基于代谢组学的补骨脂安全性评价及补骨脂酚的体内代谢研究

摘要

目的：采用超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱（UPLC-PDA-Q-TOF-MS）仪器，利用其高分离性、高分辨率的特点，对中药补骨脂成份进行快速定性分析，在化学层面上为探究补骨脂药效及毒性机制奠定物质基础；采用基于UPLC-Q-TOF-MS代谢组学的方法，研究补骨脂醇提物和水提物连续灌胃2周后，对大鼠血清内源性代谢产物的影响，寻找并鉴定差异性代谢物，并结合其对大鼠血常规、血生化的影响及病理检测结果，从分子层面上为阐释补骨脂的药效和毒性机制提供依据；采用UPLC-PDA-Q-TOF-MS仪器，测定大鼠灌胃给予补骨脂酚后血浆、胆汁、尿液和粪便中代谢产物，并探讨补骨脂酚主要代谢产物血浆动力学特征，通过研究补骨脂酚体内代谢物谱及其代谢特点，从药物体内代谢层面上为研究补骨脂酚体内代谢产物的安全性奠定物质基础。
　　方法：①补骨脂采用70％乙醇渗漉提取，经过滤后，采用旋蒸仪浓缩，真空冷冻干燥。分别称取少量样品，甲醇溶解，过滤膜后，UPLC-PDA-Q-TOF-MS进样分析。②雄性SD大鼠分为4组，每组6只，分别给予补骨脂醇提物、补骨脂水提物0.54，1.08和1.62 g·kg-1，每天1次，连续给药2周，末次给药后，禁食24h，采集全血、血清及心、肝、肾等组织。采用自动血常规分析仪获得血常规结果，采用自动血生化仪获得血生化结果，采用HE染色切片观察获取其组织病理结果，应用超高效液相色谱/四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析血清样品，MassLynx采集并处理数据，采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法，分析各组大鼠血清内源性代谢产物的差别，通过正交偏最小二乘法（OPLS-DA）、变量重要程度（VIP）筛选潜在生物标志物并测定其相对含量。③16只雄性SD大鼠适应一周后，随机分成3组，即尿液和粪便收集组、血浆收集组、胆汁收集组。尿液和粪便收集组给药前开始24h在代谢笼中适应，先采用代谢笼收集12 h的空白尿液与粪便，给药前24h禁食。给予补骨脂酚（500 mg·kg-1）后自由饮水，并立即开始收集尿液和粪便，收集24h粪便和尿液；胆汁收集组给药前12h禁食。大鼠分成两组，采用PE-10导管总胆管插管，一组给予空白溶媒，另一组给予补骨脂酚（500 mg·kg-1），收集24h胆汁；血液采集组给药前12 h禁食，给予补骨脂酚（500 mg·kg-1），分别于给药前，给药后0.5、1、2、4、8、12、24 h眼眶取血。所有样品经处理后，UPLC-PDA-Q-TOF-MS进样分析，利用Metabolynx4.0软件和质量亏损（MDF）技术等方法寻找代谢物，通过比对补骨脂酚和代谢产物的准确分子量、二级质谱碎片和紫外吸收，确定未知代谢产物的结构。
　　结果：①从紫外图谱中看出有14种成分的含量较高，选择14种成分进行二级质谱分析，通过比对对照品及文献中的一级和二级质谱数据、色谱保留顺序等，推测出12个化学成分的结构，它们分别是补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂黄酮、补骨脂定、补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查尔酮等和补骨脂酚等。②连续给予补骨脂醇提物（EEFP）2周后，与空白组相比，给药两周后，血常规中白细胞（WBC）、单核细胞（MON）和中性粒细胞(NEUT)呈剂量依赖性上升趋势，与空白组比较，高剂量组具有显著性差异；血小板（PLT）和血小板压积（PCT）呈剂量依赖性下降趋势，与空白组比较，高剂量组具有显著性差异。血生化中谷丙转氨酶（ALT）呈剂量依赖性上升趋势，与空白组比较，高剂量组具有显著性差异；肌酐（CRE）呈剂量依赖性上升趋势，与空白组比较，高剂量组具有显著性差异。病理组织结果中，正常对照组肝组织结构完整，清晰，细胞形态规则，未见水肿、凋亡、坏死及炎性细胞，EEFP（1.08g/kg)和EEFP（1.62g/kg）组肝脏组织可见部分肝细胞坏死，炎症浸润，其中以EEFP（1.62g/kg）组坏死最为明显；心脏和肾脏均未见有明显的变化。通过基于UPLC-Q-TOF-MS的血清代谢组学分析，共鉴定出10种差异性代谢物，它们分别是溶血磷脂酰胆碱（LysoPC(20:4)）、甘油磷脂（PGP(18:1/22:6)）、磷脂（PC(14:1/20:5)、PC(14:1/16:1)、PC(22:2/18:1)）、磷脂酰乙醇胺（PE(22:1/18:1)）、肌酐二磷酸（IDP）、对甲酚（p-Cresol）、对甲酚硫酸盐（p-Cresol sulfate）和抗坏血酸（Ascorbic acid），与空白对照组比较，各EEFP给药组中溶血磷脂酰胆碱（LysoPC(20:4)）、甘油磷脂（PGP(18:1/22:6)）含量呈升高趋势，磷脂（PC(14:1/20:5)、PC(14:1/16:1)、PC(22:2/18:1)）、磷脂酰乙醇胺（PE(22:1/18:1)）、肌酐二磷酸（IDP）、对甲酚（p-Cresol）、对甲酚硫酸盐（p-Cresol sulfate）和抗坏血酸（Ascorbic acid）呈下降趋势。③连续给予补骨脂水提物2周后，与空白组相比，白细胞（WBC）含量呈剂量依赖性上升趋势但无显著性差异；血小板（PLT）和血小板容积（PCT）含量呈下降趋势，其中中剂量组（1.08 g/kg）下降较为明显；淋巴细胞（LYM）、单核细胞（MON）以及中性粒细胞（NEUT）含量呈剂量依赖性上升趋势，其中中剂量组（1.08 g/kg）和高剂量组（1.62 g/kg）上升较为明显；谷草转氨酶（AST）以及尿素（UREA）含量呈剂量依赖性下降趋势，其中中剂量组（1.08 g/kg）和高剂量组（1.62 g/kg）下降较为明显。通过代谢组学方法，初步筛选出5种生物标志物，它们分别是吲哚、L-苯丙氨酸、植物鞘氨醇、乳酸和芽子碱甲，与空白组相比，各给药组吲哚、L-苯丙氨酸和植物鞘氨醇含量呈上升趋势，乳酸和芽子碱甲酯含量呈下降趋势。④通过对给予补骨脂酚大鼠血浆、尿液、胆汁和粪便的分析，共鉴定出11种补骨脂酚的体内代谢产物（M1-11)，血浆中存在6种，胆汁中存在10种，尿液中存在8种，粪便中存在2种，它们主要是补骨脂酚的氧化、羟基化、甲基化、O-葡萄糖醛酸化结合以及O-硫酸化结合产物，血浆中M1和M5的动力学结果显示，M1的含量在给药后12h后达到峰值，其稳态一直维持到给药后24h，而M5的量在给药后4h达峰值，然后缓慢下降。
　　结论：①本实验采用超高效夜相-四级杆-串联飞行时间质谱联用技术实现了对补骨脂醇提物中多成分的快速定性分析，鉴定出12种成分，它们分别是香豆素类如补骨脂素、异补骨脂素，黄酮类如补骨脂黄酮等，查尔酮类如异补骨脂查尔酮等，以及单萜类如补骨脂酚。②补骨脂醇提物给药2周后，血常规、血生化以及肝脏组织病理学结果表明，长期大剂量服用补骨脂醇提物会引起肝损伤；血清代谢组学结果显示，10种内源性物质发生明显改变，提示其与补骨脂醇提物肝毒性相关，为潜在毒性标志物，通过对各物质代谢通路分析，其分析结果与传统药理学的血常规、血生化检测和病理组织结果基本一致。③补骨脂水提物给药2周后，血常规、血生化的结果表明，补骨脂具有明显的抗凝血作用和提高肾功能作用以及潜在的毒性；血清代谢组学结果显示，5种内源性物质发生显著改变，各物质代谢通路分析结果表明，补骨脂水提物发挥药效和毒性的机制可能是通过调节氨基酸代谢、磷脂代谢以及糖酵解过程来实现的。④在本研究中，UPLC/ESI-PDA-QTOF-MS联合MetaboLynx XS软件及MDF技术被成功用于识别补骨脂酚在大鼠血浆、胆汁、尿和粪便中的代谢物。共鉴定出11种代谢产物，初步确定其体内可能的代谢途径，并对补骨脂酚血浆中主要代谢物M1和M5进行了动力学的研究。在11种代谢产物中，氧化产物和葡萄糖醛酸化产物（M1，2，5）为骨脂酚体内的主要代谢产物，M1主要存在于血清和尿中，M2主要存在于尿和胆汁中，M5主要存在于胆汁和血清中。M1在血浆中表现出明显的蓄积效应。本研究从药物体内代谢层面上为研究补骨脂酚体内代谢产物的安全性奠定物质基础。

目录

声明

前言

第一章 UPLC/PDA-Q-TOF-MS 分析补骨脂中化学成分

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 基于UPLC/QTOF-MS技术的补骨脂醇提物对大鼠血浆代谢组学研究

1 实验材料与仪器

2 试验方法

3 结果

4 讨论

第三章 基于UPLC/QTOF-MS技术的补骨脂水提物对大鼠血浆代谢组学研究

1 实验材料与仪器

2 试验方法

3 结果

4 讨论

第四章 基于UPLC-PDA-QTOF/MS 技术研究补骨脂酚在大鼠体内代谢形式

1 实验材料与仪器

2 试验方法

3 实验结果

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士期间主要的学术成果