维持等作用。但是成纤维细胞这种持续的反应性过度增殖和分化会损害心脏代偿性的重构，同时，这样的不良行为会进一步导致心脏结构和功能的恶化。因此，降低梗死区成纤维细胞的过度迁移、增殖和分化，可以帮助改善不良的心脏重构，对心肌梗死后心脏功能的维持和提升有着重要作用。

补骨脂酚是一种从中药补骨脂中提取的有效成分，已经证实补骨脂酚可以改善离体心脏在缺血再灌注损伤中心肌细胞的线粒体氧化损伤，此外，该成分对主动脉缩窄手术诱导的病理性心肌肥厚和高糖诱导的糖尿病性心肌病皆可显著改善。但是，补骨脂酚对心肌梗死后的心脏功能和心肌纤维化的影响尚不清楚。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是补骨脂酚在制备用于治疗急性心肌梗死后的药物中的应用对补骨脂酚对心肌梗死后心脏重构的调控作用及其潜在机制进行了探讨。

本发明提供了补骨脂酚在制备用于治疗急性心肌梗死后的药物中的应用。

所述药物用于对心肌梗死后心脏功能的改善、心肌纤维化和不良心脏重构的保护。

所述药物包括补骨脂酚及药学上可用的辅料。

优选的，所述辅料包括填充剂、黏结剂、润滑剂、分散剂、助流剂、润湿剂、崩解剂、香料或色料。

所述药物的剂型为口服剂或注射剂。

优选的，所述口服剂的形式包括片剂、硬或软胶囊、锭剂、滴丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、口服液或糖浆剂。

优选的，所述注射剂的形式为：灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂或微囊。

本发明证明了补骨脂酚能够通过抑制成纤维细胞的增殖、迁移和分化，改善心肌梗死后心肌纤维化逆转左心室重构，并可改善心肌梗死后心功能障碍，提升心脏射血分数和收缩能力，提示其可能是治疗临床心肌梗死后心脏重构、心功能障碍的一种潜在的策略。

附图说明

图1为心肌梗死后补骨脂酚连续治疗7天后超声心动图；其中，

A：补骨脂酚连续治疗7天后的各组超声心动图的代表性图片；B：左心室短轴缩短率(LVFS)的柱状统计图；C：左心室射血分数(LVEF)的柱状统计图。

图2为心肌梗死后补骨脂酚连续治疗第28天的超声心动图；其中，A：补骨脂酚治疗第28天的各组超声心动图的代表性图片；B：左心室短轴缩短率的柱状统计图；C：左心室射血分数的柱状统计图。

图3为心肌梗死后补骨脂酚连续治疗不同时间点的马松染色结果分析；其中，A：马松染色图片，左：20倍放大，右：200倍放大；B：左心室纤维化比例；C：左心室室壁厚度。

图4为心肌梗死后补骨脂酚连续治疗第7天心肌细胞结构和功能相关基因表达；其中，A：梗死区基因表达；B：非梗死区基因表达。

图5为心肌梗死后补骨脂酚连续治疗第7天成纤维细胞分化及相关基因表达；其中，A：梗死区基因表达；B：非梗死区基因表达；C：梗死区免疫荧光染色(放大400倍)；D：肌成纤维细胞定量。

图6为补骨脂酚治疗对异丙肾上腺素诱导的原代成纤维细胞增殖和迁移的影响；其中A：补骨脂酚对原代成纤维细胞细胞活性影响；B：不同浓度补骨脂酚对异丙肾上腺素(ISO，20μM)诱导的原代成纤维细胞的细胞活性影响；C：transwell小室实验(200倍放大)；D：成纤维细胞transwell小室实验迁移率柱状图。

图7为补骨脂酚治疗对TGF-β1(5ng/mL)诱导的原代成纤维细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.实验分组

将实验小鼠随机分成4组，分别为(1)假手术组：实施假手术并给予安慰剂(5％羧甲基纤维素钠)灌胃治疗；(2)假手术+药物组：实施假手术并给予60mg/kg/day的补骨脂酚灌胃治疗；(3)手术组：实施手术并给予安慰剂灌胃治疗；(4)手术+药物组：实施手术并给予60mg/kg/day的补骨脂酚灌胃治疗。以上四组部分小鼠按照实验要求连续灌胃给药7天后行超声心动图后取材并进行下一步实验，部分小鼠按照实验要求灌胃至28天后行超声心动图检测后取材并进行下一步实验。

2.实验结果

(1)补骨脂酚改善心肌梗死后第7天小鼠心脏功能

在心肌梗死模型建立后，连续灌胃治疗7天，然后对各实验组进行超声心动图检测，结果显示(表1，图1)，在术后第7天，手术组心脏功能指标与假手术组相比较，以下指标皆显著恶化(P＜0.05)：LVEF，LVFS，IVSs，IVSd，LVEDV，LVESV，LVIDd和LVIDs等。经过给予补骨脂酚灌胃治疗7天后，手术+药物组与手术组比较，其LVFS和LVEF皆有显著的改善(P＜0.05)。其余指标：IVSs，IVSd，LVEDV，LVESV，LVIDd和LVIDs等，超声心动图结果显示有改善趋势。

注：N＝4-10/组，*与假手术组的结果比较，#与手术组的结果比较。

(2)补骨脂酚改善心肌梗死后第28天小鼠心脏功能

在心肌梗死模型建立后，给予各组实验小鼠连续灌胃治疗28天后对它们的心脏功能及结构进行超声心动图检测。检测结果显示(表2，图2)，心肌梗死术后第28天手术组与假手术组比较，心脏功能指标：LVEF，LVFS，IVSs，IVSd，LVEDV，LVESV，LVIDd，LVIDs，LVPWd和LVPWs皆显著恶化(P＜0.05)。给予心肌梗死模型补骨脂酚灌胃治疗28天后，手术+药物组的LVEF(P＜0.05)和LVESV(P＜0.05)较手术组有显著改善；其他的指标：LVFS，IVSs，IVSd，LVEDV，LVIDd，LVIDs，LVPWd和LVPWs等，超声心动图结果显示有改善的趋势。

注：N＝4-10/组，*与假手术组的结果比较，#与手术组的结果比较。

(3)补骨脂酚治疗降低心肌梗死后左心室纤维化并改善室壁厚度

通过马松染色检测左心室心肌纤维化水平和左心室室壁厚度(图3)。使用Image J软件测量心肌梗死后第7天心脏组织的纤维化面积，数据结果显示，与假手术组相比较，手术组的左心室纤维化面积显著扩大(P＜0.01)。使用补骨脂酚灌胃治疗后的第7天、第28天的心脏组织切片染色结果中，与手术组比较，手术+药物组的左心室纤维化水平皆显著降低(分别P＜0.05，P＜0.01)。此外，同时使用Image J软件测量在心肌梗死后第7天心脏组织的左心室室壁厚度。心肌梗死手术后，手术组的左心室室壁厚度与假手术组相比显著变薄(P＜0.001)，使用补骨脂酚治疗后第7天、第28天的心脏组织切片染色结果显示，与手术组比较，补骨脂酚治疗后皆可显著改善左心室室壁厚度(分别P＜0.001，P＜0.01)。

(4)补骨脂酚治疗对心肌细胞结构和功能有关的基因表达的影响

分析了心肌梗死后第7天心肌细胞结构和功能有关的基因的表达情况(图4)，包括心肌细胞收缩功能相关的α-MHC和β-MHC，以及心脏超负荷时牵张刺激心肌细胞产生的ANP和BNP。实验结果显示，心肌梗死后，梗死区和非梗死区中β-MHC，ANP和BNP基因表达在心肌梗死后都明显上调，同时α-MHC基因表达水平明显降低。使用补骨脂酚治疗后，在梗死区的组织样本中β-MHC(P＜0.05)和BNP(P＜0.01)的基因表达显著降低(图4A)。在非梗死区中的α-MHC(P＜0.01)和ANP(P＜0.05)的基因表达水平经补骨脂酚治疗后得到显著改善(图4B)。

(5)补骨脂酚对心肌梗死后纤维化相关基因表达水平的影响

检测了在心肌梗死后第7天，梗死区一些常见的基因表达，发现TGF-β1和ERK2基因表达水平较假手术组显著上调，使用补骨脂酚治疗7天后可显著降低心肌梗死后梗死区TGF-β1(P＜0.01)和ERK2(P＜0.01)的基因表达(图5A、B)。

在心脏中除了心肌细胞外，还有其他重要的细胞，如成纤维细胞参与修复心肌梗死后的心脏结构和功能的完整性。检测肌成纤维细胞分化相关基因α-SMA和fibronectin的表达水平，发现两者在心肌梗死后会明显上调；补骨脂酚使得fibronectin的基因表达水平在梗死区和非梗死区都有明显的下降趋势。

(6)补骨脂酚影响梗死区肌成纤维细胞的分化

为进一步探究心脏梗死区肌成纤维细胞分化情况是否受到补骨脂酚治疗的影响，对组织切片进行了vimentin(VIM，成纤维细胞标志物)和α-SMA(肌成纤维细胞分化相关的标志物)免疫荧光染色(图5C、D)，以便于观察肌成纤维细胞的分化情况。肌成纤维细胞的分化比例定义为α-SMA(+)VIM(+)的细胞数/VIM(+)的细胞数，以此代表心脏肌成纤维细胞分化水平。免疫荧光染色结果显示，心肌梗死后第7天肌成纤维细胞分化水平在梗死区显著升高，经过补骨脂酚治疗后，肌成纤维细胞分化水平显著降低。综上所述，补骨脂酚的治疗可以显著抑制心肌梗死后第7天时心脏肌成纤维细胞的分化。

(7)补骨脂酚改善异丙肾上腺素诱导的原代成纤维细胞的增殖和迁移

根据上述体内实验结果可以推测，心脏成纤维细胞在补骨脂酚改善梗死后心肌纤维化的过程中起着重要作用，在体外实验中，分离实验小鼠原代心脏成纤维细胞对补骨脂酚的作用进行进一步研究。

补骨脂酚药物毒性试验中，使用CCK8检测成纤维细胞增殖发现(图6A)，补骨脂酚在以下浓度1μM，2.5μM，5μM，7.5μM中对成纤维细胞的增殖能力没有发生显著改变。原代成纤维细胞被异丙肾上腺素(20μM)刺激24小时后，增殖能力可发生显著上调(图6B)，使用不同浓度补骨脂酚治疗24小时后可以显著抑制异丙肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞增殖水平的上调。

另外，通过检测成纤维细胞的迁移数目来检测其迁移能力，实验结果显示(图6C、D)，补骨脂酚(1μM)干预24小时可显著抑制异丙肾上腺素诱导的成纤维细胞迁移能力的上调，同时补骨脂酚对基础状态的成纤维细胞的迁移能力也会产生了显著的抑制作用。

同时使用转化生长因子TGF-β1(5ng/mL)刺激心脏成纤维细胞的增殖，也发现补骨脂酚(7.5μM)可显著抑制其诱导的成纤维细胞增殖(图7)。

3.结论

本发明证明了补骨脂酚能够通过抑制成纤维细胞的增殖、迁移和分化，改善急性心肌梗死后心肌纤维化逆转左心室重构，提升心脏射血分数和收缩能力，并可改善心肌梗死后心功能障碍，提示了中药单体补骨脂酚可能是急性心肌梗死临床治疗的一种潜在治疗药物，有望成为改善急诊心肌梗死患者心功能障碍的一种潜在治疗措施之一。